1. Materiały i metody
1.6. Metody przedstawiania i analizy wyników testu Amesa
Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane za pomocą pakietu statystycznego
Statistica 7.1, udostępnionego przez Instytut Matematyki i Informatyki Politechniki
Wrocławskiej w celu wykorzystania w działalności badawczej.
1.6.1. Opisywanie danych wyników własnych
Do opisania uzyskanych testem Amesa wyników zastosowano podstawową statystykę opisową. Wyznaczono wartości średnie, medianę, odchylenie standardowe, rangę oraz wartości minimalne, maksymalne i współczynnik zmienności (CV).
Miary połoŜenia, z których najwaŜniejszą jest średnia arytmetyczna oraz mediana, charakteryzują średni lub typowy poziom wartości danej cechy, wokół których skupiają się wszystkie pozostałe wartości analizowanej cechy. ZaleŜność pomiędzy wartością średnią a medianą pozwala nam na stwierdzenie, czy rozkład jest symetryczny (wartość mediany bliska wartości średniej), lewostronnie asymetryczny (wartość mediany większa od wartości
Odchylenie standardowe jest to pierwiastek kwadratowy z wariancji. Stanowi miarę zróŜnicowania o mianie zgodnym z mianem badanej cechy i określa przeciętne zróŜnicowanie poszczególnych wartości cechy od średniej arytmetycznej. Natomiast rozstęp (ranga) jest to róŜnica pomiędzy wartością maksymalną a minimalną cechy i jest miarą charakteryzującą empiryczny obszar zmienności badanej cechy (nie daje on jednak informacji o zróŜnicowaniu poszczególnych wartości cechy w zbiorowości). Współczynnik zmienności - jest ilorazem bezwzględnej mary zmienności cechy i średniej wartości tej cechy (np. odchylenie standardowe do wartości średniej), jest wielkością niemianowaną, najczęściej podawaną w procentach. Współczynnik zmienności stosuje się w porównaniach zróŜnicowania kilku próbek pod względem tej samej cechy.
1.6.2. Rozkład prawdopodobieństwa rezultatów testów Amesa
Dane z testu Amesa mogą mieć rozkład normalny, Poissona lub uogólniony rozkład Poissona (GP1, GP2). Czasami Ŝaden z zaproponowanych w literaturze rozkładów nie ma zastosowania do uzyskanych wyników, dlatego teŜ w pracy ograniczono się do analizy załoŜenia o rozkładzie normalnym danych. ZałoŜenie o rozkładzie normalnym danych zweryfikowano za pomocą testów normalności: Shapiro-Wilka, Lillieforsa oraz Kołmogorowa-Smirnowa. W przypadku powyŜszych testów, jeśli obserwowana wartość p jest większa od poziomu istotności α = 0,05 wtedy moŜna wnioskować, Ŝe nie ma podstaw do odrzucenia hipotezy o tym, Ŝe dane pochodzą z populacji o rozkładzie normalnym. Jeśli natomiast wartość p jest mniejsza od poziomu istotności α = 0,05, wówczas na poziomie istotności 0,05 naleŜy odrzucić hipotezę o normalności rozkładu danych.
1.6.3. Charakter krzywej zaleŜności dawka-odpowiedź wyników testów Amesa Uzyskane testem Amesa wyniki przedstawiono w postaci krzywej zaleŜności dawka -odpowiedź wykorzystując wykresy ramka-wąsy, które obrazują wartość średnią (środkowy punkt), błąd względny (szerokość „pudełka”) oraz odchylenia standardowego SD (szerokość „wąsów”). Błąd względny, oznaczany zazwyczaj jako SE, to pierwiastek z wariancji podzielonej przez liczebność próbki.
1.6.4. Obliczanie współczynnika mutagenności (MR)
Współczynnik mutagenności MR obliczany jest według poniŜszego równania [126]:
s
l
r
l
MR
i=
, gdzie:-
lr
– średnia liczba rewertantów szczepu testowego S. typhimurium indukowanych przez czynniki mutagenne zawarte w dawce (zatęŜeniu/stęŜeniu) d i osiąga wartość opisaną wzorem:∑
==
k k i ilr
k
r
l 1
,-
ls
- średnia liczba rewertantów spontanicznych szczepu testowego S. typhimurium i obliczana jest na podstawie wzoru:∑
=
=
k k i ils
k
s
l 1
Za wynik pozytywny dla danej próbki wody uznaje się kaŜdy przypadek, gdy współczynnik mutagenności MR jest większy bądź równy 2,0 [125].
1.6.5. Wyznaczanie mutagenności M wody (l. rew/dm3)
Przy obliczaniu mutagenności M określanej jako l.rew. w 1 dm3 badanej próbki ograniczono się do analizowania wyników pochodzących z początkowej części krzywej dawka-odpowiedź. Takie załoŜenie zostało poczynione na podstawie doniesień literaturowych i własnych doświadczeń, poniewaŜ test Amesa jest testem określającym mutagenność badanej próby, w który pomija się efekt toksyczności.
Na podstawie Bernstein, MielŜyńska [127, 134] i własnych doświadczeń [125, 126] ocenę dopasowania otrzymanych wyników do załoŜonego modelu liniowej zaleŜności dawka-odpowiedź przeprowadzono metodą najmniejszych kwadratów, wykorzystując analizę regresji liniowej. W oparciu o parametry równania obliczano przewidywaną liczbę kolonii rewertantów indukowanych przez zanieczyszczenia znajdujące się w 1 dm3 badanej wody. Badania prowadzono przy uŜyciu programu komputerowego OriginPro 7,5.
Przy załoŜeniu, Ŝe krzywa zaleŜności dawka-odpowiedź jest liniowa i kwestia wykrywania punktu zmiany (momentu, w którym zatęŜenie/stęŜenie/dawka zaczyna działać toksycznie) jest nieistotna to oczekiwana liczba rewertantów w zaleŜności od d ma postać:
E(N)=βo+β1*d.
Opierając się na modelu prostej regresji liniowej estymowano wartości współczynników
natomiast wartość estymatora współczynnika β1 określa o ile wzrośnie liczba rewertantów indukowanych, jeŜeli zatęŜenie/stęŜenie (dawka) wzrośnie o jeden poziom. Aby była moŜliwość wyznaczenia wartości powyŜszych estymatorów naleŜało wyznaczyć jaki rozkład prawdopodobieństwa ma zmienna N, określająca liczbę rewertantów.
W celu wyboru sposobu odrzucania wyników, pochodzących z tych zatęŜeń/ stęŜeń (dawek) próbki, które są toksyczne wykorzystano test zaproponowany przez Bernstein i in. [134], oparty na metodzie maksymalnego prawdopodobieństwa (MLEs), która sugeruje schemat postępowania dotyczący dopasowywania prostej regresji do wszystkich dostępnych -d- zatęŜeń/stęŜeń (dawek): jeśli współczynnik przy zmiennej d - jest ujemny, wtedy naleŜy odrzucić kolejne wyniki, począwszy od najwyŜszych zatęŜeń/steŜeń (dawek) aŜ do momentu kiedy wartość współczynnika b1 będzie dodatnia. Przy załoŜeniu, Ŝe pozostało r poziomów zatęŜeń naleŜy dopasować prostą regresji do tych danych i określić średnią liczbę rewertantów dla zatęŜenia/stęŜenia (dawki) na poziomie r (Nr). Następnie odrzucić pomiary dla zatęŜenia r ze zbioru danych i dopasować jeszcze raz prostą regresji. Dla tak określonej regresji naleŜy wyznaczyć oczekiwaną liczbę rewertantów dla zatęŜenia na poziomie r jako Nr-1. Jeśli Nr >= Nr-1 to wówczas naleŜy przyjąć, Ŝe zatęŜenie na poziomie r nie jest zatęŜeniem toksycznym i nie naleŜy go wyrzucać ze zbioru danych. W przeciwnym wypadku naleŜy przeprowadzić odpowiedni test, który pozwoli określić, czy zatęŜenia na poziomie r jest toksyczne czy mutagenne.
1.7. Fiński model do prognozowania potencjalnej mutagenności mikrozanieczyszczeń wody – załoŜenia [21]
Przewidywana modelem mutagenność wody przedstawiona została jako liczba rewertantów indukowanych przez mikrozanieczyszczenia znajdujące się w 1 dm3 wody. Określana jest przez funkcję zapisaną w następującej postaci:
f = A*( 1- e – k*c ) l. rew./dm3
gdzie:
• f - oznacza mutagenność wody do picia ,
• A i k - stałe wynoszące odpowiednio: 4000 i 0,054,
• c - jest definiowane jako:
c = [OWO] * [Cl2] * (1 – NH3 )2 mg/dm3
gdzie:
• NH3 (*) - stęŜenie amoniaku, mg/dm3,
• Cl2 - dawka chloru, mg/dm3.
(*) – stęŜenie amoniaku uŜyte w części doświadczalnej i obliczeniowej pracy przeliczono i przedstawiono jako azot amonowy w mgNH4+/dm3, niezgodnie z weryfikowanym modelem, ale według ogólnie przyjętej nomenklatury.
ZałoŜenie dodatkowe do modelu:
JeŜeli w trakcie procesu uzdatniania do wody jest dodawany dwukrotnie chlor to: f = f R + f D
gdzie:
• R - dotyczy parametrów wody surowej (tzw. wstępne chlorowanie),
• D - dotyczy parametrów wody do picia wody oczyszczonej (tzw. właściwe chlorowanie).