5.1. CHARAKTERYSTYKA GRUPY BADANEJ
Badana grupa składała się tylko z osób dorosłych (najmłodszy badany miał 18 lat, najstarszy 82). Do badań zakwalifikowano 160 pacjentów z rozpoznaną chorobą
Leśniowskiego-Crohna. Wszyscy byli poddani analizie typu multilocus, czyli kaŜdego z badanych przeanalizowano w zakresie 10 zmian polimorficznych typu SNP (ang. single nucleotide polymorphism) obecnych w genomie. Wszyscy chorzy - 80 kobiet i 80 męŜczyzn - wyrazili zgodę na udział w projekcie badawczym. Do porównywania wyników uŜyto odpowiednio dobranej grupy populacyjnej w ilości od 100 do 150 osób (zawsze po równo kobiet i męŜczyzn).
Pacjenci, którzy wzięli udział w badaniu, byli pod opieką Katedry i Kliniki Gastroenterologii, śywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. W większości pochodzili z obszarów Wielkopolski. Chętnie brali udział w projekcie badawczym, gdyŜ obejmował ich dodatkową opieką, dawał moŜliwość bezpłatnego wykonania szeregu badań, które nie są standardowo wykonywane w ramach oddziałów szpitalnych. Wielu z nich prosiło takŜe o objęcie programem ich bliskich, zwłaszcza dzieci. W ten sposób objęliśmy programem badawczym całe rodziny i nadal tworzymy rodzinny bank DNA pacjentów dotkniętych ChLC. W ramach niniejszego opracowania zaprezentowane zostały jednak tylko wyniki uzyskane dla zdiagnozowanych pacjentów z ChLC. Analizę rodzin chorych planujemy wykonać w ramach innego projektu.
Mam jednocześnie nadzieję, Ŝe prowadząc badania o tak szerokim zakresie analizowanych czynników choć w niewielkim stopniu przyczynię się do poprawy jakości Ŝycia Naszych Pacjentów. Często wykazują oni chęć uzyskania wiedzy na temat wariantów genetycznych, których są nosicielami. Chcą mieć świadomość, jaki wariant – ryzykowny czy ochronny – noszą ich dzieci, aby móc w odpowiednim momencie zareagować i nie przeoczyć pierwszych objawów. Pacjenci zawsze byli informowani o tym, Ŝe badania genetyczne na dzien dzisiejszy nie mogą stanowić
jednoznacznej diagnozy i, jako Ŝe są badaniami naukowymi, nie mogą być
traktowane jako badanie diagnostyczne, ale w znakomitej większości zawsze wyraŜali chęć wzięcia w nich udziału. Sądzę, Ŝe taka postawa Naszych Pacjentów
42 jest takŜe wskaźnikiem tego, Ŝe świadomość chorych w ostatnich latach znacząco wzrosła i Ŝe w niedalekiej przyszłości badania genetyczne będą jednymi z tych, których chorzy będą oczekiwać od prowadzących ich lekarzy. Mam zatem nadzieję,
Ŝe niniejszy projekt będzie swoistym początkiem współpracy, która przyniesie wymierne korzyści nie tylko dla nauki, ale, a moŜe zwłaszcza, dla samych pacjentów.
5.2. MOLEKULARNE METODY BADAWCZE
Z pacjentami zostały przeprowadzone szczegółowe wywiady lekarskie dotyczący objawów choroby, zarówno tych z obszaru przewodu pokarmowego jak i spoza niego. U kaŜdego chorego aktywność choroby oceniono za pomocą CDAI (ang. Crohn Disease Activity Index). Od kaŜdego z badanych pacjentów została pobrana krew do szerokiego spektrum badań laboratoryjnych oraz badań
genetycznych, które przeprowadzono w Instytucie Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu. Do badań wykorzystano najnowsze metody diagnostyczne, w tym jeden z nielicznych w Polsce sprzęt do pirosekwencjonowania. Ponadto, wszystkie dane zostały przeanalizowane statystycznie.
Wszyscy byli poddani analizie typu multilocus, czyli kaŜdego z badanych przeanalizowano w zakresie 10 zmian polimorficznych typu SNP (ang. single nucleotide polymorphism) obecnych w genomie. Dla grupy około 60 chorych nie udało się zebrać szczegółowego wywiadu lekarskiego wystarczającego kryteriom postawionym temu projektowi badawczemu, i dlatego zostali oni włączeni tylko do analizy genetycznej. Pozostała grupa została poddana analizie genetycznej w porównaniu z konkretnymi objawami klinicznymi choroby, zastosowanym leczeniem itp. Wszyscy badani wyrazili zgodę na udział w projekcie badawczym, wielu do dziś
pozostaje z nami w stałym kontakcie i zgłasza się na ochotników do kolejnych projektów. Dowodzi to duŜego zainteresowaniu chorych tą problematyką, chęci pogłebiania przez nich wiedzy na temat własnego organizmu i choroby, która ich dotknęła. Rodzi to nadzieję, Ŝe w niedalekiej przyszłości badania genetyczne będą
wykonywane rutynowo, takŜe na wyraźne Ŝyczenie i zapotrzebowanie samych chorych. To dla nich bowiem i dla ich rodzin powstał ten projekt, mający na celu
43 przyczynić się do poprawienia diagnostyki i przewidywania przebiegu choroby pacjentów poznańskich szpitali i ich dzieci.
5.2.a. IZOLACJA WYOKOCZĄSTECZKOWEGO DNA Z KRWI
Badania genetyczne zaplanowane dla tego projektu naukowego zostały przeprowadzone na DNA (kwas deoksyrybonukleinowy) izolowanym z leukocytów krwi obwodowej pacjentów zakwalifikowanych do badań w Katedrze i Klinice Gastroenterologii, śywienia Człowieka i Chorób Wewnętrznych Uniwersytetu Medycznego im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. DNA zostało równieŜ
wyizolowane od osób stanowiących grupę porównawczą dla otrzymanych rezultatów. Głównym celem izolacji jest otrzymanie wysokocząsteczkowych izolatów DNA o maksymalnej czystości. Izolacja powinna być przeprowadzona tak, aby w miarę
moŜliwości oczyścić preparat z białek oraz inhibitorów enzymów, które w późniejszych etapach pracy z materiałem genetycznym mogą zakłócać wyniki. Krew pobierana jest do probówki z EDTA (ang. EthyleneDiamineTetraaceticAcid - kwas etylenodiaminotetraoctowy), chelator dwuwartościowych jonów wapnia, co zapobiega pozaustrojowemu krzepnięciu krwi.
Wybrano metodę izolacji DNA z zastosowaniem izotiocyjanianu guanidyny (GTC), (Słomski i wsp. 2008). Do wykonania pełnych badań tą metodą wystarcza juŜ
1 ml krwi, ale badanie dla kaŜdego pacjenta wykonywano z 5 ml krwi obwodowej, zapewniając sobie tym samym wysokie stęŜenie preparatu wystarczające na szereg analiz.
Izolacja została przeprowadzona według następującego schematu (Słomski i wsp. 2008).
1. Pobrać krew obwodową w ilości 5 ml na 50 µl 10% EDTA (stęŜenie końcowe 0,1 %).
2. Dodać 25 ml buforu do lizy (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA, pH 7,4). Mieszać, inkubować na lodzie przez 30 minut. Bufor do lizy (1000 ml): 8,28 g NH4Cl, !g KHCO3, 0,034g EDTA, pH 7,4)
44 3. Wirować w wirówce Srovall RT6000B: 2500 rpm, 15 min, 4 st. C
4. Odrzucić supernatant.
5. Osad zawiesić w 500 ul buforu do lizy, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze 0 st. C przez 10 minut.
6. Dodać 2 ml GTC (4M izotiocyjanian guanidyny, 34 mM cytrynian sodu, 0,5% sarkosyl, 0,78% 2-merkaptoetanol, pH 7,0), dokładnie wymieszać, inkubowac 15 minut na lodzie. GTC (100 ml): 47, 26g GTC, 0,735g cytrynianu sodu, 0,5g sarkosylu, 0,78 ml 2-merkaptoetanolu, pH 7,0)
7. Dodać 2,5 ml mieszaniny fenol-chloroform-alkohol izoamylowy (25:24:1), pH 8.0. Dokładnie wymieszać.
8. Wirować 3000 rpm przez 15 minut w 4 st. C. Zebrać supernatant.
9. Dodać 2,5 ml chloroformu, dokładnie wymieszać.
10. Wirować 3000 rpm przez 15 minut w 4 st. C. Zebrać supernatant.
11. Dodać 5 ml 96% etanolu (-20 st. C). Delikatnie wybujać probówkę aŜ pojawi się osad. Zebrać osad.
12. Przemyć osad dwukrotnie po 500 ul 80% alkoholu etylowego.
13. Wysuszyć osad, a następnie rozpuścić w 200 ul sterylnej wody.
Tak otrzymane izolaty DNA naleŜy następnie doprowadzić do wspólnego stęŜenia. StęŜenie było mierzone w aparacie Nanodrop, a następnie ustalane do wartości wyjściowej 500 ng/ul w stocku.
5.2.b. AMPLIFIKACJA DNA PRZY ZASTOSOWANIU REAKCJI ŁAŃCUCHOWEJ POLIMERAZY
Reakcja łańcuchowa polimerazy (ang. polymerase chain reaction, PCR) to metoda pozwalająca na namnoŜenie interesującego nas fragmentu będącego przedmiotem dalszej analizy. Polega na ograniczeniu badanego fragmentu sekwencji
45 nukleotydowej poprzez startery F (ang. forward) i R (ang. reverse), ograniczające nasz badany fragment z obu końców (5’ i 3’) nici DNA. Następnie, w odpowiednio dobranej temepraturze przyłączania tych starterów prowadzi się od 20-50 cykli powielających badaną sekwencję. Tym sposobem w mieszaninie reakcyjnej w znakomitej większości znajduje sie tylko nasz badany fragment DNA. Temperaturę
najefektywniejszego przyłączania starterów do matrycy DNA ustala sie doświadczalnie, co zostało szczegółowo omówione w kolejnym rozdziale.
Schemat reakcji PCR przedstawia rycina 13.
Rycina 13. Schemat reakcji PCR. Opracowanie własne.
5.2.b.1. USTALANIE WARUNKÓW REAKCJI
Dla kaŜdego badanego SNP zostały doświadczalnie ustalone parametry rekacji PCR. W tym celu przeprowadzono gradientowy PCR. Reakcja została przeprowadzona z zachowaniem takich samych warunków dla kaŜdej badanej próby przy jedynej zmiennej – temperaturze przyłączania starterów (reakcja została przeprowadzona dla wszystkich prób na tej samej matrycy, z taką samą polimerazą Taq i dNTP’ami, w objętości 20ul). Wizualizacja gradientów została przedstawiona na
46
Rycina 14. Gradient PCR. Górny rządek, od lewej: ATG16L1 rs2241879, marker M (DNA faga lambda trawione enzymami restrykcyjnymi HindIII i EcoRI), ATG16L1 rs2241880 Dolny rządek od lewej: IL23R rs1004819Marker M, IL23R rs7517847
Temp. od lewej: 48,9; 52,0; 54,4; 56,8; 59,1; 61,5; 63,9; 66,1 st. Celsjusza. śel agarozowy 1,2%.
Rycina 15. Gradient PCR. Od lewej: Marker M, gradient dla genu DLG5 R30Q. Temp. od lewej: 48,9; 52,0; 54,4; 56,8; 59,1; 61,5; 63,9; 66,1 st. Celsjusza. śel agarozowy 1,2%
Rycina 16. Gradient PCR. Górny rządek od lewej: marker M, gen OCTN1 (1672C/T). Dolny rządek od lewej: marker M, gen TNFalfa (-857). Temp. od lewej: 48,9; 52,0; 54,4; 56,8; 59,1; 61,5; 63,9; 66,1 st. Celsjusza. śel agarozowy 1,2%
Rycina 17. Gradient PCR. Od lewej: marker M, gen CARD15/NOD2 G908R
Temp. od lewej: 48,9; 52,0; 54,4; 56,8; 59,1; 61,5; 63,9; 66,1 st. Celsjusza. śel agarozowy 1,2%
47 212
Rycina 18. Gradient PCR. Od lewej: gen TNFalfa 420, marker M, gen TNFalfa 750 G908R Temp. od lewej: 48,9; 52,0; 54,4; 56,8; 59,1; 61,5; 63,9; 66,1 st. Celsjusza. śel agarozowy 1,2%.
5.2.b.2. PROJEKTOWANIE STARTERÓW
Do reakcji PCR wymagane jest zaprojektowanie starterów. Ograniczają one badany fragment i umoŜliwiają jego namnoŜenie w czasie reakcji. Reakcja pirosekwencjonowania wymaga natomiast dodatkowego startera, tzw. sekwencyjnego. Definiuje on badany SNP poprzez przyłączanie się do produktu reakcji PCR i umoŜliwia sekwencjonowanie skróconego fragmentu DNA, zawierającego interesującą nas zmianę polimorficzną (Rycina 19). Stratery do analizy SNP zostały zaprojektowane z uŜyciem oprogramowania dedykonanego do projektowania starterów dla reakcji pirosekwencjonowania.
Rycina 19. Działanie starera sekwencyjnego. Źródło: www.pyrosequencing.com
Tabela 3. Spis starerów uŜytych do analizy SNP.
Nazwa startera
badanego SNP Sekwencja 5’3’ znakowanie
Długość amplikonu
(nt)
ATGrs2241879_F gcttagctgcaggcctagaaa biotyna
152 ATGrs2241879_R tggatactcatcctggttctgg
48 ATGrs2241879-SEQ ccacgcttgatatgg
ATGrs2241880_F ttacgaagacacacaaggcagtag
98 ATGrs2241880_R tgtctcttccttcccagtcc biotyna
ATGrs2241880_SEQ tttaccagaaccaggat IL23Rrs7517847_F cctcttggttttcccatttca
292 IL23Rrs7517847_R tgaatttgaggggcctagga biotyna
IL23Rrs7517847_SEQ tttcacctattcccaag IL23Rrs1004819_F tagcagcacaagcattctagga
125 IL23Rrs1004819_R actgacctgctttatgctgtga biotyna
IL23Rrs1004819_SEQ cttatgagaaatgcagatag
TNFalfa_-857_F ggacccccccttaacgaa biotyna
263 TNFalfa_-857_R atcacccccgggaattcac
TNFalfa_-857_SEQ ctggggccctctaca TNFalfa_420_F taggggggtattttctaggaagtt
216 TNFalfa_420_R agcgagtccttctcacattgtc biotyna
TNFalfa_420_SEQ tcatcttctcgaaccc
TNFalfa_750_F ggccaagccctggtatga biotyna
94 TNFalfa_750_R atagtcgggccgattgatc
TNFalfa_750_SEQ gacccctcccagata
CARD15_908_F gactcttttggccttttcagatt biotyna
243 CARD15_908_R ccaatggtcttttttccttactcc CARD15_908_SEQ tcgtcacccactctgt DLG5_113(R30Q)_F ttattccccttccacaggcactac 107 DLG5_113(R30Q)_R gccgcagctgaatggaga biotyna DLG5_113(R30Q)_SEQ cccctcctcactgac
OCTN1_1672C>T_F acagaatgctgccctacatcgt biotyna
92 OCTN1_1672C>T_R aagagtcattcccaaactttcagg
OCTN1_1672C>T_SEQ gggaaaaaaagggtga
Tabela 4. Sekwencje analizowane w reakcji pirosekwencjonowania. . W zapisie wykorzystano róŜne sposoby kodowania sekwencji (patrz: Tabela 5).
L.p. Nazwa badanego SNP Sekwencja do analizy (zaznaczono polimorfizm)
49 2 ATGrs2241880 GAGYATCCACATTGTCCTGGGGGACTGGG 3 IL23Rrs7517847 GCCKCAGCTACACCTGTATGTAGGCTAGA 4 IL23Rrs1004819 CAYAGTAAGAATCACAGCATAAAGCAGG 5 TNFalfa_-857 TGA/GCCCTGTCTTCGTTAAGGGGGGGTCC 6 TNFalfa_420 C/TGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATGTT 7 TNFalfa_750 GA/TTGGGCTCATACCAGGGCTTGGCCTC 8 CARD15_908 TGCC/GCCAGAATCTGAAAAGGCCAAAAGAG 9 DLG5_113(R30Q) CG/AGCAAGTGAATGAGAAGGTGGAGAAC 10 OCTN1_1672C>T A/GGATTCCAATCAGGACAGTCAGACTA
Tabela 5. Symbole kodów zmian polimorficznych.
Symbol w sekwencji DNA Nukleotyd kodowany przez dany symbol
A A B C/G/T C C D A/G/T G G H A/C/T K G/T M A/C N A/C/G/T R A/G S G/C T T V A/C/G W A/T Y C/T
50 5.2.b.3. ANALIZA PRODUKTÓW REAKCJI PCR PRZY ZASTOSOWANIU
ELEKTROFOREZY POZIOMEJ W śELACH AGAROZOWYCH
Po kaŜdorazowo przeprowadzonej reakcji PCR przeprowadzano analizę
produktów reakcji w Ŝelu agarozowym przy uŜyciu elektroforezy poziomej. StęŜenie
Ŝelu agarozowego w zaleŜności od wielkości badanych fragmentów wahało się od 1-1,5%. Do analizy wybierano wyrywkowo kilkanaście prób z całej płytki. Sprawdzenie to miało na celu określenie, czy reakcja PCR zaszła prawidłowo i czy otrzymano poŜądany produkt. Wykluczano jednocześnie zanieczyszczenie próby starterami uŜytymi do reakcji PCR, produktami niespecyficznymi oraz innymi zanieczyszczeniami, np. strukturami typu „primer-dimer” (struktura dwuniciowa, powstaje samoistnie w wyniku połączenia się częściowo komplementarnych do siebie starterów). PoniŜej została przedstawiona przykładowa analiza w Ŝelu agarozowym produktów reakcji PCR.
Rycina 20. Przykładowe sprawdzenie reakcji PCR na 1,2% Ŝelu agarozowym dla
ATG16L1 rs2241880.
5.2.b.4. SEKWENCJONOWANIE W CZASIE RZECZYWISTYM – PIROSEKWENCJONOWANIE
Pirosekwencjonowanie to stosowana na całym świecie, a ostatnio takŜe w Polsce, metoda badawcza pozwalająca na zdefiniowanie z praktycznie 100%
51 pewnością sekwencji DNA w krótkim czasie. Reakcja ta nazywana jest takŜe reakcją
sekwencjonowania w czasie rzeczywistym.
Choć metoda ta nie naleŜy do najtańszych, to z całą pewnością zakup sprzętu, oprogramowania i wymaganych odczynników zwraca się z nawiązką, jeśli weźmiemy pod uwagę pewność otrzymywanego wyniku i komfort pracy. Daje ona moŜliwość analizowania jednocześnie 96 zmian polimorficznych w czasie około 20 minut. Wyniki otrzymujemy w postaci pirogramów oraz odczytu komputerowego (wg ustalonych kryteriów program definiuje otrzymany wynik). Eliminowany jest tym samym błąd człowieka, a poniewaŜ reakcja zachodzi zawsze w takich samych warunkach nie ma takŜe moŜliwości zakłamania wyniku z powodu czynników zewnętrznych.
Pirosekwencjonowanie to metoda oparta na działaniu enzymów: polimerazy, apyrazy, lucyferazy i sulfurylazy. Produktem wyjściowym dla tej reakcji jest standardowy produkt reakcji PCR, otrzymywany w osobnym etapie (opis reakcji PCR z uwzględnieniem specyficznych warunków dla pirosekwencjonowania opisany został w osobnym rozdziale). Produkt reakcji PCR jest standardowo sprawdzany na Ŝelu agarozowym, celem wyeliminowania błędów, a następnie jest uŜyty jako matryca do pirosekwencjonowania.
W kolejnym etapie polimeraza w trakcie reakcji PCR dołącza komplementarnie nukleotydy, bazując na matrycy pojedynczej nici wyznakowanej biotyną. JeŜeli dodawany nukleotyd nie znajduje się w sekwencji nici komplementarnej, to jest degradowany przez apyrazę. JeŜeli natomiast znajduje się on w badanej sekwencji, zostaje przyłączony z jednoczesnym uwolnieniem difosforanu (PPi), który w następnym etapie przechodzi w adenozynotrifosforan (ATP) z uŜyciem sulfurylazy. ATP jest z kolei wykorzystywane przez lucyferazę do reakcji, której efektem jest błysk
świetlny odczytywany w końcowej fazie przez komputer. Taki sygnał świetlny jest znakiem, Ŝe dodany nukleotyd znalazł się w sekwencji komplementarnej nici DNA i nić dobudowywana została wydłuŜona.
Reakcja pirosekwencjonowania zachodzi w jednym etapie, do którego naleŜy jednak przygotować kilka wcześniejszych elementów. Pierwszym z nich jest przygotowanie streptawidyny. Komercyjnie dostępny bufor B miesza się w
52 odpowiednich proporcjach z wodą i streptawidyną (Tabela 6), aby następnie rozpipetować go do produktu PCR w ilości po 60 ul na dołek.
Tabela 6. Ilości odczynników potrzebne do przygotowania złoŜa streptawidynowego.
Ilośćna jedną próbę
Ilośc na całą płytkę
(96 prób + 4 zapasu)
woda 20 2000
streptawidyna 3 300
Bufor B 37 3700
Równolegle przygotowuje się osobną płaskodenkową płytkę 96-dołkową ze starterem sekwencyjnym przygotowanym w środowisku buforu A (Tabela 7). Do kaŜdego dołka rozpipetowuje się po 40ul mieszaniny, do której w końcowym etapie zostaje uwolniony jednoniciowy produkt PCR.
Tabela 7. Ilości odczynników potrzebne do przygotowania startera sekwencyjnego.
Ilośc na jedną próbkę Ilośc na całą płytkę
(96 prób + 4 zapasu)
Starter sekwencyjny 0,32 32
Bufor A 39,68 3968
Proces przygotowania reakcji odbywa się w specjalnej stacji z następującymi stanowiskami: stanowisko z alkoholem etylowym (1), stanowisko z roztworem do denaturacji dwuniciowej struktury DNA (2), stanowisko przemywania (3), oraz stanowisko z miliporowaną wodą do przemywania stacji(4), (Rycina 21). W stacji znajduje się takŜe miejsce na płytkę 96-dołkową z produktem PCR (PCR plate), oraz na płaskodenkową płytkę z roztworem startera sekwencyjnego (PSQ plate).
53
Rycina 21. Poszczególne stanowiska stacji podawczej w kolejnych etapach reakcji pirosekwencjonowania. Źródło: www.pyrosequencing.com
W pierwszym etapie naleŜy zassać produkt PCR z dodaną wcześniej streptawidyną na dyszach 96-igłowej stacji, a następnie przechodząc kolejne etapy zdenaturować produkt, aby otrzymać jednoniciową strukturę DNA z biotyną na jednym końcu sekwencji (biotyna umoŜliwia związanie DNA z filtrem), a następnie przemyć, aby produkt był wysoce oczyszczony w celu uniknięcia zakłócania sygnału odczytu. Tak przygotowany produkt uwalnia się do startera sekwencyjnego. Płytkę z produktem oraz starterem sekwencyjnym „zapieka się” w temperaturze 80 st. Celsjusza – jest to temperatura przyłączania startera sekwencyjnego do jednoniciowej struktury zdenaturowanego DNA. Następnie płytka ulega wychłodzeniu do temperatury pokojowej i zostaje umieszczona w pirosekwenatorze. Kolejny etap polega na automatycznym dodawaniu nukleotydów do kaŜdego dołka reakcyjnego. JeŜeli nukleotyd jest komplementarny do sekwencji jednonicowego DNA to zostaje przyłączony do startera sekwencyjnego, a kamera CCD odczytuje błysk świetlny powstały na drodze reakcji z sulfurylazą i lucyferazą i zapisuje go jako pik w okienku odczytu sekwencji. JeŜeli natomiast nukleotyd nie występuje w sekwencji, to jest on
54 degradowany poprzez apyrazę, tak, Ŝeby w momencie dodawania kolejnego nukleotydu środowisko reakcji było czyste (Rycina 22).
Rycina 22. Schemat reakcji pirosekwencjonowania. Źródło: www.pyrosequencing.com.
5.2.c. OBJAWY KLINICZNE
5.2.c.1. LOKALIZACJA OBJAWÓW Z PRZEWODU POKARMOWEGO
Choroba Leśniowskiego-Crohna (ChLC) charakteryzuje się występowaniem objawów na całej długości przewodu pokarmowego, począwszy od jamy ustnej a skończywszy na odbycie. Obraz kliniczny choroby został szczegółowo przedstawiony w początkowych rozdziałach, dlatego nie będzie tutaj ponownie omawiany.
Na potrzeby ninijeszej analizy objawy z przewodu pokarmowego zostały podzielone na:
55 b) objawy z obszaru jelita cienkiego
c) objawy z obszaru jelita grubego
d) występowanie przetok okołoodbytniczych
Objawy kliniczne choroby zlokalizowane w obszarze przewodu pokarmowego zostaną poddane analizie mającej na celu wyłonić ewentualny związek konkretnego allelu/genotypu z objawami klinicznymi w konkretnej lokalizacji. JeŜeli udałoby się
określić konkretny allel/genotyp predysponujący do rozwoju choroby w danej, konkretnej lokalizacji, być moŜe w przyszłości udałoby sie określić swoisty test prognozujący rozwój choroby.
5.2.c.2. LOKALIZACJA OBJAWÓW WYSTĘPUJĄCYCH POZA PRZEWODEM POKARMOWYM
Poza typowymi objawami z obszaru przewodu pokarmowego, w obrazie klinicznym ChLC u wielu pacjentów obserwuje się wystepowanie specyficznych objawów spoza układu pokarmowego. Ich występowanie nie jest warunkiem koniecznym do zdiagnozowania choroby, ale w wielu przypadkach są one albo pierwszym objawem choroby, albo objawem towarzyszącym w momencie, kiedy nie moŜna jeszcze postawić rozpoznania choroby.
Są to m. in.:
a) bóle stawów
b) zapalenie cewki moczowej
c) zapalenie tęczówki
d) stomatitis aphtosa – nadŜerki w jamie ustnej
e) rumień guzowaty i zgorzelinowa piodermia
f) stłuszczenie wątroby
56 h) podwyŜszona temperatura ciała.
Podobnie jak dla objawów z przewodu pokarmowego, przeprowadzona zostanie szczegółowa analiza mająca na celu określenie konkretnych alleli/genotypów predysponujących do pojawienia się konkretnych objawów chorobowych spoza przewodu pokarmowego. Podobnie jak dla objawów gastrycznych, jeŜeli udałoby się określić allel/genotyp predysponujący do rozwoju konkretnych objawów, być moŜe w przyszłości udałoby sie określić swoisty test prognozujący rozwój choroby, takŜe w zakresie objawów spoza układu pokarmowego.
57