A SPEKTY METROLOGICZNE

Oceniając aspekty metrologiczne prac związanych z badaniami próbek klinicznych z zastosowaniem metody LA-ICP-MS można stwierdzić, że znaczna większość badaczy jest świadoma istotności parametrów walidacyjnych charakteryzujących metodę analityczną stosowaną we własnych pracach. W tabeli 2 zebrane zostały prace o charakterze ilościowym, w których poruszony został co najmniej jeden z następujących aspektów: obliczony został co najmniej jeden parametr walidacyjny lub zastosowany został CRM lub wzorzec kalibracyjny z ustanowioną spójnością pomiarową. Liczba zebranych w tabeli prac, zgodnie z powyższym założeniem, wynosi 52 spośród 70 publikacji dot. analizy próbek klinicznych metodą LA-ICP-MS, znalezionych w bazie Scopus.

Parametry walidacyjne uwzględnione w zestawieniu to: (i) LOD, jako zawartość lub masa analitu, (ii) LOQ, (iii) liniowość, (iv) precyzja i (v) odzysk, dokładność/poprawność. W nawiasach przedstawiony jest zapis danego parametru stosowany przez autorów danej publikacji. Rysunek 4 przedstawia udział procentowy powyższych parametrów walidacyjnych w omawianych publikacjach.

Rysunek 4 Udział prac, w którym wyznaczono dany parametr walidacyjny

Na rysunku 5 przedstawiony jest procentowy udział prac, w których obliczone zostały określone liczby parametrów walidacyjnych spośród omawianych 52 publikacji. W przypadku 4 prac (8%) nie

0 10 20 30 40 50 60 70

Udział prac [%]

44 obliczono żadnego parametru, a w 24 pracach (46%) obliczono trzy lub więcej parametrów. Większa liczba parametrów dostarcza pełniejszej informacji nt. możliwości i ograniczeń zastosowanej procedury analitycznej. W 46% prac obliczono tylko jeden lub dwa parametry, co dostarczyło tylko częściowej informacji nt. stosowanej metody. Na rysunku 6 przedstawiono udział procentowy badań dot. danego rodzaju próbki, w których obliczono trzy i więcej parametrów walidacyjnych.

Z zestawienia literatury światowej wynika, że do aspektów metrologicznych nie jest przykładana wystarczająca uwaga, gdyż często parametry walidacyjne nie są obliczane lub brakuje zachowania spójności pomiarowej. Są to cechy metody i wyniku pomiaru, które są konieczne aby uzyskać miarodajne wyniki, które można porównywać oraz żeby wyciągnąć prawidłowe wnioski z przeprowadzonych badań, co jest szczególnie istotne w przypadku próbek klinicznych. Należy zwrócić uwagę, że w większości próbek przeprowadza się analizę śladową, gdzie wymagana jest pełna walidacja metody z zapewnieniem i wykazaniem spójności pomiarowej. W przypadku analizy suchej kropli, ze względu na małe ilości próbki potrzebne do analiz i możliwość wielokrotnego powtórzenia pomiaru, położono większy nacisk na wyznaczenie parametrów walidacyjnych zastosowanej procedury analitycznej i obliczono najwięcej parametrów walidacyjnych w stosunku do wszystkich przeanalizowanych próbek ujętych w ocenianych publikacjach w tabeli 2 [47–

50,65,135]. W celu zapewnienia spójności, w omawianych pracach stosowane były CRMy oraz roztwory jedno- i wielopierwiastkowe, z których wykonywane były wzorce do kalibracji. Tego typu wzorce są opatrzone certyfikatem poświadczającym stężenie analitu wraz z niepewnością oraz informację o sposobie zapewnienia spójności pomiarowej. W omawianych pracach CRMy używane były na dwa sposoby: jako wzorzec kalibracyjny w celu stworzenia jednopunktowej krzywej

Rysunek 5 Procentowy udział prac, w których obliczona została n liczba parametrów walidacyjnych ze zbioru 52 prac omawianych w tabeli 2.

Rysunek 6 Procentowy udział prac, w których obliczono 3 lub więcej parametrów walidacyjnych w obrębie danej grupy próbek 46%

45 kalibracyjnej lub jako wzorzec służący do oszacowania dokładności/poprawności metody. W przypadku tkanek miękkich, postać w jakiej występują CRMy, czyli suchy proszek, powoduje trudności w odtworzeniu oryginalnej struktury badanej tkanki, która najczęściej jest zwarta i lita [36,63,64,108]. Pierwszą pracą, w której użyto CRMu do wykazania spójności została opublikowana w roku 2000 [118]. Praca ta dotyczyła analizy zębów, natomiast w celu stworzenia zależności kalibracyjnej użyty został CRM na bazie szkła – NIST 612 Elements in Glass, jednakże nie jest to materiał o matrycy zgodnej z matrycą badanej próbki. W roku 2003 zastosowano CRMy - NIST SRM 1400 Bone Ash i NIST SRM 1486 Bone Meal o matrycy zgodnej z badaną próbką, jaką był również ząb [120]. Natomiast pierwszą pracą, w której użyty został CRM na bazie tkanek miękkich ukazała się dopiero w 2013 i użyty został SRM NIST 1577b Bovine Liver w ilościowej analizie wątroby dotkniętej marskością [108]. Generalnie, znacznie częściej stosowano CRMy w przypadku analizy tkanek twardych, jak zęby i włosy, czy suchej kropli. W przypadku analizy suchej kropli, w handlu dostępne są CRMy na bazie krwi i moczu, które, po dodaniu wody, mają cechy i skład identyczne jak próbka badana, dzięki czemu możliwe jest przeprowadzenie pełnej walidacji i uzyskanie miarodajnych wyników.

Na rysunku 7 przedstawiony jest procentowy udział prac, w których użyto CRMu, w obrębie danego rodzaju próbek. Badacze pracujący z użyciem metody LA-ICP-MS przeważnie są zgodni, że często nie ma dostępnych komercyjnie CRMów o matrycy zgodnej z matrycą badanych próbek.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

miękkie n=23 twarde n=21 sucha kropla n=8

Udział prac [%]

Rodzaj próbek klinicznych

Rysunek 7 Procentowy udział prac, w których zastosowano CRM w analizie próbek klinicznych w obrębie danej grupy próbek

46

Cel pracy

W niniejszej pracy podjęty został problem zbadania zawartości i rozmieszczenia pierwiastków we fragmentach błony śluzowej pobranych od pacjentów leczonych stomatologicznie po procesie implantacji. Oznaczano pierwiastki zawarte w implantach: Ti, V i Al oraz pierwiastki fizjologiczne: Ca, Mg, Fe, Mn, Cu, Zn, stosując metodę LA-ICP-MS. Biorąc pod uwagę wiedzę przedstawioną w części literaturowej rozprawy doktorskiej określono szczegółowe cele dotyczące realizacji badań eksperymentalnych: 1) optymalizacja parametrów instrumentalnych systemu LA i detekcji ICP-MS; 2) przygotowanie wzorców stałych do oznaczania pierwiastków metodą LA-ICP-MS;

3) wybór odpowiedniego wzorca wewnętrznego w analizach ilościowych; 4) opracowanie etapu kalibracji bezpośredniej analizy tkanek miękkich ustrojowych; 5) wprowadzenie zasad metrologii w przeprowadzonych pomiarach chemicznych; 6) zaprojektowanie procedur analitycznych oznaczania pierwiastków w błonie śluzowej mającej kontakt z implantami, pobranej od pacjentów leczonych stomatologicznie; 7) prezentacja uzyskanych wyników w postaci dwuwymiarowych map zawartości i rozmieszczenia analizowanych pierwiastków.

47

CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA

Etapy procedur klinicznych przeprowadzono za zgodą Komisji Bioetycznej przy Uniwersytecie Medycznym im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu. Wszyscy uczestnicy badania dostarczyli pisemną zgodę na pobranie tkanek.

48

5. Aparatura, odczynniki, roztwory, materiał badawczy, materiały