Mikroskopia środowiskowa

Standardowa Skaningowa Mikroskopia Elektronowa (SEM) jest dojrzałą, sprawnie działającą techniką badawczą używaną w wielu dziedzinach nauki i techniki. Opis fizyczny

systemów próżniowych, systemów detekcyjnych, oddziaływania elektronów z próbką, formowania obrazu w mikroskopie wysokopróżniowym można znaleźć w wielu podręcznikach akademickich [43, 95]. Jak już wcześniej wspomniano wysokopróżniowa skaningowa mikroskopia elektronowa wymaga utrzymania próżni rzędu 10^-5 hPa. Związane jest to z potrzebą wytworzenia i skupienia wiązki elektronowej, która jest odpowiedzialna za generowanie sygnałów w preparatach. Niska koncentracja cząsteczek gazu powoduje znikome rozpraszanie wiązki. Dzięki wysokiej próżni możliwe było wytworzenie standardowego detektora elektronów wtórnych, detektora Everharta-Thornleya, którego anoda musi zostać spolaryzowana napięciem 15 kV, aby nadać energię elektronom wtórnym. Obecność gazu w komorze przedmiotowej mogłaby powodować wyładowania elektryczne w detektorze, co zaburzałoby poprawną jego pracę, a nawet mogłoby spowodować jego zniszczenie. Ostatecznie wysoka próżnia używana w konwencjonalnym SEM ogranicza możliwości stosowania próbek zawierających składniki o wysokiej prężności par, bez wcześniejszego ich przygotowania, tj. suszenia bądź mrożenia. Procesy takie zmieniają całkowicie strukturę preparatów, dlatego informacje pozyskiwane z tak przygotowanych materiałów są ograniczone. Odnosi się to także do preparatów izolacyjnych. W tym wypadku to wiązka elektronowa wymusza pokrywanie takich próbek warstwami przewodzącymi w celu odprowadzania nadmiarowego ładunku [43]. Obecność tych warstw maskuje istotne informacje o preparacie – zmienia stan powierzchni preparatu, przez co zaburzona jest emisja elektronów wtórnych i innych sygnałów.

Te ograniczenia nurtowały naukowców i w zasadzie od czasu powstania mikroskopii elektronowej podejmowali oni próby obserwowania próbek wilgotnych. Już w 1944 roku uzyskano pierwsze zdjęcia uwodnionych próbek za pomocą specjalnego pojemnika zaopatrzonego w membranę transparentną dla elektronów, jednak nie przepuszczającą gazu [1]. Metoda ta używana była w mikroskopii transmisyjnej i sprawiała wiele problemów, gdyż membrana była zbyt delikatna i często powodowała uszkodzenie mikroskopu w przypadku rozerwania i rozprężenia gazów znajdujących się w jej środku.

Dla skaningowej mikroskopii elektronowej potrzebny był inny sposób pozwalający na utrzymanie próbek w stanie naturalnym. Rewolucję przyniosła metoda pompowania różnicowego opracowana przez Shaha. W standardowym SEM w całym obszarze mikroskopu utrzymywana jest wysoka próżnia. W ESEM natomiast w komorze przedmiotowej wytwarzany jest obszar podwyższonego ciśnienia roboczego [5, 17]. Jednak kolumna elektronooptyczna nadal musi być utrzymywana w wysokiej próżni. Jest to możliwe do osiągnięcia za pomocą oddzielenia obu obszarów kilkoma przesłonami dławiącymi przepływ

gazu (PLA – ang. Pressure Limiting Aperture) oraz systemu pompowania różnicowego (rys. 2.7). Obszary przed, za i pomiędzy przesłonami są osobno pompowane, aby uzyskać odpowiedni gradient ciśnienia. Montuje się je najczęściej w soczewce obiektywowej dość blisko siebie, aby zminimalizować odległość jaką przebyć musi wiązka elektronowa w gazie. Komora przedmiotowa oprócz systemu odpowietrzającego może być zaopatrzona w system dozujący odpowiednie gazy robocze zwane gazami obrazowymi. Najczęściej używanymi gazami w ESEM są: wodór, hel, argon, tlen, azot, tlenek azotu, dwutlenek węgla, woda. Wymienione gazy charakteryzują się różnymi współczynnikami wzmocnienia sygnału elektronowego – przy wyborze gazu należy uwzględnić jego możliwości, gdyż wpływa to na jakość otrzymywanego zdjęcia. Z wymienionych gazów najpopularniejszym jest woda, gdyż oprócz bardzo dobrego wzmocnienia sygnału i wysokiego współczynnika sygnału do szumu istnieje możliwość utrzymywania próbek biologicznych w stanie uwodnionym [38].

Rys. 2.7. Przekrój przez ESEM, schemat sytemu próżniowego.

Zastosowanie gazu roboczego ma dwie ważne zalety. Po pierwsze możliwe jest utrzymanie próbek w ich naturalnym środowisku przez odpowiednie ustalenie składu i ciśnienia gazu wewnątrz komory przedmiotowej. Po drugie jony dodatnie powstałe w wyniku jonizacji cząstek gazu przez elektrony umożliwiają neutralizację ładunku ujemnego nagromadzonego na powierzchni próbek nie przewodzących. Jednocześnie jego pojawienie się w komorze przedmiotowej stwarza problemy związane głównie z jego możliwościami rozpraszania zarówno wiązki elektronowej, jak również sygnałów generowanych w próbce.

w kolejnym rozdziale, który będzie poświęcony dokładnemu opisowi działania

Środowiskowej Skaningowej Mikroskopii Elektronowej. 2.4. Mikroskopia o zmiennym ciśnieniu

Ostatnim etapem rozwoju mikroskopii elektronowej jest powstanie tzw. Skaningowej Mikroskopii Elektronowej o zmiennym ciśnieniu (VP SEM – z ang. Variable Pressure SEM). Jest to swojego rodzaju integracja wielu technik mikroskopii elektronowej. Opisana wcześniej

Środowiskowa Mikroskopia Elektronowa powstała głównie w celu obserwacji próbek

zawierających wodę, tj. próbek biologicznych [18, 19, 44]. Wymagane ciśnienie gazu roboczego może przekraczać w tym wypadku 6 hPa. Jest to ciśnienie odpowiadające prężności par wody w temperaturze 0 °C. W trakcie badań różnych preparatów tą metodą okazało się, że tak wysokie ciśnienie wymagane jest do utrzymywania preparatów zawierających wodę, bądź innych preparatów o podwyższonej prężności par w stanie naturalnym. Dielektryki i inne preparaty w stanie stałym obserwowane były przy niższych ciśnieniach z lepszą rozdzielczością [41, 100, 131, 134]. W ten sposób stworzono grupę mikroskopów wyspecjalizowanych do badania dielektryków. Ze względu na sposób działania przypominają aparaty ESEM, jednak stosowane ciśnienia wahają się w okolicach 1 hPa, z tego powodu ta grupa mikroskopów została nazwana mikroskopami niskopróżniowymi (LV SEM – ang. Low Vacuum SEM). W mikroskopach niskopróżniowych można stosować tańszy system próżniowy, a także odmienny sposób detekcji sygnałów od stosowanego w mikroskopach ESEM. Dzięki temu możliwe było ograniczenie kosztów produkcji w stosunku do skomplikowanych aparatów ESEM. Tak to w procesie rozwoju mikroskopii elektronowej od 1931 roku powstały 3 rodzaje urządzeń o różnym przeznaczeniu. Z jednej strony jest to zaletą, gdyż każdy z takich mikroskopów wyspecjalizowany jest do działania w odpowiedniej atmosferze, przeznaczony dla odmiennych preparatów. Dzięki specjalizacji powstały dedykowane detektory mierzące sygnały w danych warunkach z najlepszą rozdzielczością. Jednak powoduje to iż ośrodki naukowe specjalizujące się w badaniach mikroskopowych muszą zakupić zestaw 3 rodzajów mikroskopów, aby móc rozszerzyć swoją działalność. Dlatego obecnie pracuje się nad możliwością połączenia wszystkich technik badawczych w jednym urządzeniu. Mikroskopy o zmiennym ciśnieniu mają łączyć zalety zaawansowanego mikroskopu środowiskowego z niższą ceną mikroskopu niskopróżniowego. W jednym instrumencie mają być możliwe do wykonania badania próbek izolacyjnych, uwodnionych, a nawet standardowe badania w wysokiej próżni.