Model doświadczalny

Modelem doświadczalnym była hybrydowa linia komórek cholinergicznych SN56.B5.G4 podarowanych przez prof. J.K. Blusztajna (Boston, USA) oraz linia klonalnych szczurzych astroglioma C6 podarowanych przez prof. Jana Albrechta (Centrum Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej im. M. Mossakowskiego PAN).

Komórki SN56 zostały utworzone przez fuzję niecholinergicznych mysich komórek neuroblastoma N18TG2 z cholinergicznymi neuronami z przegrody mózgu 21-dniowej myszy C57BL/6 (Hammond i wsp., 1990).

Komórki SN56 i C6 hodowano w pożywce Eagle zmodyfikowanej według Dulbecco (DMEM) zawierającej 3 mmol/L ZnCl₂, 25 mmol/L glukozę, 2 mmol/L L–glutaminę, 50 µg/ml streptomycyny, 50 j.m/ml penicyliny, 0.25 µg/ml amfoterycyny B oraz 10% płodową surowicę wołową (FBS); pożywka zamrażająca dla komórek SN56 i C6 zawierała: 63% DMEM, 30% FBS, 7% DMSO; komórki zamrażano w krioampułkach w ilości 2–2.5 mln/ml w temperaturze -80°C.

Komórki hodowano w atmosferze 95% O₂ i 5% CO₂ w temperaturze 37°C. Komórki wysiewano w ilości 2.32x10⁶ na płytkę o powierzchni 58 cm² (0,04x10⁶/cm²) oraz 3x10⁶ do butelki o powierzchni 75 cm² (0,04x10⁶/cm²) i hodowano do stanu subkonfluencji (80% pokrycia powierzchni, ocena mikroskopowa). Ilość komórek określano w komorze zliczeniowej Fuchs-Rosenthala. Doświadczenia przeprowadzano na pasażach od 23 do 52 komórek SN56 oraz od 61 do 72 komórek astrocytarnych C6.

W celu zwiększenia ekspresji fenotypu cholinergicznego komórek SN56 oraz fenotypu astrocytarnego komórek C6 dodawano do pożywki wzrostowej 1 mmol/L dwumaślanu–cAMP (dbcAMP) i 0.001 mmol/L kwasu all-trans-retinowego (RA).

Komórki te zostały wykorzystane do badań nad długoczasowym, krótkoczasowym i bezpośrednim wpływem cynku na metabolizm komórkowy, jego akumulację i poziom Ca.

4.1.1 Badania długoczasowego wpływu Zn w komórkach cholinergicznych SN56 i astroglejowych C6

W celu zbadania długoczasowego wpływu Zn na metabolizm energetyczny oraz jego akumulację, komórki cholinergiczne i astroglejowe hodowano przez 48 godzin w pożywce DMEM bez lub w obecności czynników różnicujących

50

(dbcAMP/RA). Następnie wymieniano środowisko wzrostowe na środowisko doświadczalne, do którego dodawano różne stężenia Zn (0-300 mmol/L) na kolejne 24 godz. Po tym czasie, środowisko doświadczalne zbierano w celu oznaczenia uwalniania LDH. Komórki przepłukiwano schłodzonym buforem Puck’s zawierającym 137 mmol/L NaCl, 5.4 mmol/L KCl, 5.55 mmol/L glukoza, 5 mmol/L bufor fosforanowo-sodowy (pH 7.4), 2.7 mM EDTA w celu usunięcia kationów Zn²⁺

zaabsorbowanych na ich powierzchni, a następnie przepłukiwano dwukrotnie buforem Puck’s bez EDTA. Komórki z naczynia hodowlanego zbierano używając plastikowych skrobaczek i zawieszano w buforze Puck’s. Zawiesinę komórek wirowano przy 1200 obr./min (208xg) przez 7 minut. Do badań metabolicznych osad komórek zawieszano w 0.32 mol/L sacharozie zbuforowanej 5 mmol/L buforem HEPES pH 7.4 i 0.1 mmol/L EDTA w objętości niezbędnej do uzyskania 10 mg białka/mL (10 mln komórek/mL). W celu oznaczenia akumulacji Zn osad komórek denaturowano 4% HClO4 (patrz4.4).

W badaniach długoczasowego wpływu Zn w hodowli łączonej pełny cykl doświadczenia trwał 72 godziny. Komórki cholinergiczne SN56 hodowano w ilości 2.32x10⁶ na płytkach 10 cm². Komórki astrocytarne C6 hodowano wstępnie przez 24 godziny na poliwęglanowych insertach z półprzepuszczalnym dnem o średnicy 3 cm i porowatości 4 µm, umieszczonych w 6-dołkowych płytkach. Na każdy insert nanoszono 3.2x10⁵ komórek C6. Na płytkę z komórkami SN56 (hodowanych 24 godziny) przenoszono 3 inserty z komórkami C6 (Ryc. 4), ponieważ astrocyty stanowią 25% komórek OUN (Eng i wsp., 1992), i prowadzono hodowlę przez następne 24 godziny. Warunki cytotoksyczne wywoływano dodając do hodowli łączonej wzrastające stężenie zewnątrzkomórkowego cynku na kolejne 24 godziny.

Po tym czasie, środowisko doświadczalne zbierano w celu oznaczenia uwalniania LDH. Komórki przepłukiwano buforem Puck’s zawierającym 2.7 mM EDTA w celu usunięcia kationów Zn²⁺ zaabsorbowanych na ich powierzchni, a następnie przepłukiwano dwukrotnie buforem Puck’s bez EDTA. Komórki SN56 z naczynia hodowlanego zbierano buforem Puck’s używając plastikowych skrobaczek.

Zawiesinę komórek wirowano przy 1200 obr./min (208xg) przez 7 minut. Do badań metabolicznych osad komórek zawieszano w 0.32 mol/L sacharozie zbuforowanej 5 mmol/L buforem HEPES pH 7.4 i 0.1 mmol/L EDTA w objętości niezbędnej do uzyskania 10 mg białka/mL (10 mln komórek/mL). W celu oznaczenia akumulacji Zn osad komórek SN56 denaturowano 4% HClO₄ (patrz4.4).

51 Ryc. 4. Ilustracja przedstawiająca model hodowli łączonej komórek cholinergicznych SN56

i astroglejowych C6.

4.1.2 Badania krótkoczasowego wpływu Zn w komórkach cholinergicznych SN56 i astroglejowych C6

Krótkoczasowy wpływ Zn na jego akumulację, poziom Ca oraz metabolizm komórek badano inkubując komórki w środowisku depolaryzacyjnym bez i w obecności wzrastających stężeń ZnCl₂. W tym celu komórki hodowano w środowisku wzrostowym DMEM bez i w obecności czynników różnicujących przez 48 godz., przez następne 24 godziny komórki te hodowano w środowisku wzrostowym bez czynników różnicujących. Po tym czasie komórki przepłukiwano dwukrotnie schłodzonym buforem Puck’s. Komórki z naczynia hodowlanego zbierano w/w buforem używając plastikowych skrobaczek. Zawiesinę komórek wirowano przy 1200 obr./min (208xg) przez 7 minut. Do badań metabolicznych osad komórek zawieszano w 0.32 mol/L sacharozie zbuforowanej 5 mmol/L buforem HEPES pH 7.4.

Podstawowe środowisko depolaryzacyjne w końcowej objętości 1.0 ml zawierało:

20 mmol/L bufor HEPES pH 7.4; 1.5 mmol/L bufor fosforanowo-sodowy pH 7.4;

90 mmol/L NaCl; 30 mmol/L KCl; 2.5 mmol/L pirogronian; 2.5 mmol/L jabłczan;

1 mmol/L CaCl2; 0.1 mL zawiesiny komórek w 0.32 mol/L sacharozie zawierającej 1.5-2.5 mg białka komórkowego. Ewentualne zmiany w składzie środowiska inkubacyjnego zamieszczono w tekście. Inkubację rozpoczynano dodaniem zawiesiny komórek do środowiska i prowadzono w temp. 37°C przez 30 minut w łaźni wodnej, przy ciągłym mieszaniu o szybkości 100 cykli/min. Po inkubacji próby odwirowywano przez 3 min przy 12000 obr./min. W celu oznaczenia aktywności enzymów osad komórek zawieszano w 0.32 mol/L sacharozy

C6

SN56

52

zbuforowanej 5 mmol/L buforem HEPES pH 7.4. W celu oznaczenia akumulacji Zn osad komórek denaturowano 4% HClO₄ (patrz4.4).

4.1.3 Badania bezpośredniego wpływu Zn na aktywność enzymów w lizatach komórkowych C6

Bezpośredni wpływ Zn na aktywność enzymów metabolizmu komórkowego zbadano w lizatach komórkowych C6. W tym celu komórki hodowano w środowisku wzrostowym DMEM bez i w obecności czynników różnicujących przez 48 godz., następnie hodowlę prowadzono w środowisku wzrostowym bez czynników różnicujących przez następne 24 godz. Po tym czasie komórki przepłukiwano dwukrotnie buforem Puck’s. Komórki z naczynia hodowlanego zbierano w/w buforem używając plastikowych skrobaczek. Zawiesinę komórek wirowano przy 1200 obr./min (208xg) przez 7 minut, zawieszano w 0.32 mol/L sacharozy zbuforowanej 5 mmol/L buforem HEPES pH 7.4, a następnie lizowano przy użyciu Tritonu X-100 o końcowym stężeniu 0.2% i poddawano 10 minutowej preinkubacji w środowisku pomiarowym dla poszczególnych enzymów zawierającym wzrastające stężenia Zn (patrz rozdz. 4.3).

4.2 Czynniki neurotoksyczne