Modyfikacje strukturalne izoniazydu

Przedmiotem zainteresowań wielu zespołów badawczych jest modyfikacja izoniazydu, jednego z najskuteczniejszych leków przeciwgruźliczych. Elementy strukturalne cząsteczki izoniazydu ulegają wymianie w następujących kierunkach:

a) zmiany pierścienia pirydyny na inny układ heterocykliczny lub benzen, b) zmiany w obrębie grupy funkcyjnej poprzez wprowadzenie ugrupowania amidrazonowego czy tiosemikarbazydowego,

c) miejsce połączenia grupy funkcyjnej z pierścieniem aromatycznym.

Elementy strukturalne cząsteczki izoniazydu podlegające modyfikacjom.

W oparciu o uzyskane wielkości minimalnego stęŜenia hamującego wzrost szczepów (MIC w zakresie 3,1 – 12,5 µg/ml), stwierdzono, iŜ znaczną aktywność tuberkulostatyczną wykazują N-metylohydrazydy kwasu benzoesowego z róŜnymi podstawnikami w pierścieniu aromatycznym oraz kwasu adamantylooctowego. Istotne działanie przeciwprątkowe w stosunku do szczepu H37Rv wykazały takŜe ich pochodne tiosemikarbazydowe (MIC w zakresie 6,2 – 12,5 µg/ml), które uzyskano w reakcji N-metylohydrazydów z odpowiednimi izotiocyjanianami.³⁷

Tiosemikarbazydowe pochodne izoniazydu uzyskane w reakcji hydrazydu kwasu benzoesowego, 4-OH-benzoesowego i 3,4,5-triOMe-benzoesowego z izotiocyjanianami³⁸, mimo moŜliwości oddziaływań elektronów Π z łańcuchem bocznym, wykazują umiarkowaną bądź niską aktywność przeciwgruźliczą (MIC w zakresie 25 - 100 µg/ml).

Zmiana w obrębie grupy funkcyjnej

Miejsce podstawienia grupy funkcyjnej Zmiana pierścienia

pirydyny

R¹ = Ph, 4-OH-Ph, 3,4,5-tri-OMe-Ph R² = Et, allil, Ph, 4-Br-Ph

Dalsze poszukiwania analogów izoniazydu doprowadziły do uzyskania serii pochodnych kwasu benzoesowego o budowie hydrazydo - hydrazonowej, w reakcji kondensacji hydrazydu 4-podstawionego kwasu benzoesowego z odpowiednimi aldehydami.³⁹

NajwyŜszą aktywność wykazał (5-nitrotiofen-2-ylo-metyleno)hydrazyd kwasu 4-nitrobenzoesowego, który przy wartości MIC = 0,78 µg/ml powodował zahamowanie wzrostu 98% bakterii. (5-Nitrotiofen-2-ylo-metyleno)hydrazyd kwasu 4-fluoro- i 4-chlorobenzoesowego wykazały inhibicję odpowiednio w 98 i 96% przy wartości MIC = 3,13 µg/ml. Za pomocą programu ETM (Electronic-Topological Method) dokonano analizy pomiędzy budową cząsteczki a jej aktywnością tuberkulostatyczną. W analizie istotną rolę odgrywała budowa przestrzenna związków oraz rozkład gęstości elektronów. Dane z przeprowadzonych badań wykazały, iŜ obecność pierścienia tiofenu z podstawnikiem elektroujemnym (NO2, Br) w największym stopniu wpływa na aktywność mikrobiologiczną.

Zastąpienie pierścienia tiofenu na benzen, pirydynę czy pirol, jak równieŜ brak grupy nitrowej w pierścieniu tiofenu, powoduje znaczne obniŜenie aktywności biologicznej. Jednocześnie wykazano, Ŝe rodzaj halogenu w pozycji para pierścienia aromatycznego nie wpływa na zmianę aktywności.

Jedną z modyfikacji izoniazydu było przeprowadzenie tego związku w monoester i diester metylowy kwasu N'-izonikotynoiloditiokarbazowego, a następnie monoestru pod wpływem aminy cyklicznej w pochodną tiosemikarbazydu lub 1,3,4-oksadiazolu, w zaleŜności od warunków reakcji.⁴⁰

Oznaczono minimalne stęŜenie hamujące wzrost prątków gruźlicy, które dla większości otrzymanych związków zawierało się w granicach 250 - 1000 µg/ml, co sugeruje, iŜ transformacja izoniazydu do takich układów w tym miejscu pierścienia heterocyklicznego znacznie obniŜa aktywność biologiczną.

Inny zespół badaczy rozbudował monoester kwasu N'-izonikotynoiloditiokarbazowego przez wprowadzenie do cząsteczki ugrupowania estrowego i heterocyklicznego pierścienia tiazolu. Testy in vitro wobec szczepu Mycobacterium tuberculosis H37Rv nie potwierdziły jednak aktywności przeciwprątkowej otrzymanych związków.⁴¹

Geometria i konformacja związków o strukturze kwasu N'-[1-amino-1-(heteroarylo)-metylideno]ditiokarbazowego jest przedmiotem badań od lat 90 - tych ubiegłego wieku.

Analiza spektroskopowa ¹H NMR i ¹³C NMR S,S'-diestrów metylowych kwasów N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego oraz N'-[1-(N-fenyloamino)-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego potwierdziła obecność izomerów, lecz jednoznaczne określenie ich geometrii było niemoŜliwe. W celu ustalenia dominującej formy tautomerycznej i konformacji, przeprowadzono analizę rentgenograficzną, która wykazała, iŜ oba związki występują w przedstawionej poniŜej odmianie tautomerycznej oraz charakteryzują się w przybliŜeniu budową płaską. Pomimo wewnątrzcząsteczkowych wiązań

akceptorem, zauwaŜalne jest odchylenie od formy koplanarnej przez skręcenie pierścienia heterocyklicznego o kąt 11 - 14° w stosunku do płaskiego fragmentu 2,3,5-triaza-1,3-pentadienu.⁴²

Preferowana forma tautomeryczna stabilizowana wewnątrzcząsteczkowym wiązaniem wodorowym.

W toku syntez uzyskano dwiema metodami monoester metylowy kwasu N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego, poprzez przeprowadzenie karbonitrylu w iminoester, który w reakcji z metylotiosemikarbazydem daje poŜądany produkt lub w reakcji metylowanego adduktu disiarczku węgla do amidrazonu.⁴³ Analiza ¹H NMR wykonana w deuterowanym acetonie w temperaturze pokojowej wykazała istnienie dwóch form tautomerycznych w stosunku 5:4. Rozpatrywano trzy typy wewnątrzcząsteczkowych przemian: tautomeryzację, konfigurację względem wiązania C=N oraz konformację. Na podstawie analizy spektroskopowej HSQC wskazano dwie moŜliwe formy tautomeryczne A i B.

Formy tautomeryczne kwasu N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego na podstawie analizy spektroskopowej HSQC.

W dalszej kolejności dokonano dwóch analiz: ¹H-¹³C HMBC, która wykazała oddziaływanie pomiędzy protonem przy azocie hydrazydowym NH i węglem C(2) pierścienia pirydyny oraz ¹H-¹⁵N HMBC, wykazującą oddziaływanie protonu hydrazydowego NH z azotem grupy NH2 i azotem pierścienia pirydyny.

Korelacja ¹H-¹³C i ¹H-¹⁵N w widmie HMBC estru metylowego kwasu N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego.

W celu ustalenia, która z form jest obecna w postaci krystalicznej, przeprowadzono analizę rentgenograficzną wykazującą istnienie związku w dipolarnej konfiguracji Z z silnymi wewnątrzcząsteczkowymi wiązaniami wodorowymi, stabilizującymi obserwowaną strukturę płaską.

Dipolarna konfiguracja Z estru metylowego kwasu N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno)ditiokarbazowego.

Związek ten wykazał wysoką aktywność bakteriostatyczną wobec Mycobacterium tuberculosis H₃₇Rv (MIC = 3,13 µg/ml).

Analiza geometryczna moŜliwych konformerów powyŜszego związku wykazała, Ŝe najwaŜniejszym współczynnikiem stabilności jest konformacja względem pojedynczego wiązania N-N, co potencjalnie formułuje wiązania wodorowe między protonem azotu N3 (forma pierwsza) lub protonem pierwszorzędowej grupy NH₂ (forma druga) a azotem pirydyny. Struktura krystaliczna uwidacznia występowanie związku w formie pierwszej.

Przypuszczano, iŜ zastąpienie pirydyny w estrze metylowym kwasu N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego halogenopirazyną, której budowa równieŜ umoŜliwia tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań wodorowych, nie spowoduje zniesienia aktywności tuberkulostatycznej. W testach in vitro wartość MIC dla oznaczonych szczepów: standardowego H37Rv, 192 - wraŜliwego i 210 – opornego na stosowane leki wynosiła 32 µg/ml, co wskazuje na umiarkowane działanie przeciwprątkowe tego związku.⁴⁴

N N

Cl NH2

N NH S SCH₃

Ester metylowy kwasu N'-[1-amino-1-(6-chloropirazyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego.

Konsekwentne badania nad pochodnymi heterocyklicznych amidrazonów doprowadziły do syntezy serii N'-tioamido-podstawionych 2-pirazynokarboksyamidrazonów o spodziewanej aktywności przeciwprątkowej.⁴⁵ Testy in vitro przeprowadzone względem 10 szczepów Mycobacterium tuberculosis wskazują na znaczącą aktywność ocenianych pochodnych (MIC = 8 µg/ml).

Struktury N’-tioamido-podstawionych pirazynokarboksyamidrazonów.

Biorąc pod uwagę podobieństwo otrzymanych związków do estru metylowego kwasu N'-[1-amino-1-(pirydyn-2-ylo)-metylideno]ditiokarbazowego, którego analiza krystalograficzna wykazała silne wiązania wodorowe utrzymujące planarność całej cząsteczki, podjęto próbę zbadania oddziaływań wodorowych w krystalicznej formie N'-[tiokarbonylo-(4-fenylopiperazyno)]pirazyno-2-karboksyamidrazonu.⁴⁶ Potwierdzono silne oddziaływania pomiędzy wiązaniami S1-C1 i C1-N2 jednej strony łańcucha oraz N3-C4 i C4-N5 przeciwnej strony łańcucha. Rezultatem tych oddziaływań jest dodatni ładunek na azocie N3 i dwa wewnątrzcząsteczkowe wiązania wodorowe. Proton przy azocie N3 odgrywa kluczową rolę jako donor do wiązania z siarką S1 oraz z azotem pirazyny, co zapobiega rotacji wokół wiązań pojedynczych C4-C2’ i N2-N3. Płaską strukturę potwierdza fakt, iŜ wartość skręcenia kątowego jest mniejsza niŜ ± 9°.

N'-[Tiokarbonylo-(4-fenylopiperazyno)]pirazyno-2-karboksyamidrazon.

R¹ H H H OCH₃ OCH₃

R²