Nowotwór pęcherza moczowego

Rak pęcherza moczowego jest jednym z coraz częściej wykrywanych nowotworów [BorSie04]. Występuje on przeważnie u osób w wieku starszym (60 -70 lat) i stanowi czwarty co do częstości występowania nowotwór złośliwy u mężczyzn, a ósmy u kobiet. Guzy pęcherza można podzielić na kilka grup. Najczęstszym typem raka jest rak z nabłonka przejściowego (ang. transitional cell carcinoma) stanowiący 90% wszystkich przypadków. Kolejne istotne grupy to rak płaskonabłonkowy i rak gruczołowy [BorSie04].

Aktualnie są stosowane różne metody badań umożliwiające rozpoznanie choroby: - posiew moczu (laboratoryjne testy na obecność bakterii),

- cytologia moczu (mikroskopowe badania komórek wyeliminowanych z pęcherza), - cytometria przepływowa (pomiar charakterystycznych fizycznych lub chemicznych

cech komórek),

- cystoskopia (badanie pęcherza moczowego przy użyciu wziernika),

- biopsja (pobranie fragmentów tkanki do analizy komórek rakowych i identyfikacji typu nowotworu),

- urografia dożylna (wstrzykiwanie do krwiobiegu kontrastowego barwnika i przeprowadzenie zdjęcia rentgenowskiego) [BorCon03, wAbot10].

Interesującym kierunkiem badań we wczesnej diagnostyce nowotworów jest zastosowanie biomarkerów. Biomarkery są to substancje produkowane przez nowotwory lub wytwarzane przez organizm w reakcji na obecność nowotworów w organizmie. Wykrywanie komórek rakowych z wykorzystaniem biomarkerów możliwe jest poprzez badanie krwi, moczu czy tkanki. Analizy takie mogą być powiązane z innymi badaniami jak cystoskopia, gdy monitorowanie pewnych części układu moczowego jest utrudnione bądź niemożliwe [BorCon03].

Jedną z metod wykorzystania markerów jest fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) [OliFre05,HubKul01]. Do zastosowania metody FISH wymagane jest rozdzielenie podwójnej helisy (denaturacja DNA, rys. 4.1) poprzez wysuszenie preparatu na szkiełku mikroskopowym. W metodzie FISH markerem jest sekwencja DNA, którą uwidacznia się przez hybrydyzację z sondą fluorescencyjną. Zastosowanie znaczników o różnych kolorach emisji, umożliwiło hybrydyzację wielu sond z jednym chromosomem. Znaczniki fluorescencyjne o różnych kolorach (różne długości fal) włącza się do nukleotydów lub

bezpośrednio do cząsteczki DNA. Do wykrywania wykorzystywane są mikroskopy fluorescencyjne [Bro01,ZajWis03,OliFre05].

Rys. 4.1. Schemat FISH [opracowano na podstawie OliFre05]

W preparatach mikroskopowych nie są obserwowalne naturalne obrazy komórek. W wyniku różnych procedur i czynności związanych z przygotowaniem preparatu (np. utrwalenie, odwodnienie, zjawiska fizykochemiczne i reakcje podczas barwienia) komórki, ulegają zmianom i deformacjom. Pojedyncze komórki są prawie przezroczyste i muszą być odpowiednio uwidocznione, aby były dostrzegalne pod mikroskopem. Stosuje się w tym celu różne sposoby barwienia, obejmujące cały zakres światła widzialnego. Każdy z nich w odmienny sposób uwidacznia poszczególne składniki komórek co wpływa na ich formę morfologiczną. W przypadku metody FISH zastosowano barwnik DAPI (dichlorowodorek 4,6-diamino-2-fenyloindolu) [DanRon05,DanRon07,ZieStr03].

4.2.1. Obrazowanie przy użyciu systemu skaningowego

W diagnostyce mikroskopowej wykorzystuje się tzw. systemy skaningowe. Przykładem systemu skaningowego jest „Metafer” firmy „MetaSystems” (rys. 4.2) [PleLoe01,Guz05,HubLor98,HubKul01,GuzSzy06]. Głównymi elementami systemu „Metafer” są: kamera CCD zamontowana na motorycznym mikroskopie oraz automatyczny, 8-mio pozycyjny stół skaningowy. W rozbudowanej wersji dostępny jest także automatyczny magazyn SlideFeeder, który obsługuje analizę od 80 do 880 preparatów. Składa się on z centralnego podajnika, który pobiera preparaty z elementów magazynujących i przekazuje je na stół motoryczny.

Magazyn preparatów Slide Feeder x80 Mikroskop motoryczny (oś Z) Stół motoryczny (oś X,Y) Kamera CCD ^{Komputer PC z} oprogramowaniem Metafer Podajnik preparatów

Rys. 4.2. Komponenty systemu "Metafer" ⁵ [Guz05]

System „Metafer” rozpoczyna analizę znajdującego się pod mikroskopem preparatu od jego podziału na pola skanowania. Wielkość pola wyrażona jest w mikrometrach i jest stosunkiem rozdzielczości kamery CCD do powiększenia użytego w mikroskopie. Ostrość preparatu dobierana jest automatycznie. Pobieranie obrazu odbywa się na podstawie wcześniej zdefiniowanych parametrów skanowania (powiększenie, liczba detektorów FPA (ang. Focal Plane Array), liczba kanałów kolorów i in.). Obraz jest pobierany osobno dla każdego ze zdefiniowanych kanałów kolorów (rys. 4.3).

Rys. 4.3. Pobieranie obrazu za pomocą mikroskopu fluorescenycjnego⁵

Pobrany za pomocą kamery obraz pola preparatu przesyłany jest do komputera. Metodyka wykonywania rozmazów cytologicznych powoduje, że komórki często tworzą zlepy, grupy, skupiska, wzajemnie nakładając się na siebie [ZieStr03]. Największe z nich mają tendencję do rozmieszczania się na obwodzie preparatu. Przy analizie powinno się brać pod uwagę wszystkie pola, gdyż losowy wybór pól może prowadzić do zafałszowań statystycznych dotyczących wskaźników ilościowych opisujących badaną populację komórkową.

5

Przykłady obrazów pojedynczych pól preparatów zamieszczono na rysunkach 4.4 i 4.5. Na rysunkach tych okręgami zaznaczono komórki nowotworowe.

Rys. 4.4 Obrazy pojedynczego pola preparatu widoczne w kanale DAPI przy 10-krotnym powiększeniu.

Rysunek 4.4 przedstawia obrazy dwóch pól preparatu widoczne tylko w kanale DAPI, przy skanowaniu z 10-krotnym powiększeniem. Kanał ten jest widziany jako niebieski. Analiza kanału DAPI służy do wyszukiwania potencjalnych komórek nowotworowych na podstawie kształtu, obszaru, intensywności i innych cech.

Wydzielenie komórek nowotworowych w preparacie badanym w kanale DAPI stanowi wstępną diagnostykę nowotworu pęcherza moczowego. Obiekty wskazane na pierwszym etapie są następnie badane przy pomocy metody FISH.

Rys. 4.5 Obrazy pojedynczego pola preparatu widoczne we wszystkich kanałach kolorów przy 40-krotnym powiększeniu

Na rys 4.5. zamieszczono obrazy dwóch zeskanowanych pól widoczne w różnych kanałach kolorów. Naświetlanie kanałami kolorów umożliwia zliczanie sygnałów, czyli tzw. spotów. W zależności od liczby spotów określa się czy komórka jest nowotworowa.

Liczba komórek w analizowanych preparatach może być bardzo duża. Przy skanowaniu każdego pola preparatu różnymi kolorami, badanie trwałoby kilka, a nawet kilkanaście godzin. Dlatego ważnym etapem jest skanowanie wstępne w kanale DAPI, które pozwala na wybranie pól preparatu w których mogą znajdować się komórki nowotworowe.

Do automatycznej oceny typu komórki wykorzystuje się parametry morfometryczne. Każdy parametr morfometryczny stanowi liczbowy opis obiektu morfologicznego (rys. 4.6). Może on dotyczyć takich właściwości jak liczebność obiektów, ich wielkość, kształt, właściwości optyczne, tekstura czy topologia. Wybór parametrów zależy od rodzaju badanego materiału genetycznego.

Rys. 4.6. Przykładowe parametry geometryczne obiektów: a) pole powierzchni b) obwód c) obwód wypukły [StrzZie02]

Podstawowymi parametrami morfometrycznymi w diagnostyce mikroskopowej komórek pęcherza moczowego, określonymi przez ekspertów, są: całkowita/względna powierzchnia komórki (ang. absolute/relative cell area), całkowita/względna/ /radialna/centralna intensywność komórki (ang. absolute/ relative/radial/center cell intensity), obwód (ang. Circumference), współczynnik kształtu (ang. aspect ratio), nieregularność (ang. irregularity), kolistość (ang. roundness), głębia wklęsłości (ang. concavity depth), promień obrysu (ang. contour radius), ziarnistość (ang. granularity), centralny/radialny moment intensywności (ang. center/radial distance moment), oraz liczba obiektów na określonym poziomie intensywności (ang. the number of objects at a given intensity). Zestaw parametrów powiększony jest o współczynniki, wartości średnie i odchylenia parametrów podstawowych.

Ostatecznie uzyskano zbiór danych opisany przez 212 parametrów, nazywanych dalej cechami. Dziedziną każdej cechy jest zbiór liczb zmiennoprzecinkowych, z dokładnością zapisu do 10-ciu cyfr znaczących. Każdy z obiektów występujący w zbiorze przypisano do jednej z dwóch klas: komórki zdrowe (ozn. „0”) lub komórki nowotworowe (ozn. „1”). Ocena przynależności obiektów do odpowiedniej klasy została przeprowadzona przez eksperta, który w badanym zbiorze wskazał tylko 640 komórek nowotworowych. Jest to istotna uwaga dla analizowanego zbioru, gdyż poszukiwana klasa (komórki nowotworowe) stanowi niecałe 3% wszystkich dostępnych danych.

Analiza komórek w polu preparatu, pod kątem wyznaczenia wartości każdej z cech, jest kosztowna czasowo. Im mniejsza liczba cech, będących kryterium oceny komórki, tym proces skanowania wstępnego będzie szybszy. Dlatego poszukuje się metod pozwalających na wybór takich cech lub zbiorów cech, które pozwalają na trafną ocenę typu komórek. W załączniku B zestawiono cechy komórek wyznaczone w systemie „Metafer”.