OCZYSZCZANIE PRODUKTU SUROWEGO M-DĄ WYMIANY JONOWEJ I ADSORPCJI

13. ROZTWÓR PRODUKTU CZYSTEGO 14-, KRYSTALIZACJA PRODUKTU KOŃCOWEGO

1 6 9

1 7 0

-natur a l n ym . N a w e t przy b ardzo o s t r o ż n y m w y d z i e l a n i u n i e u ni knio ne jest r o z e r w a n i e s ł a b s z y c h wi ą z a ń ł ą c z ą c y c h c z ą s t e c z k i bia ł k a z innymi e l em e n t a m i komórki, a a k t y w n o ś ć k a t a l i t y c z n a białek e n z y m a t y c z n y c h za l e ż y nie tylko od o b e c ności o d p o w i e d n i c h grup f u n k cy j ny c h , a le w głów n e j mi erz e od k o n f o r m a c j i c a łości makro- s t r u k t u r y b i a ł k a w a r u n k u j ą c e j jego t r ó j w y m i a r o w ą strukturę. Budowa s t r u k t u r a l n a b ia ł k a a k t y w n e g o ok r e ś l a w z n a c z n e j m i e r z e jego w ł a ś c i w o ś c i chemiczne, f i z y k o c h e m i c z n e i bio l o g i c z n e , a jej u s z k o d z e n i e p r owadzi do zmian, a naw e t do u t r a t y niekt ó r y c h w ł a ś c i w o ś c i r o d z i m e g o białka, u l e g a j ą c e g o c z ę s t o procesowi d e n a t u r a c j i .

W tej s ytuacji m e m b r a n y oraz t e c h n o l o g i a c i ś n i e n i o w e g o r o z d z i a ­ łu m e m b r a n o w e g o stały się o b i e k t e m w z r a s t a j ą c e g o z a i n t e r e s o w a n i a jako s p o s ó b u m o ż l i w i a j ą c y r oz w i ą z a n i e w i e l u p o w a ż n y c h problemów.

P r o c e s u l t r a f i l t r a c j i , będąc techni ką " n i e d e s t r u k c y j n ą ” , może s t a n o w i ć p o ł ą c z e n i e p r o c e s ó w o c z y s z ć z a n i a i z a t ę ż a n i a białek e n z y m a t y c z n y c h w w y n i k u separacji m o le kul arnej. P o n i e w a ż masy c z ą s t e c z k o w e e n z y m ó w w a h a j ą się w g r a n i ć a o h .20 0 0 0 - 2 0 0 000 [85, 109], a "cut-o f f" m e m b r a n u l t r a f i l t r a c y j n y c h wynosi ok. 10 000 - m o g ą o n e być s to s o w a n e do o d z y s k i w a n i a i z a t ę ż a n i a enzymów.

M e t o d a ta p o z w a l a na u z y s k a n i e k o n c e n t r a t ó w o a k t y w n o ś c i k i l k a ­ k r o t n i e w y ż s z e j od a k tywności r o z t w o r u w y j ś c i o w e g o p r z y r ó w n o ­ c z e s n y m u s u n i ę c i u co n ajmniej p o ł o w y m a ł o c z ą s t e c z k o w y c h z w i ą zków n i e o r g a n i c z n y c h , s t a n o w i ą c y c h z a n i e c z y s z c z e n i a t e c h n i c z n y c h p r e p a r a t ó w enzymatycznych. O efekt ywn ości p r o c e s u ul t r a f i l t r a c j i d e c y d u j ą p r z e d e wszystkim: wła ściwości f i z y k o c h e m i c z n e w y k o r z y s t y ­ w a n y c h membran, dobór modułu, z a s t o s o w a n i e o p t y m a l n e g o schem atu r e a l i z a c j i p r o c e s u (eksploatacja w u k ł a d z i e c i ą g ł y m lub

szarżo 1 7 1 szarżo

-wym) o r a z w ł a ś c i w y d o b ó r p a r a m e t r ó w e k s p l o a t a c y j n y c h u k ł a d u m e m ­ branowego. Ist ni e je w i ę c b e z w z g l ę d n a k o n i e c z n o ś ć d o ś w i a d c z a l n e g o o p t y m a l i z o w a n i a t a k i c h w i e l k o ś c i i pa rametrów, jak: c i ś n i e n i e robocze, p r ę d k o ś ć lini o w a p r z e p ł y w u r o z t w o r u n a d p o w i e r z c h n i ą membrany, t e mp e r at u ra , pH, a także o k r e ś l e n i e s z y b k o ś c i filt racji w fu n k c j i s t o p n i a o d z y s k u f i l t r a t u ( z a tęż anie r o ztworu). N a l e ż y zw r ó c i ć s z c z e g ó l n ą u w a g ę na fakt, że wyż e j w y m i e n i o n e p a r a m e t r y op r ócz tego, że w z a s a d n i c z y s p o s ó b c h a r a k t e r y z u j ą p r z e b i e g p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i , mo g ą r ó w n i e ż p r z y c z y n i ć się do d e z a k t y w a c j i p o d d a w a n y c h fil tra cji t e c h n i c z n y c h b i a ł e k e n z y m a t y c z n y c h .

9.1. ME M BR A N Y, M O D U Ł Y M E M B R A N O W E I S P O S Ó B P R O W A D Z E N I A P R O C E S U

S t o s o w a n e w u l t r a f i l t r a c j i p r o d u k t ó w b i o l o g i c z n y c h m e m b r a n y a s y m e t r y c z n e o t r z y m y w a n e są zw y k l e z p o l i m e r ó w c e l u l o z o w y c h (octan ce l u l o z y, a z o t a n c e l u l o z y i inne) o r a z n i e c e l u l o z o w y c h (polisulfon, p o l i ( c h l o r e k winylu), p o l i a k r y l o n i t r y l , poliuretan y, p o l i w ę g l a n y , p o l i t l e n e k fenylenu).

O g ó l n a z a s a d a d o b o r u m e m b r a n y do d a n e g o p r o c e s u p ow inn a u w z g l ę d n i a ć p r z e d e w s z y s t k i m n a s t ę p u j ą c e c z y n n i k i [112]:

- r o z k ł a d p o r ó w i s t r u k t u r ę w e w n ę t r z n ą membrany,

- p o w i n o w a c t w o c h e m i c z n e i z d o l n o ś ć a d s o r p c y j n ą m a t e r i a ł u p o l i ­ m e r o w e g o m e m b r a n y w s t o s u n k u do enzymów,

- o d p o r n o ś ć na d z i a ł a n i e c z y n n i k ó w m y j ą c y c h i d e z y n f e k u j ą c y c h , - h y d r o f i l o w o ś ć i h y d r o f o b o w o ś ó ,

- w y t r z y m a ł o ś ć m ec haniczną.

Z a s t o s o w a n i e m e m b r a n s y m e t r y c z n y c h i a s y m e t r y c z n y c h do o d d z i e

1 7 2

-lania e n z y m ó w jest z w i ą z a n e ze z nac z n y m i ogranicze niami sp o w o d o w a n y m i p o w l e k a n i e m sub stanc jam i k o loidalnymi. Po pewnym c z a s i e ich w y d a j n o ś ć m oże spaść do w a r t o ś c i nieopłac aln ej e ko no micznie. Z n a c z n y w p ł y w na to z j a w i s k o m a j ą w ł a s n o ś c i hydro- f i l o w o - h y d r o f o b o w e membran. M e m b r a n y o w ł a s n o ś c i a c h h y d r o f i łowyc h są b a r d z i e j o d p o r n e na p o w l e k a n i e sub s t a n c j a m i w y s t ę p u j ą c y m i w roztworze. B a d a n i a j e d n o z n a c z n i e p o t w i e r d z i ł y założenia, że za p o w l e k a n i e m e m b r a n s u b s t a n cj ami obecnymi w r o z t w o r a c h b i o l o g i c z ­ n y c h jest o d p o w i e d z i a l n y p ro c e s ad sorpcji (a n a w e t denaturacja) b i a ł e k na po w i e r z c h n i membrany. A d s o r p c j a z a c h o d z i dzięki w z a j e m n e m u o d d z i a ł y w a n i u e l e k t r o s t a t y c z n e m u i h y d r o f o b o w e m u p o m i ę d z y fra g me n t a m i b i a ł e k a ś cianami p o r ó w m e m b r a n y [155], K l u ć z e m do z w i ę k s z e n i a o d po rno ści m e m b r a n na p o w l e k a n i e jest w y t w o r z e n i e m e m b r a n h y d r o f i l o w y c h o m i n i m a l n y m ł a d u n k u e l e k t r o ­ s t a t y c z n y m powierzchni. R o z w i ą z a n i e m p r o b l e m u z w i ę k s z e n i a hydro- filo w oś c i m e m b r a n o t r z y m y w a n y c h z s u r o w c ó w h y d r o f o b o w y c h m o ż e być w p r o w a d z e n i e do n i c h h y d r o f i l o w y c h g r u p bocznych. P r o p o n u j e się d w i e drogi u r z e c z y w i s t n i e n i a tej m e t o d y [31]:

- w p r o w a d z e n i e za p o m o c ą reakcji c h e m i c z n y c h g r u p h y d r o f i ł o w y c h do su r o w c a poli m er o w e g o , a n a s t ę p n i e p r e p a r o w a n i e membran, - s z c z e p i e n i e g o t o w y c h m e m b r a n h y d r o f o b o w y c h s u b s t a n c j a m i z a w i e ­

rają c ym i g r u p y hydrofilowe.

O b e c n i e p r o w a d z o n e są b ada nia nad o p r a c o w a n i e m m e m b r a n o w ł a s n o ś c i a c h h ydrofiłowych. Nylon, k o p o l i m e r y p o l i ( t l e n e k etylenu) - p o l i u r e t a n oraz k o p o l i m e r y opa r t e na p o l i a k r y l o n i t r y l u [42]

w y m i e n i a się jako surowce, z k t ó r y c h o t r z y m a ć m o ż n a m e m b rany o d p o r n e na p o w l e k a n i e s u b s t ancja mi koloidalnymi. Z a p r z y s z ł o ś c i o ­

1 7 3

-we dla b i o s e p a r a c j i u w a ż a się m e m b r a n y ceram iczne, z uwagi na dużą o dpor n o ś ć c h e m i c z n ą i w ł a s n o ści h y d r o f i ł o w e [40],

O b e c n i e p a n u j e pogląd, że pro c e s u l t r a f i l t r a c y j n e g o z a t ę ż a n i a i o c z y s z c z a n i a e n z y m ó w z c i e c z y p o f e r m e n t a c y j n y c h p o w i n n o p r o w a d z i ć się w p r z e p ł y w i e k r z y ż o w y m (skrośnym) (a n g . c r o s s - f I o w u l t r a f i l t r a t i o n ) [40], Na r y s . 9,3 p r z e d s t a w i o n o z a s a d ę p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i p r o w a d z o n e g o w u k ł a d z i e skrośnym, w k t ó r y m s t r um ie ń c i e c z y p o d d a w a n e j pr ocesowi u l t r a f i l t r a c j i p r z e p ł y w a r ó w n o l e g l e do p o wi e r z c h n i m e m b r a n y i k r z y ż u j e się ze s t r u m i e n i e m p e r m e a t u .

P E R M E A T

P E R M E A T P E R M E A T

Rys. 9.3. S c h e m a t p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i w u k ł a d z i e s k r o ś n y m Fig. 9.3. S c h e m e of c r o s s - f l o w u l t r a f i l t r a t i o n

W w i ę k s z o ś c i z a s t o s o w a ń ul t r a f i l t r a c j i do o c z y s z c z a n i a i z a t ę ż a n i a e n z y m ó w p o l a r y z a c j a s t ę ż e n i o w a s tanowi z j a w i s k o o g r a n i ­ c z a j ą c e s z y b k o ś ć procesu, a p r o j e k t o w a n i e u r z ą d z e ń p o win no u w z g l ę d n i a ć z m n i e j s z e n i e jego u j e m n y c h skutków. N a l e ż y w i ę c tak d o b r a ć g e o m e t r i ę u r z ą d z e ń oraz w aru nki e k s p l o a t a c y j n e , by

1 7 4

-z w i ę k s -z y ć s z y b k o ś ć d o p r o w a d z a n i a r o z t w o r u w k i e r u n k u do p o w i e r z c h n i membrany. J a k już z a z n a c z y l i ś m y wcześniej, jednym z n a j w a ż n i e j s z y c h parametrów, k tó r e n a l e ż y u w z g l ę d n i ć przy p r o j e k t o w a n i u m o d u ł ó w membranowych, jest d o b r a n i e o d p o w i e d n i c h w a r u n k ó w h y d r o d y n a m i c z n y c h p r z e p ł y w u nad p o w i e r z c h n i ą membrany.

O b e c n i e s t o su j e się s z e r e g konst ruk cji m o d u ł ó w u l t r a f i l t r a c y j n y c h r ó ż n i ą c y c h się w a r u n k a m i p r z e p ł y w u roztworu, c i ś n i e n i e m roboczym o raz kosztami. W z a s t o s o w a n i u u l t r a f i l t r a c j i do o c z y s z c z a n i a i z a t ę ż a n i a e n z y m ó w naj b a r d ziej o d p o w i e d n i e są m o d u ł y rurowe, k a p i l a r n e i p ł y t o w o - r a m o w e , u m o ż l i w i a j ą c e p r o w a d z e n i e p r o c e s u w u k ł a d z i e s k r o ś n y m i z a p e w n i a j ą c e n a j o d p o w i e d n i e j s z e w a runki h y d r o ­ d y n a m i c z n e p r z e p ł y w u strumieni w p r o c e s i e u l t r a f i l t r a c j i . W k o n ­ figu r a c j i r u r o we j n a l e ż y tak do b r a ć p a r a m e t r y procesu, by pr zepływ miał c h a r a k t e r burzliwy, podczas g d y w r o z w i ą z a n i a c h p ł y t o w o - r a - m o w y c h i k a p i l a r n y c h - laminarny.

Is t o tn y m z a g a d n i e n i e m w p l a n o w a n i u z a s t o s o w a n i a ul t r a f i l t r a c j i do o c z y s z c z a n i a i z a t ę ż a n i a e n z y m ó w jest w y b ó r o p t y m a l n e g o s c h e ­ m a t u r e a l i z a cj i procesu. W zale żno ści od p r o j e k t o w a n y c h w a r u n k ó w m o ż l i w a jest p r a c a w u k ł a dzi e c i ą g ł y m lub też e k s p l o a t a c j a s z a r ż o w a (rozdział 5.1). N a j c zęś ciej s t o s u j e się s z a r ż o w y układ p r o w a d z e n i a p r o c e s u ze w z g l ę d u na w y m a g a n e na ogół w y s oki e l i n i o w e p r ęd k o ś ci r o z t w o r u nad p o w i e r z c h n i ą membrany. E k s p l o a t a ­ cj a s z a r ż o w a jest p r e f e r o w a n a również z tego powodu, że w wielu p r z y p a d k a c h r o zt w ó r nie m oże być ze w z g l ę d ó w t e c h n o l o g i c z n y c h d o s t a r c z a n y w s p o s ó b ciągły. Jeśli w t r a k c i e u l t r a f i l t r a c y j n e g o z a t ę ż a n i a e n z y m ó w szy b k o ś ć filtracji z n a c z n i e zmaleje, a w y m a g a n y jest o d z y s k p r o d u k t u k o ń c o w e g o o z w i ę k s z o n y m s t o p n i u czystości, c e l o w e jest w ł ą c z e n i e do sch ema tu t e c h n o l o g i c z n e g o p r o c e s u

dia 1 7 5 dia

1 7 6

-n a m i c z -n y c h w ł a s -n o ś c i u k ł a d u mem bra-nowego. P a r a m e t r te-n wpływa z a r ó w n o na w ł as n o ś c i t r a n s p o r t o w e i s e p a r a c y j n e membran p o l i m e r o w y c h , jak i na p r z e b i e g p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i , określając t y m s a m y m jego efektywność. Pod w p ł y w e m w y s o k i e g o ciśnienia m e m b r a n y ulegają, z w ł a s z c z a w p o c z ą t k o w y m o k r e s i e pracy, trwałej d e f o r ma c j i , p o l e g a j ą c e j na z b i j a n i u (kompresji) ich porowatej struktury. E f e k t ten jest tr w a ł y i n a w e t po u p ł y w i e dłuż szego c z a s u od m o m e n t u o b n i ż e n i a c i ś n i e n i a c h a r a k t e r y s t y k a me mbr a n y różni się w y r a ź n i e od jej fo rmy w y j ści owej. O t r z y m a n e dane e k s p e r y m e n t a l n e w y k a z u j ą [50,51], że p o d a t n o ś ć na k o m p r e s j ę m e m ­ b r a n o k r e ś l a p o l e p o w i erzchni pętli h i s t e r e z y o p i s a n e krzywą J = f (A P ) p r z y st o p n i o w y m w z r o ś c i e ciśnienia, a n s t ę p n i e przy k o l e j n y m jego obniżaniu. Na rys. 9.4 z o b r a z o w a n o r ó ż n i c e w k s z t a ł c i e pętli h i s t e r e z y dla tego sam ego r o d z a j u membran, lecz r ó ż n i ą c y c h s i ę z w ar t o ś c i ą s t r u k t u r y i k i e r u n k i e m u ł o ż e n i a w a rs twy n a s k ó r k o w e j w s t o s u n k u do r o z d z i e l a n e g o roztworu. M e m b r a n y zwarte c h a r a k t e r y z u j e m n i e j s z a p o w i e r z c h n i a pętli h i s t e r e z y i w i ęks za o d p o r n o ś ć na c i ś n i e n i o w ą k o m p r e s j ę porów. W p r z y p a d k u m e mb ran o t w a r t y c h o b s e r w u j e się z n aczn e z w i ę k s z e n i e p o l a histerezy, a p o d c z a s ich p r a c y ciągłej z n a c z n i e s z y b s z y s p a d e k szybkości filtracji. M a k s i m u m krzywej p r z e p u s z c z a l n o ś c i t ł u m a c z y się tym, ż e w z r o s t c i ś n i e n i a w y w o ł u je z m n i e j s z e n i e się ś r e d n i c y p o r ó w w w a r s t w i e aktywnej, w w y n i k u cze go z n a c z n i e m a l e j e e f e k t y w n a p o w i e r z c h n i a membran.

S t o s o w a n i e w p r o c e s i e u l t ra filtr acj i e n z y m ó w w y s o k i c h c iśnie ń w p ł y w a w p r a w d z i e k o r z y s t n i e na s z y b koś ć filtracji, jednak po p r z e k r o c z e n i u p ewnej jego wartości ( c i śnien ie g r a n i c z n e ) w i e lkość s t r u m i e n i a p e r m e a t u nie jest od niego u z a l e ż n i o n a (ry s . 9.5).

Rys. 9

1 7 8

-Z j a w i s k o to t ł u m a c z y się p o w s t a w a n i e m w a r s t w y ż e l o w e j e n z y m u tuż n a d p o w i e r z c h n i ą membrany, której op ó r h y d r a u l i c z n y jest tak duży, że m i m o z w i ę k s z a n i a c i ś n i e n i a s z y b k o ś ć p r o c e s u nie ulega zmianie. W i e l k o ś ć c i ś n i e n i a g r a n i c z n e g o i s z y b k o ś ć filtracji p o w i ą z a n e są o p o r e m s t a w i a n y m p r z e z m e m b r a n ę ora z oporem w y w o ł a n y m z j a w i s k i e m p o l a r yza cji st ęż e n i o w e j [85,155],

Rys. 9.5. W p ł y w c i ś n i e n i a na s zybkość fi ltr a c j i i s t o p i e ń z a t r z y ­ m a n i a b i a ł e k dla r ó żny ch m e m b r a n a c h u l t r a f i l t r a c y j n y ch : 1. h e m o g l o b i n a (UAM-400)

2. l i z o z y m (UAM-300) 3. p e p s y n a (UAM-300) 4. p e p s y n a (UAM-400)

Fig. 9.5. I n fl uence of p r e s s u r e on f i l t r a t i o n r a t e a n d r é t e n t i o n c o e f f i c i e n t of p r o t e i n s for v a r i o u s u l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n e s

1. h é m o g l o b i n e (UAM-400) 2. l i s o z y m e (UAM-300) 3. p e p s i n e (UAM-300) 4. p e p s y n e (UAM-400)

P a r a m e t r e m w p ł y w a j ą c y m w z a s a d n i c z y s p o s ó b na w s k a ź n i k i e f e k ­ tywn oś c i u l t r a f i l t r a c y j n e j me t o d y o d z y s k i w a n i a b i a ł e k b i o l o g i c z ­

1 7 9

-nie ak t y w n y c h , o p r ó c z stosowanego, w p r o c e s i e ciśn i e n i a , jest także l i n i o w a p r ę d k o ś ć p r z e p ł y w u r o z t w o r u e n z y m a t y c z n e g o nad p o w i e r z c h n i ą m e m brany, z w ł a s z c z a jeżeli p r o c e s p r o w a d z i się w r u r o w e j k o n f i g u r a c j i m e m b r a n w module. Z a l e ż n o ś ć szybkości f ilt r ac j i od l i n i ow e j p r ę d kości p r z e p ł y w u r o z t w o r u n a d p o w i e r z ­ chnią m e m b r a n y p o d a j e r ó w n a n i e [114,120]:

x y

j M (u ) • (P.)„. l o g ( C g / C s ) (78)

( v ) a

gdzie: U - l i n i o w a p r ę d k o ś ć p r z e p ł y w u r o z t w o r u n a d p o w i e r z c h n i ą me m b rany,

D - w s p ó ł c z y n n i k dyfuzji, v - l e p k o ś ć kinematyczna,

Cg - s t ę ż e n i e subst a n c ji r o z p u s z c z o n e j w w a r s t w i e g r a n i c z ­ nej,

Cs - ś r e d n i e s t ę ż e n i e subs tancj i r o z p u s z c z o n e j w roztworze.

Z w i ę k s z a j ą c p r ę d k o ś ć p r z e p ł y w u r o z t w o r u na o b s z a r a c h p r z y l e g a ­ jących do p o w i e r z c h n i m e m b r a n y m o ż n a c z ę ś c i o w o z a p o b i e c t w o r z e n i u się w a r s t w y p o l a r y z a c y j n e j lub o g r a n i c z y ć ją. O s i ą g a się to albo p rz e z i n t e n s y w n e m i e s z a n i e c i e c z y n a d p o w i e r z c h n i ą m e m b r a n y w s t a t y c z n y c h u k ł a d a c h u l t r a f i l t r a c j i , a l b o s t o s u j ą c w y s o k i e prękoś- ci p r z e p ł y w u w u k ł a d a c h p r z epływowych. N a j p o w s z e c h n i e j s t o s o w a n y m s p o s o b e m z m n i e j s z e n i a e f e k t ó w p o l a r y z a c j i s t ę ż e n i o w e j w m o d u l e r u r o w y m jest z a p e w n i e n i e t u r b u l e n t n e g o p r z e p ł y w u c i e c z y przez z w i ę k s z e n i e l i n io w e j p r ędkości p r z e p ł y w u r o z t w o r u nad p o w i e r z c h n i ą membrany. G d y w a r t o ś ć l iczby R e y n o l d s a jest m n i e j s z a od w a r t o ś c i k r y t y c z n e j (Re<Rexr), w t e d y p r z e p ł y w jest uwarst wiony , n a t o m i a s t g d y l iczba R e y n o l d s a p r z e k r o c z y w a r t o ś ć krytyczną, m a m y do c z y n i e n i a z p r z e p ł y w e m burzliwym. J a k o w a r t o ś c i k r y t y c z n e

1 8 0

-l i c z b y R e y n o -l d s a w p r z y p a d k u p r z e p ł y w u t u r b u -l e n t n e g o przyjmuje

C h a r m i W o n g [38] okr eślili z a l e ż n o ś ć w p ł y w u liniowej p r ę d k o ś c i p r z e p ł y w u nad p o w i e r z c h n i ą m e m b r a n y r o z t w o r u białek e n z y m a t y c z n y c h na s t r a t y ich a k t ywnoś ci w w a r u n k a c h przepływu laminarnego. Wiadomo, że e n z y m y p o d d a n e s i ł o m ś c i n a j ą c y m ulegają c z ę ś c i o w e j d e z a kt y wa c j i s p o w o dowan ej p r a w d o p o d o b n i e n i s z c z e n i e m ich t r z e c i o r z ę d o w e j struktury. W y k o r z y s t u j ą c b a d a n i a wisko zyme- t r y c z n e o b l i c z y l i oni t e o r e t y c z n i e s t r a t y a k t y w n o ś c i białek a k t y w n y c h w s t r u m i e n i u r o z t w o r u p r z e p ł y w a j ą c y m p r z e z rurę c y l i n d r y c z n ą w u k ł a d z i e z recyr kulacją. I l oczyn średniej wa r t o ś c i s zy b k oś c i śc i n a n i a (yr ) i c z a s u p r z e b y w a n i a e n z y m ó w w u k ł a d z i e m o ż n a o b l i c z y ć z r ó w na nia [38]:

gdzie: R - o d l e g ł o ś ć of ś rodka rury, R^ - p r o m i e ń rury,

U - p r ę d k o ś ć strumienia, Q - n a t ę ż e n i e przepływu.

Zakła da j ąc , że:

się w a r t o ś c i 3 • 103< R e < l •10s.

R

( 7 ' t )śr (79)

Q

7 R = (P/L) - (R/27J) t R = L/U

( 8 0 ) (81) (82) 8 • 7) ■ L

or a z c a ł k u j ą c r ó w n a n i e (79) o t r z y m u j e m y zale żność:

(7•t )śr = ( 1 6 / 3 ) - (L/d) (83)

1 8 1

-gdzie: P - s p a d e k ciśnienia, L - d ł u g o ś ć rury,

ti - l e p k o ś ć dynamiczna, d - ś r e d n i c a rury.

Z r ó w n a n i a (83) wynika, że s tr a t a a k t y w n o ś c i e n z y m ó w w r o z t w o ­ rze p r z e p ł y w a j ą c y m p r z e z moduł, w k t ó r y m p a n u j ą w a r u n k i p r z e p ł y w u lamina r ne g o , n i e z a l e ż y od sz ybkości przepływu, a j e dynie od g e o m e t r i i rury. Na rys. 9.6 p r z e d s t a w i o n o s t r a t y a k ty wno ści r o z t w o r u katalazy, jako f u nk cję c z a s u i szybk o ś c i ścinania, a na rys. 9.7 z a l e ż n o ś ć strat a kt ywnoś ci o d c z a s u p r z e b y w a n i a r o z t w o r u e n z y m a t y c z n e g o w układzie. W a r t o ś ć ta z a l e ż y r ó w n i e ż od w i e l o k r o t n o ś c i p r z e p ł y w u r o z t w o r u p rz e z u k ł a d u l t r a f i l t r a c y j n y :

(7* t )śr = (16/3)- (L /d )•N (84)

gdzie: N - w i e l o k r o t n o ś ć p r z e p ł y w ó w pr zez j e d n o s t k ę testującą.

Z p r z e d s t a w i o n y c h w y k r e s ó w m oż n a wni oskować, że jeżeli iloc zyn (7’t )śr jest m n i e j s z y od 1 - 1 0 4, to nie w y s t ę p u j e z j a w i s k o d e z a k t y ­ wacji b i a ł e k aktywnych. D e c y d u j ą c y w p ł y w na w a r t o ś ć iloczy nu (7•t )śr ma w i e l k o ś ć N. B ę d z ie ona w u l t r a f i l t r a c j i z a w s z e b ardzo duża, p o n i e w a ż p r ę d k o ś ć l i niow a p r z e p ł y w u r o z t w o r ó w nad p o w i e r z c h n i ą m e m b r a n y p o w i n na k s z t a ł t o w a ć się na p o z i o m i e 3 m/s, l i m i t u j ą c t y m s a m y m ilość t ł o c z o n e g o p rz e z u k ł a d roztworu. Aby w i ę c z a p o b i e c d o d a t k o w e j d e z a k t y w a c j i b i a ł e k aktyw n y c h , w y w o łanej c z y n n i k a m i m e ch a n i c z n y m i , n a l e ż y k o n s t r u o w a ć m o d u ł y o jak n a j ­ w i ę k s z e j c z y n n e j p o w i e r z c h n i membran, co z d e c y d o w a n i e skróci czas t r w a n i a s a m e g o p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i .

W p r z y p a d k u k i e d y p r z e p ł y w r o z t w o r u nad p o w i e r z c h n i ą m e m b r a n y ma c h a r a k t e r burzliwy, to:

Q = ( 49/ 6 0 )-n-r2-Umax (85)

O POR.X /0~Ns/m

- 1 8 2

-Rys. 9.6. Z a l e ż n o ś ć s padku a kt ywnoś ci k a t a l a z y o d i l o c z y n u ś r e d ­ niej szybkości ś c i nan ia (?) or a z c z a s u p r z e b y w a n i a e n z y m u w u k ł a d z i e (t)

Fig. 9.6. D e p e n d e n c e of c a t a l y s e a c t i v i t y d r o p on a v er age shear rate (?) and h o l d u p t ime of e n z y m e in s y s t e m (t)

N a t o m i a s t w a rt o ś ć średniej wartości szy bko ści ś c i n a n i a i czas u p r z e b y w a n i a e n z y m ó w w u k ł a d z i e moż n a o k r e ś l i ć zależnością:

( y t ) i r = (86)

1 8 3

-• -> A P - R 3

gdzie: J = 6r] (87)

P o d s t a w i a j ą c za Q w a r t o ś ć ze w z o r u (86) o t r z y m u j e m y równanie:

( r - t ) . r = § £ § ! 8 8 )

w k t ó r y m b r a k jest m o żliwo ści w y e l i m i n o w a n i a p a r a m e t r ó w o p e r a c y j n y c h p r o c e s u (P,U). Po d o k o n a n i u p r z e k s z t a ł c e n i a z z a s t o ­ s o w a n i e m m o d u ł ó w b e z w y m i a r o w y c h o k a z u j e się, że:

(r-t)śr = ( 1 / 6 ) -Eu-Re (89)

O p i e r a j ą c się na tej zale żno ści m o ż n a stwierdzić, że na sp a d e k a k t y w n o ś c i b i a ł e k e n z y m a t y c z n y c h w t r a k c i e p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i (w p r z e c i w i e ń s t w i e do p r z e p ł y w u laminarneg o) z a s a d n i c z y w p ł y w mają p a r a m e t r y o p e r a c y j n e procesu, a w i ę c c i ś n i e n i e r o b o c z e oraz l i n i o w a p r ę d k o ś ć p r z e p ł y w u p r e p a r a t u e n z y m a t y c z n e g o nad p o w i e r z c h n i ą membrany.

j r t

-Rys. 9.7. Z a l e ż n o ś ć s p a d k u aktywno ści k a t a l a z y od c z a s u p r z e b y w a ­ n ia e n z y m u w u k ł a d z i e i od ś r e dniej w a r t o ś c i szy bkośc i ś c i n a n i a

Fig. 9.7. D e p e n d e n c e of c a t a l y s e a c t i v i t y d r o p o n h o l d u p t im e of e n z y m e in s y s t e m and a v e r a g e shear rat e

1 8 4

-T e m p e r a t u r a jest tak ż e jednym z p a r a m e t r ó w w p ł y w a j ą c y c h na e f e k t y w n o ś ć p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i , a jej w z r o s t wywołuje z w i ę k s z e n i e p r z e p u s z c z a l n o ś c i i s e l e k t y w n o ś c i membran. Z jawisko to t ł u m a c z y się o b n i ż e n i e m lepkości roztworu, a t a k ż e z m n i e j s z e ­ n i e m i n t e n s y w n o ś c i w y s t ę p o w a n i a z j a w i s k a p o l a r y z a c j i stężeniowej.

M o ż l i w o ś ć s t o s o w a n i a w u k ł a d z i e u l t r a f i l t r a c y j n y m wyso kich t e m p e r a t u r u z a l e ż n i o n a jest od r o d z a j u p o l i m e r u b ł o n o t w ó r c z e g o , z k t ó r e g o w y k o n a n a jest membrana, a k o n k r e t n i e o d t e m p e r a t u r y jego z es z k l e n i a . Istotny jest także c h a r a k t e r f i l t r o w a n e g o roztworu.

N i e k t ó r e e n z y m y b ę d ą c b iałkami m ogą w zby t w y s o k i c h t e m p e r a t u r a c h u l e g a ć n i e o d w r a c a l n e j d e naturacji, p r z y c z y m s z y b k o ś ć tego p r o c e s u z w i ę k s z a się pod w p ł y w e m o g r z e w a n i a w i e l o k r o t n i e szybciej n i ż p o d w p ł y w e m reakcji che micznych. T e m e r a t u r a p r o w a d z e n i a p r o c e s u u l t r a f i l t r a c j i subs tanc ji b i o l o g i c z n i e a k t y w n y c h w ah a się w s z e r o k i c h granicach. M o ż e by ć z a r ó w n o niska, r z ę d u 27 4 - 2 7 5 K, jak i w y s o k a (353 K), w zale żno ści od r o d z a j u o t r z y m y w a n e g o p rodu k tu . N a j c z ę ś c i e j s p o t yka n ą t e m p e r a t u r ą jest 293 K [114], W a l i a n d e r [115] z a t ę ż a j ą c w t e m p e r a t u r z e 313 K c i e c z p o h o d o w l a n ą s z c z e p u B a c i l l u s s u b t i l i s zawierającą, a m y l a z ę i p r o t e a z ę o t r z y ­ m a ł w p e r m e a c i e 75 - 8 0 % w s z y s t k i c h r o z p u s z c z a l n y c h s u b s t a n c j i przy ich m i n i m a l n y c h s t a r t a c h (max 2%).

Na f i z y k o c h e m i c z n ą c h a r a k t e r y s t y k ę p ó ł p r z e p u s z c z a l n e j membrany, a z w ł a s z c z a na jej selektywność, w p ł y w a z m i a n a p H r o z t w o r u p o d ­ d a w a n e g o z a t ę ż a n i u lub s e l e k t y w n e m u roz d z i e l a n i u . Zaró wno r o z p u s z c z o n e s u b s t a n c j e jak i m e m b r a n y c h a r a k t e r y z u j e pewien ł a d u n e k e l e k t r y cz n y , p r z y c z y n i a j ą c y się n i e j e d n o k r o t n i e do p o w s t a ­ w a n i a w a r s t w y p o l a r y z a c y j n e j na ich p o w i e r z c h n i w s k u t e k w z a jemn ego o d d z i a ł y w a n i a u k ł a d u m e m b r a n a - r o z t w ó r . W y r a ź n y w z r o s t stopnia

1 8 5

-z a t r -z y m a n i a r y b o n u k l e a -z y (rys.9.8) [51] w o b s -z a r -z e pH = 9-10 t ł u m a c z y s i ę w z r o s t e m stopnia asoc j a c j i c z ą s t e c z e k b i a ł k a w po b l i ż u p u n k t u i z o e l e k t r y c z n e g o (dla r y b o n u k l e a z y p H = 9,45), n a t o m i a s t r o s n ą c y c h a r a k t e r k r z y w y c h p r z y p H>6 p r a w d o p o d o b n i e

--- CZAS, s —

Rys. 9.8. Z a l e ż n o ś ć s e l e k t y w n o ś c i m e m b r a n y u l t r a f i l t r a c y j n e j od p H r o z t w o r u rybonukleazy:

1 - m e m b r a n a " R I P O R - 1 ” AP = 0,1 MPa 2. 3 - m e m b r a n a "RIPOR-2" AP = 0,2 MPa

4 - m e m b r a n a " R I P O R - 4 ”

Fig. 9.8. D e p e n d e n c e of u l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n e s e l e c t i v i t y on p H of r i b o n u c l e a s e sol ution

1 - " R I P O R - 1 " m e m br ane AP = 0,1 MPa

2 .3 - "RIPOR-2'' m e m b r a n e AP = 0,2 MPa

4 - " R I P O R - 4 ” m e m bra ne

1 8 6

-w y -w o ł a n y jest -w z r o s t e m -w z a j e m n e g o p r z y c i ą g a n i a c z ą s t e c z e k białka i p o w i e r z c h n i membrany. E w e n t u a l n a z m i a n a ł a d u n k u e l ektryc znego c z ą s t e c z k i b i a ł k a p o w o d u j e z mi a n y w s t r u k t u r z e i ułożeniu p r z e s t r z e n n y m ł a ń c u c h ó w polipeptydo wych. W p u n k c i e izoelektrycz- n y m w i e l e w ł a ś c iw o ś c i b i a ł e k c h a r a k t e r y z u j e się n a j m n i e j s z y m lub n a j w i ę k s z y m nasileniem, j ednak ich r o z p u s z c z a l n o ś ć jest wówczas najmni e j s z a . P a s e k i inni [69,115] ba dali w p ł y w kwaso w o ś c i na s z y b k o ś ć i e f e k t y w n o ś ć u ltra fi l t r a c j i c e l u l o l i t y c z n e j pożywki f e r m e n t a c y j n e j (rys.9.9). J a k widać, n a j n i ż s z ą s z y b k o ś ć filtracji o s i ą g n i ę t o dla pH = 3,9 , co c a ł k o w i c i e o d p o w i a d a w a r t o ś c i punktu i z o e l e k t r y c z n e g o c e l u l o z y b i o s y n t e z o w a n e j p r z e z s z c z e p Tridwder ma viride. A b y ją zwiększyć, n a l e ż a ł o k a ż d o r a z o w o d o p r o w a d z i ć pH r o z t w o r u f i l t r o w a n e g o do 4,5, p r z y k t ó r y m o s i ą g a n o optymalną s z y b k o ś ć filtracji.

9.3. U L T R A F I L T R A C Y J N E O C Z Y S Z C Z A N I E I Z A T Ę Ż A N I E BIAŁEK E N Z Y M A T Y C Z N Y C H

Fakt, że p ły n p o h o d o w l a n y o t r z y m a n y w w y n i k u b a k t e r y j n e j b i o ­ s y n t e z y e n z y m ó w z a w i e r a o pró cz b i a ł e k a k t y w n y c h li c z n e związki m a ł o c z ą s t e c z k o w e jak: sole nieorgan icz ne, barwniki, w ę g l o w o d a n y o r a z b i a ł k a nieaktywne, p rz yc z y n i ł się w o s t a t n i c h latach do c o r a z w i ę k s z e g o z a i n t e r e s o w a n i a p r o c e s e m u l t r a f i l t r a c j i , dzięki k t ó r e m u moż n a by je c a ł k o w i c i e o c z y ś c i ć od tych d o m i e s z e k [ 5 6 , 6 9 , 9 4 , 1 0 4 , 1 0 5,113 ,11 4,122 ], S c h e m a t t a k i e g o ultra- f i l t r a c y j n e g o o d z y s k i w a n i a o c z y s z c z o n y c h i z a t ę ż o n y c h w p e w n y m s t o p n i u e n z y m ó w p r z e d s t a w i a rys. 9.10. W tabeli 9.2 [114] p r z e d s t a w i o n o p r z y k ł a d o w o wyniki u l t r a f i l t r a c y j n e g o zatęża- nia t r z e c h enzymów: p e n i c i l i n a z y , (3-galaktozydazy i trypsyny

1 8 7

R y s . 9.10. U l t r a f i l t r a c y j n e o c z y s z c z a n i e i z a t ę ż a n i e b i a ł e k e n z y ­ m a t y c z n y c h

F i g . 9.10. U l t r a f i l t r a t i o n p u r i f i c a t i o n a n d c o n c e n t r a t i o n of e n z y m a t i c pro t e i n s

b i a ł k a e n z y m a t y c z n e g o o s i ą g n i ę t o r ó w n i e ż p e w i e n s t o p i e ń jego o cz y s z c z e n i a . S k ł a d s u r o we go p r e p a r a t u o k r e ś l o n y na pods t a w i e b a d a ń c h r o m a t o g r a f i c z n y c h w y k o n a n y c h na ż e l u S e p h a d e x G -75 p r z e d ­ s t a w i o n o na r y s . 9.11. Z d i a g r a m u wynika, że a k t y w n o ś c i e n z y m a ­ t y c z n e e l u a t ó w k o r e s p o n d u j ą z b a r d z o n i s k ą z a w a r t o ś c i ą

U l t r a f i l t r a c y j n e z a t ę ż a n i e n i e k t ó r y c h e n z y m ó w p rzy z a s t o s o w a n i u m e m b r a n y UM - 1 0 (Amicon)

T a b e l a 9 . 2

E n z y m

O b j ę t o ś ć p o c z ą t k o w a

dm

O b j ę t o ś ć k o ń c o w a

d m 3

St o p i e ń za t ę ż e n i a

St ę ż e n i e enzymu, j e d n . / c m 3

E f e k t y w n o ś ć o d z y s k u 1*

% p rób ka

w y j ś c i o w a

k o n c e n t r a t f il trat

P e n i c y l i n a z a 1, 80 0, 150 12, 3 100 950 0 79, 3

(3-galaktozydaza 1, 00 0, 033 30, 3 0, 75 5, 44 0 24, 0

T r y p s y n a 21 1, 40 0, 310 4. 52 4,5 18, 7 0 91, 3

T r y p s y n a 1, 32 0,2 90 4, 56 4,3 14,9 0 76, 6

11 E f e k t y w n o ś ć o d z y s k u = ( z a w a r t o ś ć e n z y m u w k o n c e n t r a c i e / z a w a r t o ś ć e n z y m u w p r ó b c e wy j ś c i o w e j )•100 2) P r o c e s u l t r a f i l t r a c j i p r o w a d z o n o w temp. 284 K; inne b a d a n i a w temp. 29 8 - 2 9 9 K.

1 9 0

-Rys. 9.11. C h r o m a t o g r a m o b r a z u j ą c y f i l t r a c j ę ż e l o w ą r o z t w o r u t r y p s y n y p r z e d jej u l t r a f i l t r a c y j n y m o c z y s z c z a n i e m

(0,15 m g / d m t r y ps yny w 0,1 n r o z t w o r z e b u f o r u tris, pH = 8,2)

Fig. 9.11. C h r o m a t o g r a m of gel f i l t r a t i o n of t r i p s i n e s o l u t i o n b e f o r e u l t r a f i l t r a t i o n p u r i f i c a t i o n (0,15 m g / d m 3of t r i p s i n e in 0,1 n of tris b u f f e r solution, pH = 8,2) b i a ł k a (objętość elucji 45-65 c m 3), a z a s a d n i c z e jego z a n i e c z y s z ­ c z e n i a p o j a w i a j ą się w e l u a c i e p rzy o b j ę t o ś c i od 72 do 95 c m 3.

Z a w a r t e w n i m b i a ł k a o m n i ejs zej m a s i e c z ą s t e c z k o w e j (od 11 000 do 19 000) nie w y k a z u j ą a kty w n o ś c i e n z y m a t y c z n e j . P o n ieważ t r y p s y n a ma ma s ę c z ą s t e c z k o w ą o k o ł o 24 000 d a l s z e badani a p r o w a d z o n o na u l t r a f i l t r a c y j n e j m e m b r a n i e H F A - 2 0 0 (A b c o r ) o "cut- -off" - 20 000, a o t r z y m a n e wyniki z a w a r t o w tabeli 9.3 i na rys.

9.1 2 i 9.13. S t o p i e ń o d z y s k u t r y p s y n y w y n o s i ł 70, 2 % , a p o z o s t a ł a c z ę ś ć bi a ł k a p r z e s z ł a do permeatu. S t o p i e ń zatę ż e n i a r o z t w o r u e n z y m a t y c z n e g o w y no sił 8,35, a o c z y s z c z e n i e e n z y m u było 2 , 35-krotne.

1 9 1

1 9 2

prze 1 9 3 prze

-R y s . 9.14. C h r o m a t o g r a m (Sephadex G-100) a m y l o s u b t y l i n y (a) oraz o c z y s z c z o n e g o p r e p a r a t u a m y l o l i t y c z n e g o (b):

1 - b i a ł k a nieaktywne: m g / c m 3 2 - a k t y w n o ś ć amyloli tyc zna, E D / c m 3 - a k t y w n o ś ć proteol ity czna, P E / c m 3 4 - w ęglowodany, mg / c m

F i g . 9.14. C h r o m a t o g r a m (Sephadex G-100) of a m y l o s u b t i l i n (a) and p u r i f i e d a m y l o l y t i c p r e p a r a t i o n (b):

1 - n o n a c t i v e proteins; m g / c m 2 - a m y l o l i t i c activity; E D / c m 3 3 - p e c t i n o l i t i c activity; P E / c m 3 4 - c ar b ohydraes; m g / c m 3

b a d a n y c h t r z e c h r o d z a j ó w m e m b r a n fi r m y PCI: F 4 /A-1600, F 5 - 1 3 0 0 0 i T 6 / A - 1 6 0 0 0 n a j l e p s z e e f e k t y u z y s k a n o w p r z y p a d k u t r z e c i e j błony.

J edn a k że , w w y n i k u d ł u ż s z y c h p ró b o k a z a ł o się, że t r w a ł o ś ć m e m ­ b r a n b y ł a s t o s u n k o w o ni s k a i po 400-50 0 g o d z i n a c h pe ł n e j e k s p l o ­ ata c j i s z y b k o ś ć filtracji spadła 3-krotnie, a w p e r m e a c i e stwiei—

d z o n o o b e c n o ś ć b i a ł e k aktywnych.

W I n s t y t u c i e P r z e m y s ł u F e r m e n t a c y j n e g o w W a r s z a w i e z badan o n a t o m i a s t m o ż l i w o ś ć o c z y s z c z a n i a i z a t ę ż a n i a e n z y m ó w p r o t e o l i ­ t y c z n y c h p o c h o d z e n i a p l e ś n i o w e g o i b a k t e r y j n e g o o r a z p e k t y n o l i - t y c z n y c h [143]. S t o s u j ą c m e m b r a n y PM - 3 0 u z y s k a n o 13-kr o t n y

1 9 4

-w z r o s t a k t y-w n o ś c i p r o t e a z b a k t e r y j n y c h i p r a -w i e 9 - k r o t n y -wzrost a k t y w n o ś c i właściwej, p o d c z a s g d y d l a p r o t e a z pleśniow ych u z y s k a n o o d p o w i e d n i o 1 3 - k rotny i 6 - k r o t n y w z r o s t aktywności. Przy u ż y c i u m e m b r a n Am i c o n XM-50 o s i ą g n i ę t o 8 - k r o t n e zwięks zen ie a k t y w n o ś c i e n z y m ó w p e k t y n o l i t y c z n y c h i 2 - k r o t n e p o d w y ższ eni e a k t y w n o ś c i właściwej.

9.4. Z A K O Ń C Z E N I E

W P o l s c e w chwili obecnej na ska l ę p r z e m y s ł o w ą s t o s u j e się s p o ż y w c z e i t e c h n i c z n e p r e pa r a t y e n z y m a t y c z n e p r z e w a ż n i e produkcji krajowej. O t r z y m y w a n e w w y n i k u p r o c e s u f e r m e n t a c j i p ł y n y pohodo- w l a n e są p o d d a w a n e filtracji, a n a s t ę p n i e z a t ę ż a n e w wypark ach p r ó ż n i o w y c h bez d o d a t k o w e g o oczy szczania. W tabeli 9.4 [114]

p r z e d s t a w i o n o p o r ó w n a n i e k o s z t ó w z w i ą z a n y c h z z a t ę ż a n i e m i o c z y s z ­ c z a n i e m e n z y m ó w m e t o d ą ult rafi l t r a c j i o raz m e t o d ą wypa rkową (warunki amerykańskie). Koszt i n w e s t y c z y j n y i nstalacji ultrafil- t r a c y j n e j u s t a l o n o na 5-150 tys. d o l a r ó w US A d l a ty p o w e j apa ratur y szarżowej. K o s z t y e k s p l o a t a c y j n e w y n o s z ą o k o ł o 4 d o l a r ó w USA na 1 m 3 filtratu, co stanowi jedynie 50% k o s z t ó w m e t o d y wyparkowej (tabe l a 9.4A). Na k o r z y ś ć s t o s o w a n i a u l t r a f i l t r a c j i przemawia je s z c z e w y ż s z y s t o p i e ń o d z y s k u p r o d u k t u (90-98%) niż w metodzie w y p a r k o w e j p o ł ąc z on e j z w y s a l a n i e m (70-90%). B i o r ą c pod uwagę w y s o k i e na ogół c e n y e n z y m ó w da j e to d o d a t k o w e k o r zyści w postaci 6-18 d o l a r ó w U S A na 1 m 3 m i e s z a n i n y p o f e r m e n t a c y j n e j [114].

D a n e l i czbowe w y r a ź n i e ś w i a d c z ą o tym, że w prz ypad ku o c z y s z c z a n i a i z a t ę ż a n i a b i a ł e k e n z y m a t y c z n y c h p r o c e s ultrafi 1- tracji p o d w z g l ę d e m e n e r g e t y c z n y m m o ż e z d e c y d o w a n i e k o n k u r o w a ć z innymi m e todami klasycznymi.

1 9 5

10. S K O J A R Z O N E U K Ł A D Y P R O C E S Ó W F E R MENTA CJI I B I O K O N W E R S J I E N Z Y ­

W dokumencie Membrany w biotechnologii (Stron 169-197)