Określenie zdolności pochodnej 4-metylo-1-nitroakrydyny

III.3.2. Określenie zdolności pochodnej 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 do indukcji apoptozy komórek ludzkiego raka prostaty LNCaP.

Pojawienie się populacji sub-G1 podczas badania dystrybucji komórek LNCaP w ich cyklu życiowym wskazywało, iż komórki te poddane działaniu pochodnej 4-metylo- 1-nitroakrydyny C-1748 w stężeniu biologicznie istotnym (EC90), mogły umierać na drodze apoptozy (Rys. 59 i 60). Obecność frakcji sub-G1 jest ważnym, aczkolwiek nie

zdolność badanego związku do indukcji apoptozy komórek LNCaP należało potwierdzić innymi, niezależnymi metodami.

Badanie zmian w morfologii komórek jest podstawowym i najprostszym sposobem identyfikacji komórek ulegających apoptozie, które charakteryzują się obkurczeniem, kondensacją chromatyny i pojawieniem się ciałek apoptotycznych. Ocenę stopnia kondensacji chromatyny oraz fragmentacji jąder komórek LNCaP traktowanych związkiem C-1748 w stężeniu odpowiadającemu wartości EC90 (0.009 μM), dokonałam przy użyciu interkalującego do DNA fluorochromu DAPI i techniki mikroskopii fluorescencyjnej.

Analiza morfologii jąder komórek ludzkiego raka prostaty LNCaP poddanych działaniu C-1748, wskazała na wyraźną obecność komórek apoptotycznych już po upływie 24 godzin inkubacji (Rys. 61). Po 48 godzinach ekspozycji na badany związek, ilość komórek apoptotycznych, widocznych na zamieszczonych poniżej zdjęciach, nadal stanowiła dużą część całkowitej populacji komórek LNCaP. Po upływie 72 godzin, liczba tychże komórek spadała, po czym utrzymywała się na mniej więcej stałym poziomie. Podobnie jak w przypadku komórek HCT116 p53^+/+, nie obserwowałam pojawienia się komórek wielojądrzastych, charakterystycznych dla procesu katastrofy mitotycznej.

Omówienie przeprowadzonych badań i dyskusja wyników

LNCaP

Kontrola 24 godziny

48 godzin 72 godziny

96 godzin 120 godzin

144 godziny 168 godzin

Rys. 61. Morfologia komórek LNCaP, kontrolnych i poddanych działaniu związku C-1748 w stężeniu odpowiadającemu wartości EC90 (0.009 μM), przez podaną liczbę godzin. Po zakończonej inkubacji ze związkiem, komórki barwiono za pomocą fluorochromu DAPI i oceniano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Symbol AP oznacza przykładowe komórki apoptotyczne.

AP

AP

AP

AP

AP

AP

AP AP

AP

AP

Równolegle z kryterium morfologicznym postanowiłam sprawdzić, w oparciu o test z użyciem aneksyny V i jodku propidyny, czy w komórkach LNCaP traktowanych pochodną 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 w stężeniu biologicznie istotnym (EC₉₀), dochodzi do charakterystycznych dla apoptozy zmian w budowie błony cytoplazmatycznej.

Jak przedstawiono na Rys. 62 i 63, populacja komórek LNCaP wybarwionych jedynie jodkiem propidyny (aneksyna V-/PI+), w miarę wydłużania czasu inkubacji z C-1748 (0.009 μM), utrzymywała się na niskim poziomie, w przedziale 2-9%. Wynik ten dowodzi, podobnie jak w przypadku komórek obu linii HCT116 (Rys. 30, 31, 32 i 33), iż badany związek indukuje śmierć na drodze bezpośredniej nekrozy (ang. primary necrosis) jedynie niewielkiej części komórek ludzkiego raka prostaty. Uzyskane wyniki wskazały również na obecność komórek wybarwionych aneksyną V, czyli ulegających apoptozie. Komórki wczesnoapoptotyczne (aneksyna V+/PI-), pojawiły się już po upływie 24 godzin ekspozycji na C-1748 (ok. 12%). Po upływie 48 i 72 godzin, ilość komórek we wczesnej fazie apoptozy wzrastała (ok. 29%), jak również wyraźnie przybywało komórek późnoapoptotycznych (ok. 20%). Po 96 godzinach inkubacji z badanym związkiem, ubywało zarówno komórek we wczesnej (ok. 16%), jak i w późnej fazie apoptozy (ok. 14%). Ostatecznie, pomiędzy 120 a 168 godziną ekspozycji na C-1748, łączny odsetek komórek wczesno- i późnoapoptotycznych utrzymywał się na poziomie od ok. 18% do ok. 24%. Wyniki uzyskane na drodze badania zmian w strukturze błony cytoplazmatycznej potwierdziły zdolność C-1748 do indukcji apoptozy komórek LNCaP, a ilościowy charakter tej metody w przekonujący sposób dowodzi, że tylko część (maksymalnie 50%) komórek ludzkiego raka prostaty ulega temu rodzajowi śmierci. Co więcej, opisane powyżej wyniki wskazały, że proces apoptozy komórek LNCaP poddanych działaniu związku C-1748 zachodził szczególnie intensywnie jedynie w ciągu pierwszych 72 godzin inkubacji, co łącznie z wynikami cytometrycznej analizy progresji wspomnianych komórek ludzkiego raka prostaty w ich cyklu życiowym może sugerować między innymi, iż po dłuższych czasach ekspozycji pojawiła się populacja komórek opornych na działanie badanego związku lub, podobnie jak w przypadku komórek HCT116 p53^+/+, może dochodzić do uruchomienia mechanizmów naprawy DNA .

Omówienie przeprowadzonych badań i dyskusja wyników

Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny

96 godzin 120 godzin 144 godziny 168 godzin

Rys. 62. Cytometryczna analiza zmian zachodzących w błonie cytoplazmatycznej komórek LNCaP, zarówno kontrolnych jak i traktowanych C-1748 (EC90: 0.009 µM). Oś X – fluorescencja emitowana przez fluoresceinę skoniugowaną z aneksyną V. Oś Y – fluorescencja emitowana przez jodek propidyny. Lewy, dolny kwadrant: komórki żywe (aneksyna V-/PI-); prawy, dolny kwadrant: komórki wczesnoapoptotyczne (aneksyna V+/PI-); prawy, górny kwadrant: komórki późnoapoptotyczne (aneksyna V+/PI+); lewy, górny kwadrant: komórki nekrotyczne (aneksyna V-/PI+).

0%

20%

40%

60%

80%

100%

0 24 48 72 96 120 144 168

Czas [godziny]

Ilość komórek [%]

Rys. 63. Procentowy udział komórek żywych, nekrotycznych, wczesno- i późnoapoptotycznych (określony w odniesieniu do całkowitej populacji komórek LNCaP) w zależności od czasu inkubacji ze związkiem C-1748 (EC90). Wykres przedstawia wyniki reprezentacyjne dla trzech niezależnych doświadczeń, w których otrzymano podobne wyniki.

komórki żywe nekroza

wczesna apoptoza późna apoptoza

Biorąc pod uwagę fakt, iż apoptoza komórek obu linii ludzkich raków jelita grubego HCT116 traktowanych pochodną 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 przebiegała z udziałem mitochondrialnej drogi aktywacji kaspaz, w następnym etapie pracy postanowiłam sprawdzić, czy również w komórkach LNCaP dochodzi do uruchomienia apoptotycznej kaskady kaspaz.

W tym celu zbadałam obecność aktywnej formy efektorowej kaspazy-3 w komórkach ludzkiego raka prostaty poddanych działaniu badanego związku.

Kontrola 24 godziny 48 godzin 72 godziny

96 godzin 120 godzin 144 godziny 168 godzin

Rys. 64. Cytometryczna analiza obecności aktywnej formy kaspazy-3 w komórkach LNCaP, kontrolnych i traktowanych C-1748 (EC90: 0.009 µM). Oś X - fluorescencja pochodzącą od fluoresceiny skoniugowanej z przeciwciałem anty-aktywna kaspaza-3. Zaznaczony obszar (R1) przedstawia komórki zawierające aktywną kaspazę-3. Cytogram jest reprezentacyjny dla dwóch niezależnie przeprowadzonych doświadczeń.

Omówienie przeprowadzonych badań i dyskusja wyników

0 20 40 60 80 100

0 24 48 72 96 120 144 168

Czas [godziny]

Komórki z aktywną kaspazą-3 [%]

Rys. 65. Odsetek komórek LNCaP zawierających aktywną kaspazę-3, w zależności od długości czasu inkubacji ze związkiem C-1748 (EC90: 0.009 μM). Wyniki przedstawiono w postaci średnich z dwóch niezależnie przeprowadzonych doświadczeń wraz z odchyleniami standardowymi.

Jak pokazano na Rys. 64 i 65, w komórkach LNCaP traktowanych pochodną 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 w stężeniu biologicznie istotnym (EC₉₀: 0.009 μM), doszło do aktywacji kaspazy-3. Po 24 godzinach ekspozycji na badany związek, ilość komórek ludzkiego raka prostaty z aktywną kaspazą-3 wynosiła ok. 17%. W ciągu kolejnych 24 godzin ilość tychże komórek wzrastała do ok. 39%, a następnie spadała i utrzymywała się na mniej więcej stałym poziomie ok. 26% pomiędzy 72 i 96 godziną inkubacji. Po upływie 120 i 144 godzin, frakcja komórek z aktywną kaspazą-3 ponownie malała do ok. 13%. Ostatecznie, po 168 godzinach ekspozycji na badany związek, frakcja ta wynosiła ok. 7%. Powyższe obserwacje wskazują, iż apoptoza indukowana w komórkach LNCaP przez C-1748, podobnie jak w przypadku komórek obu linii ludzkich raków jelita grubego HCT116, przebiegała w sposób zależny od aktywacji kaspazy-3.

III.3.3. Określenie zdolności pochodnej 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 do indukcji autofagii w komórkach ludzkiego raka prostaty LNCaP.

Rezultaty przeprowadzonych dotychczas przeze mnie badań wykazały, iż pochodna 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 indukuje autofagię w komórkach ludzkiego raka jelita grubego HCT116 p53^-/-, czego nie obserwowano w przypadku komórek HCT116

sprawdzić, czy w komórkach LNCaP z funkcjonalnym p53, dojdzie do indukcji autofagii, czy może podobnie jak komórki HCT116 p53^+/+ nie będą one zdolne do uruchomienia tego procesu pod wpływem pochodnej 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748.

Zdolność C-1748 do indukcji autofagii, podobnie jak w przypadku komórek obu linii HCT116, określiłam w oparciu o obserwację zmian w ilości kwaśnych organelli pęcherzykowych (ang. AVO – Acidic Vesicular Organelle) w komórkach LNCaP eksponowanych na działanie badanego związku w stężeniu biologicznie istotnym (EC90), jak również zbadałam poziom białek LC3-I oraz LC3-II.

Jak pokazano na Rys. 66, w przypadku komórek LNCaP traktowanych pochodną 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 w stężeniu odpowiadającemu wartości EC90 (0.009 μM), a następnie barwionych oranżem akrydyny, analiza mikroskopowa wskazała na brak wyraźnego wzrostu liczby kwaśnych organelli w porównaniu do komórek kontrolnych.

Świadczył o tym fakt, iż w miarę wydłużania czasu ekspozycji na badany związek, intensywność czerwonej fluorescencji, pochodzącej od oranżu akrydyny, utrzymywała się na mniej więcej stałym poziomie. Co więcej, poziom obu form białka MAP I LC3, zarówno LC3-I, jak i LC3-II, w porównaniu do komórek kontrolnych, nie ulegał istotnym zmianom w miarę wydłużania czasu inkubacji (Rys. 67). A zatem, uzyskane wyniki jednoznacznie wskazują na brak indukcji autofagii w komórkach ludzkiego raka prostaty LNCaP eksponowanych na działanie związku C-1748.

Omówienie przeprowadzonych badań i dyskusja wyników

LNCaP

Kontrola 24 godziny

48 godzin 72 godziny

96 godzin

Rys. 66. Obserwacje zmian w ilości kwaśnych organelli w komórkach LNCaP, kontrolnych i traktowanych pochodną 4-metylo-1-nitroakrydyny C-1748 w stężeniu odpowiadającemu wartości EC90 (0.009 µM), a następnie barwionych oranżem akrydyny.

0 24 48 72 96 godziny

Rys. 67. Poziom białek LC3-I i LC3-II w komórkach LNCaP, kontrolnych i traktowanych pochodną 4-metylo- 1-nirtroakrydyny C-1748 w stężeniu biologicznie istotnym (EC90), przez podaną liczbę godzin. Wynik przedstawia jedną z dwóch niezależnych analiz Western blotting. Jako kontrolę równomiernego napełnienia studzienek zastosowano β-aktynę.

III.3.4. Określenie zdolności związku C-1748 do uruchomienia procesu przyspieszonego