Otrzymywanie białek

3.2.13.1. Przygotowywanie szczepów bakteryjnych

Komórki bakteryjne przeznaczone do produkcji białek przygotowywano w oparciu o szczepy E. coli BL21-Star oraz SHuffle (Rozdział 3.1.2). Do 50 µl zawiesiny komórek kompetentnych dodawano 1 µl roztworu wektora ekspresyjnego (10 ng/µl) i przeprowadzano transformację metodą szoku cieplnego. Zawiesinę bakterii delikatnie mieszano i inkubowano kolejno: na lodzie (30 min), w 42°C (30 s) i ponownie na lodzie (5 min). Dodawano ogrzaną do temperatury pokojowej pożywkę SOC i wytrząsano przez 1 h z prędkością

zawiesinę bakterii w stacjonarnej fazie wzrostu. Uzyskaną hodowlę stosowano do zaszczepienia świeżej pożywki LB z antybiotykiem, w której prowadzono produkcję białka (Rozdział 3.2.13.2).

W celu sporządzenia stoków bakteryjnych do świeżej probówki pobierano 0,6 ml zawiesiny z hodowli bakterii w fazie logarytmicznego wzrostu (wartość OD600 wynosząca 0,4 – 0,6). Następnie dodawano taką samą objętość (0,6 ml) 50% roztworu glicerolu, delikatnie mieszano, zamrażano w ciekłym azocie i przechowywano w -80°C. W celu wznowienia hodowli niewielką ilością zamrożonego preparatu zaszczepiano płynną pożywkę LB z odpowiednim antybiotykiem. Bakterie inkubowano przez 16 h w odpowiedniej temperaturze (Tabela 3.15), przy prędkości wytrząsania 300 rpm, otrzymując zawiesinę bakterii w stacjonarnej fazie wzrostu.

Tabela 3.15. Warunki transformacji szczepów E. coli BL21-Star oraz SHuffle.

BL21-Star SHuffle T7

Objętość dodanej pożywki SOC po

transformacji 250 µl 950 µl

Regeneracja komórek po transformacji 37°C przez 1h 30°C przez 1h

Temperatura hodowli bakterii 37°C 30°C

3.2.13.2. Produkcja białek w komórkach bakteryjnych

W celu wyprodukowania białek heterologicznych w bakteriach płynną pożywkę LB z odpowiednim antybiotykiem zaszczepiano zawiesiną bakterii danego szczepu ekspresyjnego (BL21-Star lub SHuffle) w stacjonarnej fazie wzrostu w stosunku 20:1. Hodowlę prowadzono w 30/37°C (Tabela 3.15) wytrząsając z prędkością 300 rpm do momentu osiągnięcia przez zawiesinę bakterii gęstości optycznej OD600 około 0,4 – 0,6. Ekspresję białka indukowano przez dodanie roztworu izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do stężenia końcowego 0,4 (SHuffle) lub 0,5 mM (BL21). Produkcję prowadzono przez 16 h w 16°C (BL21-Star oraz SHuffle) wytrząsając hodowlę z prędkością 300 rpm. Po tym czasie zawiesinę bakterii wirowano (6000 x g, 4°C, 6 min), pożywkę dekantowano, a osad bakteryjny zamrażano w -80°C.

3.2.13.3. Produkcja białek w komórkach owadzich

Komórki z linii High Five zawieszono w 90 ml pożywki Express Five SFM (Rozdział 3.1.10) bez dodatku nystatyny, a następnie przenoszono do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Stężenie komórek w powstałej zawiesinie wynosiło 2 mln komórek/ml. Do komórek dodano 10 ml przygotowanego wcześniej stoku wirusowego (Rozdział 3.2.12). Komórki inkubowano przez 96h w 27°C, wytrząsając z prędkością 120 rpm. Po tym czasie komórki oddzielano od pożywki przez wirowanie (5 min, 200 x g). Pożywkę dekantowano, a komórki przepłukiwano buforem 1x PBS i ponownie wirowano. Bufor PBS dekantowano, a osad komórkowy zamrażano w -80°C.

3.2.13.4. Analiza rozpuszczalności białek

Zwirowany osad komórek bakteryjnych lub komórek owadzich pochodzący z 1 ml hodowli zawieszano w 300 µl buforu do lizy komórek bakteryjnych/owadzich (Rozdział 3.1.8). Preparat wytrząsano z prędkością 200 rpm przez 15 min, a następnie wirowano (16 000 x g, 15 min, 4°C). Supernatant zawierający frakcję białek rozpuszczalnych przenoszono do nowej probówki, a osad zawieszano w 300 µl buforu 1x SB. Zebrane frakcje analizowano metodą SDS-PAGE (Rozdział 3.2.2) oraz przez immunodetekcję białek (Rozdział 3.2.3).

3.2.13.5. Izolacja i oczyszczanie białek

Chromatografia powinowactwa białek do złoża z immobilizowanymi jonami niklu (INiAC)

Zwirowany osad komórek bakteryjnych lub komórek owadzich zawieszano w 35 ml buforu do lizy (Rozdział 3.1.8) i wytrząsano z prędkością 200 rpm przez 15 min. Preparat sonikowano w cyklach 2 s sonikacji/10 s przerwy przez 4 min (komórki bakteryjne) lub 1 min (komórki owadzie), przy

kolumnie o objętości 49 ml (Rozdział 3.1.13) i zrównoważonego wcześniej odpowiednim buforem płuczącym (Rozdział 3.1.8). Następnie złoże przemywano pięciokrotnie 50 ml buforu płuczącego*, z wykorzystaniem systemu podciśnieniowego. Do tego celu zaadaptowano kolektor podciśnieniowy Vac-Man (Promega) umożliwiający znaczne usprawnienie chromatografii INiAC, dzięki możliwości równoległego prowadzenia kilku rozdziałów w tym samym czasie oraz przyspieszonemu przepływowi fazy ruchomej, przy zachowaniu wysokiej jakość rozdziału. Warunkiem zastosowania powyższej metody jest dobre wiązanie się ze złożem białka ze znacznikiem HisTag. Metoda ta okazała się na tyle skuteczna, że została na stałe wdrożona jako standardowa metoda oczyszczania białek ze znacznikiem histydynowym w laboratorium Zakładu Biologii Molekularnej i Systemowej ICHB PAN.

Oczyszczone białko eluowano grawitacyjnie w 20 ml buforu wymywającego (2 razy po 10 ml) (Rozdział 3.1.8). Na koniec złoże przemywano 40 ml buforu wymywającego, a następnie równoważono przemywając 2 razy 50 ml buforu płuczącego.

Białka fuzyjne zawierające sekwencję rozpoznawaną przez proteazę TEV poddawano trawieniu podczas dializy wobec buforu zawierającego 25 mM Tris-HCl pH 7,9; 500 mM NaCl, 1 mM TCEP pH 7,9 oraz 0,1 mg proteazy TEV na każdy 1 mg rekombinowanego białka. Objętość buforu dializacyjnego ustalano w taki sposób, aby stężenie końcowe imidazolu w preparacie po dializie wynosiło 20 mM. Dializę prowadzono przez noc w temperaturze 6°C - 8°C. W celu usunięcia proteazy TEV oraz odciętej części białka fuzyjnego zawierającej znacznik histydynowy, preparat białkowy nakładano ponownie na zrównoważone złoże Ni Sepharose HP. Oczyszczone białko zbierano grawitacyjnie do nowej probówki, po czym złoże przemywano 5 ml buforu płuczącego. Zebrane frakcje analizowano metodą SDS-PAGE (Rozdział 3.2.2).

* - Przy oczyszczaniu pełnej długości białka TROSPA i mutantów substytucyjnych V1 – V5 złoże przemywano 5 krotnie 50 ml buforu płuczącego (3.1.8) z dodatkiem imidazolu w stężeniach: 20, 40, 60, 80 i 90 mM.

Sączenie molekularne

Preparat zawierający oczyszczone białko zagęszczano poprzez ultrafiltrację do około 4 ml na filtrze Amicon Ultra-15 (Merck Millipore) o punkcie odcięcia (MWCO, ang. molecular weight cut-off) 10 000 Da (4700 x g, 4°C). Zagęszczony preparat nakładano na kolumnę HiLoad 16/60 Superdex 200 (Rozdział 3.1.13) zrównoważoną wcześniej odpowiednim buforem. Rozdział w warunkach natywnych prowadzono w buforze nSEC w temperaturze 4°C, natomiast w warunkach denaturujących w buforze dSEC w temperaturze 20°C (Rozdział 3.1.8). Rozdział prowadzono w systemie ÄKTAprime plus. Zebrane frakcje analizowano metodą SDS-PAGE (Rozdział 3.2.2).

3.2.13.6. Pomiar stężenia białka

Stężenie białka określano przy użyciu spektrofotometru ND-1000 (NanoDrop). Przybliżone stężenia białek wyznaczano poprzez pomiary absorbancji przy długości fali 280 nm. Aby dokładnie ustalić stężenie białka w roztworze homogennym mierzono absorbancję przy długości fali 280 nm z uwzględnieniem masy molowej białka oraz molowego współczynnika ekstynkcji wyznaczonego za pomocą programu ProtParam (Rozdział 3.2.21).