Wszystkie otrzymane matrycowe dsDNA stanowiły matrycę do syntezy cząsteczek RNA, niezbędnych w dalszych etapach badań.
6.2.1. Konstrukty dsDNA zawierające warianty regionu terminalnego 5’ mRNA p53 o długości 122 i 247 nukleotydów
Konstrukty dsDNA zawierające warianty regionu terminalnego 5’ mRNA p53 o długości 122 i 247 nukleotydów otrzymywano w dwóch etapach.
141 W pierwszym z nich, wektor pCMV6, zawierający sekwencję mRNA p53 wraz z regionami niekodującymi (p53 True Clone, Origene), trawiono enzymami restrykcyjnymi SacI i Psp5II (Invitrogen). W tym celu przygotowano reakcję zawierającą 1 µg plazmidowego DNA, 2 µl buforu FastDigest oraz 1 µl enzymu restrykcyjnego Psp5II. Trawienie prowadzono przez 5 minut w 37°C, po czym inaktywowano enzym poprzez inkubację w 80°C przez 5 minut. Następnie do próbki dodano 1 µl enzymu restrykcyjnego SacI i inkubowano reakcję przez 5 minut w 37°C i inaktywowano enzym poprzez inkubację w 80°C przez 5 minut. Produkty reakcji rozdzielano na 1% żelu agarozowym przygotowanym z agarozy niskotopliwej, wycinano prążek o długości ok. 6200 pz a następnie przeprowadzono Lucję z żelu poprzez inkubację wycinka żelu z wodą w stosunku 1:1, w temperaturze 65°C przez 15 minut z wytrząsaniem. Otrzymane produkty oczyszczano wykorzystując zestaw Gene MATRIX PCR/DNA Clean-Up Purification Kit (Eurx).
W drugim etapie syntetyzowano segment dsDNA zawierający brakujący fragment części kodującej mRNA, region niekodujący 5’ mRNA o odpowiedniej długości 122 lub 247 nukleotydów, promotor dla polimerazy T7 RNA oraz sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny SacI. Syntezę matrycy przeprowadzono za pomocą reakcji PCR, w której jako matrycę wykorzystano plazmid z sekwencją p53 zawierającą odpowiednią długość regionu niekodującego 5’ (uzyskany w eksperymencie 5’RACE) oraz następujące startery:
Tabela 8. Lista starterów wykorzystanych do otrzymania konstruktów dsDNA zawierających warianty regionu terminalnego 5’ mRNA p53 o długości 122 i 247 nt.
Nazwa startera Sekwencja 5’ → 3’
122_F AAGCAGAGCTCTAATACGACTCACTATAGGAGTTCATTGGG ACCATCCTG
122_R GGTGACAGGGTCCTGTGCTGCA
247_F AAGCAGAGCTCTAATACGACTCACTATAGGACGGAAGGACTTGCCCTTACTT GTTATGGCGACTAT
247_R GGTGACAGGGTCCTGTGCTGCA
Reakcja PCR zawierała: 40 ng matrycowego dsDNA, 100 mM startera F i R, 0,2 mM każdego dNTP, 1,66 U polimerazy Pfu, 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM (NH4)2SO4, 10 mM KCl, 1 mg/ml BSA, 1% (v/v) Triton-X100, 20 mM MgSO4. Reakcję rozpoczęto od 3 minut denaturacji w 95°C, a następnie prowadzono przez 35 cykli: 30 sekund w 95°C,
142 30 sekund w 58°C, 1 minuta w 72°C, po czym następowało końcowe wydłużanie przez 10 minut w 72°C. Produkty reakcji PCR poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi SacI i Psp5II analogicznie jak w przypadku plazmidowego DNA. Następnie, za pomocą ligazy DNA T4 (Thermo Fisher Scientific) wprowadzono do plazmidu przygotowanego w pierwszym etapie. Reakcja ligacji zawierała: produkty PCR i plazmidowy DNA trawione enzymami restrykcyjnymi zmieszane w stosunku 3:1, 1,5 U ligazy DNA T4 oraz 2 µl dziesięciokrotnie stężonego buforu do ligacji. Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym jej produktami transformowano baterie kompetentne TOP10 (One Shot TOP10 Competent Cells, Invitrogen), (rozdział 6.16. Transformacja bakterii E. coli), a następnie poddano sekwencjonowaniu (firma Genomed S.A.).
Przed wykorzystaniem w reakcji transkrypcji in vitro, uzyskane konstrukty linearyzowano wykorzystując enzym restrykcyjny NotI.
6.2.2. Konstrukt dsDNA zawierający wariant regionu terminalnego 5’ mRNA p53 o długości 166 nukleotydów
Konstrukt dsDNA, zawierający wariant regionu terminalnego 5’ mRNA p53 o długości 166 nukleotydów otrzymywano wieloetapowo, w reakcjach PCR. W pierwszej, z nich za pomocą starterów Fm409 i RmORF namnożono sekwencję odpowiadającą sekwencji kodującej mRNA p53 oraz 138 nukleotydowy 5’UTR, stanowiącą insert wektora pCMV6. Reakcja PCR zawierała: 5 ng plazmidu pCMV6, 0,2 mM każdego dNTP, 0,5 µM startera Fm409, 0,5 µM startera RmORF, 2 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl. Reakcję rozpoczęto od 3 minut denaturacji w 95°C, a następnie prowadzono przez 30 cykli: 30 sekund w 95°C, 30 sekund w 58°C, 1 minuta w 72°C, po czym następowało końcowe wydłużanie przez 10 minut w 72°C.
W następnym etapie dodano fragment dsDNA brakujący do uzyskania 166-nukleotydowego fragmentu 5’UTR. Do wydajnej transkrypcji in vitro z promotora dla polimerazy T7 RNA wskazana jest reszta guanozyny na końcu 5’ transkryptu. W związku z powyższym, zdecydowano się na wydłużenie sekwencji o 4 nt tak, aby powstały produkt PCR na końcu 5’ zawierał dwie, naturalnie występujące reszty guanozynowe. Reakcję PCR przeprowadzono wykorzystując produkt PCR uzyskany w pierwszym etapie oraz startery
143 Fm376-2G i RmORF. Reakcję przeprowadzono w warunkach takich samych jak w przypadku namnażania pierwszego fragmentu 409-ORF.
W ostatnim etapie syntezy matrycy przeprowadzono reakcję PCR, w której dodano sekwencję promotora dla polimerazy T7 RNA do fragmentu DNA powstałego w drugiej reakcji PCR. W reakcji wykorzystano startery FmT7zakl i RmORF. Reakcję przeprowadzono w warunkach takich samych jak w przypadku namnażania pierwszego fragmentu 409-ORF.
Po każdej reakcji PCR uzyskany produkt oczyszczano wykorzystując zestaw do oczyszczania produktów reakcji PCR Gene MATRIX PCR/DNA Clean-Up Purification Kit (EurX). Sekwencje wykorzystanych starterów zaprezentowano w tabeli 9.
Tabela 9. Lista starterów wykorzystanych do wytworzenia konstruktu dsDNA zawierającego wariant regionu terminalnego 5’ mRNA p53 o długości 166 nt.
Nazwa startera Sekwencja 5’→3’ Fm409 AAGTTCTGTAGCTTCAGTTCATT Fm376-2G GGACTTTCCCCTCCCACGTGCTCACCCTGGCTAAAGTTCTGTAGCTT FmT7zakl TAATACGACTCACTATAGGACTTTCCCCT RmORF TCAGTCTGAGTCAGGCCCCACT
6.2.3. Cząsteczki dsDNA stanowiące matryce do syntezy izolowanych elementów strukturalnych zlokalizowanych w regionie terminalnym 5’ mRNA p53
Syntezę dsDNA przeprowadzono za pomocą reakcji PCR, wykorzystując wymienione w tabeli 10startery F (ang. primer forvard) oraz R (ang. primer reverse). Startery F zawierały również na końcu 5’ sekwencję promotora dla polimerazy T7 RNA. Cząsteczki syntetyzowano wykorzystując reakcję PCR, składającą się z następujących komponentów: 3 mM MgCl2, 0,2 mM każdego dNTP, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4), 50 mM KCl, 150 pmoli odpowiedniego stratera F i R oraz 5 U polimerazy DNA Taq. Matrycę do syntezy cząsteczki U41:U140 stanowił plazmid zawierający sekwencję nukleotydową p53 z 122-nukleotydowym
144 regionem 5’UTR. Reakcję rozpoczęto od minuty denaturacji w 95°C, następnie prowadzono przez 30 cykli: 30 sekund w 95°C, 30 sekund w 60°C, minutę w 72°C, po czym następowało końcowe wydłużanie przez 10 minut w 72°C. Produkty PCR rozdzielano na 1% żelu agarozowym i wycinano niższy prążek, celem oddzielenia pożądanego produktu od matrycy. Produkt reakcji odzyskiwano z żelu wykorzystując kolumienki Gel extraction kit Ultrafree®
DA (ROTH), po czym ponownie namnażano w reakcji PCR stosując te same warunki temperaturowe. Syntezę cząsteczek C(-200):G(-102), C(-51):G9 i A89:U140 rozpoczęto od 2 minut denaturacji w 94°C, a następnie prowadzono przez 8 cykli: 30 sekund w 94°C, 90 sekund w 72°C, po czym następowało końcowe wydłużanie przez 5 minut w 72°C.
Tabela 10. Lista starterów do syntezy izolowanych elementów strukturalnych
Nazwa startera Sekwencja 5’→3’ Otrzymywana cząsteczka dsDNA FmT7C (-200):G(-102) TAATACGACTCACTATAGCCAGGAGTCTCGCGG GGGTTGCTGGGATTGGGACTTTCCCCTCCCACGT C(-200): G(-102) RmT7C(-200): G(-102) GCCAGGATGGTCCCAATGAACTGAAGCTACAGAACTTT AGCCAGGGTGAGCACGTGGGAGGGGAAAGTCCCAATCC C(-200): G(-102) FmT7C(-51) :G9 TAATACGACTCACTATAGCTCCTCCTTCCCAGCAGGGTG TCACGCTTCTCCGAAGA C(-51):G9 RmT7C(-51): G9 CTCCTCCATGGCAGTCATCCAGTCTTCGGAGAAGCGTGA CACCCTGC C(-51):G9 FmT7A89: U140 TAATACGACTCACTATAGATATCCTGCCATCACCTCACT GCATGGACG A89:U140 RmT7A89: U140 AACATCCTGGGGCAGCAACAGATCGTCCATGCAGTGAG GTGATGGC A89:U140 FmT7U41:U14 0 TAATACGACTCACTATAGGTGAGCCAGGAGACATTTTCA GGCTTA U41:U140 RmT7U41:U14 0 ACATCCTGGGGCAGCAACAGAT U41:U140;
145 Wszystkie otrzymane cząsteczki oczyszczano wykorzystując zestaw do oczyszczania produktów reakcji PCR Gene MATRIX PCR/DNA Clean-Up Purification Kit (EurX) oraz rozdzielano na 1% żelu agarozowym w celu analizy jakościowej.
Cząsteczkę DNA stanowiącą matrycę do syntezy RNA składającego się z 122-nukleotydowego 5’UTR i 201 nt sekwencji kodującej otrzymywano poprzez trawienie restrykcyjne enzymem Psp5II plazmidu zawierającego sekwencję mRNA(-122).
RNA powstałe na matrycy zaprojektowanych dsDNA wykorzystano w dalszych etapach pracy do analizy struktury trzeciorzędowej metodami małokątowego rozpraszania promieniowania rentgenowskiego (SAXS, ang. small-angle X-ray scattering) oraz dichroizmu kołowego (CD, ang. circular dichroism). Ponadto, fragmenty C(-200):G(-102), C(-51):G9 oraz A89:U140 wykorzystano do analizy struktury drugorzędowej stosując mapowanie za pomocą cięć indukowanych w obecności jonów Pb2+.