Oznaczenia biochemiczne

W pracy oznaczano następujące parametry biochemiczne:

•

•

•

•

•

Krew do badań pobierano z żyły łokciowej w stanie spoczynku. Do pobierania krwi

wykorzystano probówki z zamkniętym systemem aspiracyjno-próżniowym typu S-Monovette® (Sarstedt, Niemcy). W zależności od rodzaju oznaczanego parametru

biochemicznego do analizy wykorzystano surowicę, osocze lub krew pełną.

Przygotowanie próbek surowicy do oznaczeń VEGF, FGF oraz angiostatyny:

Krew na surowicę pobierano do probówko-strzykawki z aktywatorem krzepnięcia. Po uzyskaniu skrzepu (ok. 20-30 min.) wirowano przy 1000 x g przez 15 min. W następnej kolejności uzyskaną surowicę rozpipetowano w odpowiednich objętościach do probówek typu eppendorf i przechowywano w temperaturze – 20 ^oC do czasu wykonania analiz.

Przygotowanie próbek osocza do oznaczeń oraz cGMP:

Krew na osocze pobierano do probówko-strzykawki zawierającej 1,6 mg EDTA/ml krwi. W ciągu 30 min. od pobrania wirowano przy 1000 x g przez 15 min. Uzyskane w ten sposób osocze rozpipetowano w odpowiednich objętościach do probówek typu eppendorf i przechowywano w temperaturze – 20 °C do czasu wykonania analiz.

Przygotowanie próbek krwi pełnej do oznaczenia GSH:

Krew pełną pobierano do probówko-strzykawki zawierającej EDTA jako antykoagulator. Materiał zabezpieczano w probówkach typu eppendorf i przechowywano w zamrażarce, w temp – 80 °C do czasu wykonania analiz.

• Oznaczenia czynnika wzrostu śródbłonkowego (VEGF):

VEGF oznaczono z surowicy krwi za pomocą zestawu ELISA (R&D Systems Europe Ltd, Wielka Brytania) zgodnie z dostępną instrukcją producenta. Czułość metody wynosiła 9 pg/ml.

Do analizy wykorzystano polistyrenową mikropłytkę zawierającą dołki opłaszczone monoklonalnym przeciwciałem przeciwko VEGF. W analizie wykorzystano test kanapkowy

tzw „sandwich test” z przeciwciałem wychwytującym (I-rzędowe przeciwciało) i detekcyjnym (II-rzędowe przeciwciało).

W początkowym etapie, na dołki mikropłytki rozpipetowano 100 µl badanej próbki surowicy oraz odpowiednio rozcieńczonego roztworu wzorcowego. Następnie mikropłytkę inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. W następnej kolejności 3- krotnie przepłukiwano wszystkie dołki buforowym roztworem wodnym (400 µl).

Na odpowiednio osuszoną płytkę naniesiono 200 µl koniugatu VEGF (II-rzędowe przeciwciało) znakowanego peroksydazą chrzanową.

W przeprowadzonym teście ELISA antygen VEGF w pierwszej kolejności uległ związaniu z nieznakowanym przeciwciałem detekcyjnym znajdującym się na płytce. Następnie przeciwciało znakowane peroksydazą chrzanową przyłączając się do przeciwciała detekcyjnego umożliwiło identyfikację szukanego antygenu wywołując barwną reakcję po dodaniu odpowiedniego substratu.

Pomiar VEGF wykonano za pomocą spektrofotometru mikropłytkowego Epoch™ (BioTek Instruments Inc, USA) z oprogramowaniem Gen5, przy długości fali 450 nm, stosując jako referencyjną falę o długości 570 nm. Stężenie VEGF w badanych próbkach określano na podstawie krzywej wzorcowej [162].

• Oznaczenia czynnika wzrostu fibroblastów (FGF):

FGF oznaczono z surowicy krwi, wykorzystując metodę immunoenzymatyczną przy użyciu wysokoczułego zestawu ELISA (R&D Systems Europe Ltd., Wielka Brytania). Zastosowany test immunoenzymatyczny typu podwójnego wiązania, inaczej „sandwich test” umożliwił detekcje antygenu przy udziale przeciwciała wychwytującego i detekcyjnego. Czułość metody wynosiła 0,07pg/ml.

Do każdego dołka mikropłytki rozpipetowano 100 µl próbki badanej i standardu. Następnie mikropłytkę z opłaszczonymi przeciwciałami monoklonalnymi inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej na orbitalnej wytrząsarce płytkowej (prędkość obrotowa mieściła się w zakresie: 50-500 obrotów). Po inkubacji mikropłytkę 6-krotnie przemywano buforem wodnym i odpowiednio osuszano. W następnej kolejności dodano 200 µl koniugatu FGF (przeciwciało detekcyjne) do każdego dołka mikropłytki i ponownie inkubowano płytkę oraz 6-krotnie przemywano buforem wodnym. Po dodaniu do każdego dołka 50 µl roztworu substratu (liofilizowany NADPH), a następnie 50 µl wzmacniacza, zaobserwowano zmianę barwy roztworu.

W trakcie testu poszukiwany antygen FGF w pierwszej kolejności uległ związaniu z przeciwciałami znajdującymi się na mikropłytce. W następnym etapie przeciwciało

znakowane enzymem uległo związaniu z przeciwciałem monoklonalnym, co umożliwiło dektekcję antygenu po dodaniu substratu.

Absorbancję próbek mierzono przy długości fali 490 nm, stosując jako referencyjną falę o długości 650 nm, na spektrofotometrze mikropłytkowym Epoch™ (BioTek Instruments Inc, USA) z oprogramowaniem Gen5. Stężenie FGF w badanych próbkach określano na podstawie krzywej wzorcowej [163].

• Metoda oznaczenia angiostatyny:

Angiostatynę oznaczono z surowicy krwi metodą immunoenzymatyczną ELISA za pomocą zestawu ELH-Angiostatin (RayBio Inc., USA).

Do analizy parametru wykorzystano test typu podwójnego wiązania. Czułość metody wynosiła 20 ng/ml. W teście zastosowano 96-dołkową mikropłytkę polistyrenową opłaszczoną przeciwciałami wychwytującymi.

Po dodaniu 100 µl próbki surowicy i roztworu wzorcowego do każdego dołka mikropłytkę inkubowano przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej.

Zgodnie z zasadą działania testu „sandwich test„ w pierwszej kolejności badany antygen uległ związaniu z nieznakowanym przeciwciałem na mikropłytce. W kolejnym etapie przeciwciało znakowane enzymem połączyło się z przeciwciałami monoklonalnym tworząc tzw strukturę kanapki, czyli antygenu zawieszonego pomiędzy dwoma warstwami przeciwciał.

Wartości absorbancji przeprowadzono dla długości fali 450 nm. Stężenie angiostatyny w badanej próbce odczytano z krzywej wzorcowej [164].

• Metoda oznaczania zredukowanego glutationu (GSH): 1) Przygotowanie próbek do oznaczania GSH:

Po rozmrożeniu i wymieszaniu próbki dodano 350 µl 5 % kwasu meta fosforowego (MPA). Następnie materiał wirowano z prędkością 1000 obr. w wirówce przez 10 min. Dodano 50 µl ekstraktu MPA do 3 ml buforu analitycznego (assay bufor). Do momentu użycia rozcieńczony roztwór przechowywano na lodzie.

Oznaczenia zredukowanego (GSH) opierało się na metodzie kolometrycznej przy zastosowaniu zestawu BIOXYTECH GSH/GSSSG-412.

Ilościowa ocena całkowitego glutationu (utlenionego i zredukowanego) polegała na zastosowaniu odczynnika Ellmana, czyli 5,5’ kwasu 5,5'-ditio-bis-2-nitrobenzenowego (DTNB), który w wyniku reakcji z GSH tworzy związek wykrywalny za pomocą spektofotometrii przy długości fali 412 nm [165].

Oznaczenie stężenia cGMP:

Stężenia cGMP oznaczono w osoczu EDTA metodą ELISA z zastosowaniem konkurencyjnego testu (R&D Systems Europe Ltd., Wielka Brytania) o czułości zestawu równym 3,06 pmol/ml. Do analizy biochemicznej wykorzystano 96-dołkową mikropłytkę opłaszczoną przeciwciałami monoklonalnymi.

Na dołki mikropłytki rozpipetowano 100 µl badanej próbki i roztworu wzorcowego, 50 µl cGMP związanego z peroksydazą chrzanową oraz 50 µl koniugatu przeciwciał anty-cGMP. Przez 3 godziny mikopłytkę inkubowano na wytrząsarce, a następnie 4-krotnie przemywano. Dodany w końcowym etapie substrat wywołał barwną reakcję.

Metoda, którą zastosowano do oznaczenia antygenu opierała się na tzw. teście konkurencyjnym. W trakcie analizy cGMP z badanej próbki osocza, konkurowało z cGMP związanym z peroksydazą chrzanową o miejsce wiązania z przeciwciałem anty-cGMP. Jednocześnie za pomocą przeciwciał umieszczonych na płytce możliwa była detekcja przeciwciał związanych z cGMP znakowanych peroksydazą. Pomiar wykonywano za pomocą czytnika mikropłytek Elx800™ (BioTek Instruments Inc, USA) z oprogramowaniem KC4, przy długości fali 450 nm. Jako referencyjną zastosowano falę o długości 570 nm. Natężenie barwy było wprost proporcjonalne do ilości związanego z peroksydazą cGMP i odwrotnie proporcjonalne do ilości badanego antygenu cGMP. Stężenie cGMP w badanych próbkach określano na podstawie krzywej wzorcowej [166].

• Oznaczenie stężenia L-argininy i jej metylowych pochodnych: ADMA i SDMA: Oznaczenia stężenia L-argininy oraz ADMA i SDMA przeprowadzono metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej-HPLC z spektrofluoresceinowym pomiarem detekcji za pomocą chromatografu firmy Varian. Całość analizy chromatograficznej odbywała się pod kontrolą oprogramowania komputerowego Star Chromatography Workstation ver. 6.3.

Do próbek badanych i wzorcowych dodano 10 µmol/l L-homoargininy. Dalsza analiza osocza odbywała się techniką ekstrakcji SPE (Solid Phase Extraction) na kolumienkach SCX-50 (Varian Inc., Palo Alto, USA).

W kolejnym etapie zastosowano derywatyzację z odczynnikiem OPA (o-ftaldialdehyd-5,4 mg/ml w buforze boranowym o pH 8,4 i 0,4 % v/v 2-merkaptoetanol), a następnie otrzymane anality poddano rozdziałowi chromatograficznemu.

Chromatografię przeprowadzono w systemie izokratycznym na kolumnie Symmetry C-18, 150 x 4,6 mm, 5µ (Waters Co., Milford USA) w temperaturze 35 ^oC, przy użyciu 50 mM buforu fosforanowego z 12 % acetonitrylem i przepływem 1,1ml/min.

Detekcja fluoresceinowa odbywała się przy długości fali wzbudzenia 340nm i emisji 450 nm. Porównanie odpowiednich współczynników (L-argininy/L-homoargininy, ADMA/L-homoargininy i SDMA/L-ADMA/L-homoargininy) ze standardami o znanych stężeniach umożliwiło wyliczenie stężeń szukanych parametrów [167, 168, 169].