Oznaczenia wybranych wskaźników biochemicznych krwi

W badanych grupach zarówno wśród osób zdrowych, jak i otyłych przeprowadzono oznacze-nia zawartości wskaźników biochemicznych krwi, umożliwiających ocenę stanu odżywieoznacze-nia. Krew w ilości 10 cm3 pobierano w laboratorium klinicznym na czczo, z żyły łokciowej do probówek na skrzep. Po uformowaniu skrzepu, krew odwirowywano, a uzyskaną surowicę mrożono i przechowywano w temperaturze -80ºC. Przed zamrożeniem każdą z surowic dzie-lono na kilka mniejszych próbek w celu uniknięcia kilkukrotnego rozmrażania i zamrażania.

Oznaczono:

stężenie cholesterolu całkowitego (mg/dl)

 w surowicy krwi oznaczano testem

BioSystems metodą enzymatyczną z oksydazą i peroksydazą po hydrolizie i utlenieniu wolnego cholesterolu. W reakcji nadtlenku wodoru z 4-aminoanty-piryną i fenolem w obecności peroksydazy powstawała barwna chinoimina, któ-rej zawartość była mierzona spektrofotometrycznie przy długości fali 500 nm. Do oznaczenia pobierano 1 cm3 reagentu oraz 0,01 cm3 surowicy. Próbę inku-bowano w temperaturze 37°C w łaźni wodnej przez 5 minut. Stężenie chole-sterolu proporcjonalne do stężenia barwnego kompleksu wyliczano ze wzoru:

C_próba = A _próba /A _standard - c _standard

gdzie:

A_próba – absorbancja próby badanej;

A_standard – absorbancja standardu;

C_standard – stężenie standardu;

C_próba –stężenie próby badanej.

stężenie cholesterolu frakcji HDL (mg/dl)

 w surowicy krwi oznaczano

te-stem BioSyte-stems z odczynnikiem wytracającym – polietylenoglikolem. Lipo-proteiny o niskiej i bardzo niskiej gęstości strącano za pomocą jonów magne-zowych oraz fosforowolframianu. Supernatant zawierał tylko frakcje choleste-rolu HDL. Oznaczono stężenie cholestecholeste-rolu w supernatancie metodą stosowa-ną do oznaczania stężenia cholesterolu całkowitego. Do oznaczenia pobierano

1 cm3 reagentu oraz 0,1 cm3 supernatantu. Próby inkubowano w temperaturze

37°C w łaźni wodnej przez 10 minut. Absorbancję próbek oraz standardu mie-rzono przy długości fali 500 nm. Stężenie cholesterolu frakcji HDL wyliczono korzystając z wzoru:

C_próba = (A _próba /A _standard - c _standard) * współczynnik rozcieńczenia

gdzie:

A_próba – absorbancja próby badanej;

A_standard – absorbancja standardu;

C_standard – stężenie standardu;

C_próba – stężenie próby badanej.

stężenie triglicerydów (mg/dl)

 w surowicy krwi oznaczano testem

BioSys-tems metodą enzymatyczną. Glicerol powstaje podczas enzymatycznej hydro-lizy triglicerydów. W obecności kinazy glicerolowej uwalnia się reszta

fos-inkubowano w temperaturze 37°C w łaźni wodnej przez 5 minut. Mierzono absorbancję prób badanych oraz standardu wobec próby ślepej (nieprzereago-wany odczynnik). Stężenie triglicerydów wyliczono korzystając z wzoru:

C_próba = A _próba /A _standard - c _standard

gdzie:

A_próba – absorbancja próby badanej;

A_standard – absorbancja standardu;

C_standard – stężenie standardu;

C_próba – stężenie próby badanej.

stężenie cholesterolu LDL

 w surowicy krwi – obliczano z wzoru Friedewalda:

cholesterol LDL = cholesterol całkowity – HDL – ^triglicerydy 5

stężenie glukozy (mg/dl)

• w surowicy krwi oznaczano metodą enzymatyczą,

wykorzystując test BioSystems. Zasada metody opiera się na enzymatycznym utlenianiu glukozy w obecności oksydazy glukozowej. Powstający w wyniku re-akcji nadtlenek wodoru reaguje w obecności peroksydazy z 4-aminoantypiryną i fenolem dając barwny kompleks, którego stężenie, proporcjonalne do stężenia glukozy, było mierzone spektrofotometrycznie przy długości fali 500 nm. Do oznaczenia pobierano 1 cm3 reagentu oraz 0,01 cm3 surowicy. Próby inkubowano

w temperaturze 37°C w łaźni wodnej przez 5 minut. Stężenie glukozy obliczono wg następującego wzoru:

C_próba = A _próba /A _standard x c _standard

gdzie:

A_próba – absorbancja próby badanej;

A_standard – absorbancja standardu;

C_standard – stężenie standardu;

C_próba – stężenie próby badanej.

W obu grupach badanych wykonano także oznaczenia zawartości w surowicy krwi następujących wskaźników:

adiponektyny

• , której stężenie w surowicy krwi oznaczono metodą

immunoenzy-matyczną fazy stałej (ELISA) wykorzystując zestaw firmy R&D Systems. Następ-nie 96-dołkową mikropłytkę opłaszczano mysim przeciwciałem, swoistym wzglę-dem ludzkiej adiponektyny w stężeniu 1 μg/cm3. Płytkę zabezpieczoną przed parowaniem inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po usunięciu

inkubacji płytkę ponownie płukano i nanoszono po 100 μl biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiej adiponektynie w

stę-żeniu 200 ng/cm3. Następnie do dołków dodano po 100 μl kompleksu

enzyma-tycznego streptawidyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP). Jako ze-staw do wizualizacji reakcji enzymatycznej wykorzystano substrat TMB firmy R&D Systems. Pomiar absorbancji wykonywano przy użyciu spektrofotometru uQuant firmy BioTek przy długości fali 450 nm. Obliczenia zawartości adiponekty-ny w surowicy krwi przeprowadzono na podstawie krzywej standardowej 4-parame- trycznej.

leptyny

• , której stężenie w surowicy krwi oznaczono metodą

immunoenzyma-tyczną fazy stałej (ELISA) wykorzystując zestaw firmy R&D Systems. Następnie 96-dołkową mikropłytkę opłaszczono przeciwciałem poliklonalnym, swoistym względem ludzkiej leptyny w stężeniu 1 μg/cm3. Płytkę zabezpieczoną przed pa-rowaniem inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Po usunięciu prze-ciwciał opłaszczających, płytkę płukano trzykrotnie buforem (0,05% Tween 20 w PBS). Do dołków nanoszono po 100 μl odpowiednio rozcieńczonej surowicy. Każde rozcieńczenie wykonywano w dwóch powtórzeniach. Po okresie inkuba-cji płytkę ponownie płukano i nanoszono po 100 μl biotynylowanego koziego przeciwciała skierowanego przeciwko ludzkiej leptynie w stężeniu 200 ng/cm3. Następnie do dołków nanoszono po 100 μl kompleksu enzymatycznego strepta-widyny sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP). Jako zestaw do wizualizacji reakcji enzymatycznej wykorzystano substrat TMB firmy R&D Systems. Pomiar absorbancji wykonywano przy użyciu spektrofotometru uQuant firmy BioTek przy długości fali 450 nm. Obliczenia zawartości leptyny w surowicy krwi prze-prowadzono na podstawie krzywej standardowej 4-parametrycznej.

insuliny

• , której zawartość w surowicy krwi oznaczano metodą

immunoenzyma-tyczną, z wykorzystaniem przeciwciał monoklonalnych. Jednoczesna inkubacja próby badanej i znakowanych enzymem przeciwciał w dołkach płytki opłaszczo-nych drugim, swoistym dla insuliny przeciwciałem powoduje powstawanie kom-pleksu, który następnie jest wykrywany w reakcji 3,3’,5,5’-tetrametylobenzydyną (TMB). Pomiar powstałego zabarwienia mierzony jest spektrofotometrycznie przy długości fali 450 nm. Do dołków opłaszczonych przeciwciałem monoklonalnym dodawano po 0,025 cm3 surowicy, standardu i ślepej próby, następnie dodawano

0,1 cm3 koniugatu. Płytkę inkubowano przez 60 min w temperaturze pokojowej,

następnie dołki płukano 3-krotnie. W kolejnym etapie do każdego z dołków doda-wano 0,1 cm3 substratu TMB i inkubowano płytkę przez 15 min w temperaturze

pokojowej. Reakcję barwną zatrzymywano dodając 0,1 cm3 roztworu hamującego.

Zakresy referencyjne wyników przyjęto zgodnie z wytycznymi Grupy Ekspertów Amerykańskiego Narodowego Programu Edukacji Cholesterolowej [U.S. NCEP, 2005] oraz American Heart Association Nutrition Committee [Lichtenstein i wsp. 2006] i przyję-tymi w Polsce w roku 2010 wytycznymi Polskiego Towarzystwa Diabetologicznego [PTD 2010].

Wśród badanych osób zdrowych oszacowano również ryzyko wystąpienia choroby niedokrwiennej serca w ciągu 10-letniej obserwacji. Dla każdej osoby, bez wcześniejszego incydentu choroby układu krążenia, określono liczbę punktów uwzględniając opracowany na podstawie Framingham Heart Study algorytm [Grundy i wsp. 2001, Wilson i wsp. 1998]. Liczba uzyskanych punktów związana była z występowaniem czynników ryzyka takich jak: wiek, stężenie cholesterolu całkowitego, palenie papierosów, stężenie cholesterolu frakcji HDL oraz wartość ciśnienia skurczowego. Na podstawie uzyskanych punktów badane osoby zakwalifikowano do grup: niskiego, umiarkowanego lub wysokiego ryzyka choroby niedo-krwiennej serca.

Ryzyko zachorowania na chorobę niedokrwienną serca w ciągu 10 lat obserwacji wy-nosi 1% u osób, które uzyskały liczbę punktów od 9 do 12. Osoby, dla których ryzyko cho-roby niedokrwiennej serca oszacowano na 2–3% (13–15 pkt) zaliczono do grupy niskiego ryzyka. Badanych z liczbą punktów 16–19 zakwalifikowano do grupy umiarkowanego ryzy-ka rozwoju choroby niedokrwiennej serca (ryzyko 4–6%), natomiast osoby, które uzysryzy-kały liczbę punktów > 19 zaliczono do grupy wysokiego ryzyka choroby niedokrwiennej serca (ryzyko 10–30%).