PCR w czasie rzeczywistym

Ocenę zmian ilościowych w poziomie ekspresji wybranych genów przeprowadzono z zastosowaniem metody PCR w czasie rzeczywistym. Istotą metody jest pomiar przyrostu ilości produktu badanej cząsteczki kwasu nukleinowego po każdym cyklu prowadzonej reakcji amplifikacji. Jako system detekcji zastosowano barwnik SYBR Green I. Wzbudzenie SYBR Green I następuje przy użyciu światła niebieskiego o długości fali 470 nm. Spektrum emisji jest porównywalne ze spektrum emisji fluoresceiny z maksimum przy ok. 521nm (Logan i wsp., 2009).

Z chwilą rozpoczęcia reakcji PCR wzrastająca ilość nowo syntetyzowanych nici powoduje wzrost sygnału fluorescencyjnego. Największą zaletą barwnika jest możliwość zastosowania razem z nim dowolnej pary starterów i matryc, dzięki czemu metoda ta staje się uniwersalna i mniej kosztowna. Jednocześnie jest wystarczająco czuła, aby wykryć pojedynczą kopię DNA w mieszaninie reakcyjnej. Ograniczeniem systemu bazującego na SYBR Green I jest rozpoznawanie niespecyficznych sekwencji DNA. W rzeczywistości zliczana jest każda dwuniciowa cząsteczka DNA obecna w mieszaninie reakcyjnej, łącznie z niespecyficznymi produktami reakcji PCR i dimerami starterów. Istnieje zatem niebezpieczeństwo uzyskania zawyżonych lub fałszywie pozytywnych wyników. Aby przezwyciężyć ten problem i potwierdzić obecność specyficznego produktu po zakończonej reakcji amplifikacji wykonano analizy krzywych topnienia amplikonu.

Reakcje PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono na aparacie Rotor Gene 3000 (Corbett Research) z wykorzystaniem odczynnika MESA GREEN qPCR kit (Eurogentec).

57 4.3.7.1 Względna analiza ilościowa

Wszystkie odmiany PCR w czasie rzeczywistym, niezależnie od sposobu detekcji, opierają się na tej samej zasadzie pomiaru ilości DNA. Po każdym cyklu mierzony jest poziom fluorescencji w odpowiadającym wybranemu fluorochromowi zakresie widma. Ocena ilościowa pozwala ustalić wyjściową ilość matrycy w badanej próbie, wyrażoną w liczbie kopii lub stężeniu. Określenie poziomu ekspresji genu w takiej postaci możliwe jest dzięki zastosowaniu zewnętrznych standardów. Funkcję standardu może pełnić cDNA docelowego genu, syntetyzowane in vitro ssDNA lub sklonowany, powielony i oczyszczony fragment sekwencji docelowego genu. Na podstawie wartości CT (ang. copy threshold, czyli numer cyklu, od którego reakcja wchodzi w fazę logarytmicznego wzrostu) uzyskiwanych dla kolejnych rozcieńczeń standardu, wykreślana jest krzywa regresji (zwana krzywą standardową, ang. standard curve) logarytmu stężenia matrycy (oś X) w odniesieniu do otrzymanych wartości C_T (oś Y). Ocenę ilościową w badanej próbie ustala się przez naniesienie uzyskanych wartości CT

prób badanych na krzywą standardową, której równanie przedstawione jest wzorem: CT = m x log(conc) + B

gdzie: CT – copy threshold, log(conc) - logarytm stężenia, m – nachylenie krzywej, B – wartość CT dla stężenia równego jednej jednostce

Wartość CT jest proporcjonalna do logarytmu wyjściowej ilości matrycy w próbie tj. im więcej kopii badanej sekwencji znajdowało się w momencie rozpoczęcia reakcji, tym mniej cykli potrzeba, aby poziom fluorescencji pochodzący z powstałych produktów przekroczył wartość C_T.

Na podstawie krzywej standardowej można określić także wydajność amplifikacji (ang. efficiency, Eff). Obliczana jest ona ze wzoru:

Eff = 10(-1/m) – 1

Poniżej przedstawiona rycina 7 ilustruje dwie krzywe (amplifikacyjną oraz standardową) otrzymane w wyniku reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

58

Ryc.7. A – krzywa amplifikacyjna: 1, faza pierwsza reakcji (fluktuacje sygnału pochodzące z tła); 2 , faza logarytmiczna reakcji; 3, faza plateau; NTC (ang. no template control), kontrola negatywna; Rn+, iloraz intensywności emisji fluorescencji barwnika; Rn-, poziom tła tj. średni poziom fluorescencji w początkowej fazie reakcji; B, krzywa standardowa opisana wzorem CT= m x log(c) +B (rycina pochodzi z Ciesielska i wsp., 2008)

Wydajność reakcji powinna mieścić się w przedziale 90–100%. Nachylenie krzywej wynoszące -3.322 odpowiada 100% wydajności reakcji, zaś m=-3.8 odpowiada wydajności równej 83%. O wiarygodności otrzymanych wyników świadczy wartość współczynnika korelacji (ang. correlation coefficient, square regression coefficient, R2). R2 w kontekście ilościowym określa procent danych znajdujących się na krzywej standardowej, tworzonej przez serie rozcieńczeń standardu. Zbyt niska wartość współczynnika korelacji oznacza, że zadane standardy nie mogą być odpowiednio dopasowane do krzywej, a w konsekwencji uzyskane wyniki są nierzetelne. Prawidłowa wartość R² zbliżona jest do 0.99. Rzetelna analiza ilościowa wymaga korekcji eksperymentalnych odchyleń indywidualnych wydajności odwrotnej transkrypcji badanych prób. Wynika to z faktu, iż różnice wydajności odwrotnej transkrypcji skutkują w ilości cDNA, która nie koresponduje z wyjściową ilością RNA (Wong i Medrano, 2005)

59

Normalizacja względem genu o stałym poziomie ekspresji, stanowiącym tzw. wewnętrzny gen referencyjny (ang. housekeeping gene), jest obecnie powszechnie akceptowaną metodą korekcji nieznacznych wariacji spowodowanych różnicą w wydajności odwrotnej transkrypcji (Giulietti i wsp., 2001). Poziom ekspresji badanego genu w ocenie relatywnej determinowany jest i przedstawiany jako stosunek między ilością transkryptu genu badanego a ilością transkryptu wewnętrznego genu referencyjnego we wszystkich próbach. Wartość ta jest kolejno porównywana pomiędzy próbami np. pochodzącymi z różnych organów lub też tkanek.

Analizę ilościową przeprowadzono w celu i) określenia poziomu wyciszenia genu Mtcsbp oraz zmian w poziomie ekspresji wybranych genów, będących wynikiem obniżenia poziomu ekspresji genu Mtcsbp (geny: Mtpr10.1, Mtcre1, Mthpt, Mtga2ox), ii) potwierdzenia wyników analizy proteomicznej (geny: Mtoee1, Mtgh17, Mt14-3-3,). Badania rozpoczęto od przygotowania standardów reakcji PCR w czasie rzeczywistym dla każdego z w/w genów. Standardy (zamiennie zwane produktami PCR) amplifikowano z użyciem specyficznych par starterów, sprawdzano w 1.5% żelu agarozowym z dodatkiem EtBr a następnie oczyszczano na kolumnach (QIAprep, Qiagen). Stężęnia produktów PCR zmierzono w aparacie NanoDrop. Dla każdego standardu przygotowano serię pięciu 10-krotnych rozcieńczeń, wykonanych w czterech powtórzeniach. Zakres rozcieńczeń standardów został wyznaczony eksperymentalnie i dobrany tak, aby zawierał w sobie spodziewane poziomy ekspresji badanych genów. Dla każdego genu przeprowadzono osobną reakcję PCR w czasie rzeczywistym, podczas której wykonano krzywą standardową oraz oznaczono współczynniki reakcji tj. współczynnik korelacji oraz wydajność reakcji.

W celu weryfikacji specyficzności amplifikacji wykonano analizę krzywych topnienia powstałych produktów oraz wykonano rozdział elektroforetyczny (2% żel agarozowy z EtBr lub DNAChip – Bioanalyzer2100). Pomiar poziomu ekspresji badanych genów odbywał się na matrycy cDNA, powstałego w wyniku odwrotnej transkrypcji 200 ng całkowitego RNA. Każdą próbę powtórzono dwukrotnie. Po zakończeniu reakcji PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzona została analiza krzywej topnienia powstałych produktów, potwierdzająca specyficzność reakcji. Wyniki CT otrzymane podczas reakcji na matrycy cDNA naniesiono na wcześniej przygotowane krzywe standardowe. Otrzymane dane liczbowe poziomu ekspresji badanych genów znormalizowano względem poziomu ekspresji genu referencyjnego – β aktyny.

60

Tabela 11. Schemat reakcji PCR w czasie rzeczywistym zastosowany podczas analiz genów: Tm =52°C (Mtga2ox, Mtaktyna, Mtcsbp); Tm=55°C (Mtpr10.1, Mtcre1) Tm =58°C (MthptI)

Skład mieszaniny qPCR stężenie ^Ilość _[μl] Etap temperatura Czas

SYBR Green I mix* 2 x 12.5 ^{1. denaturacja} _{2. denaturacja} ^95°C_95°C ^{5 min} _{10 s}

starer forward 10 μM 1 3. annealing* 52°C 15 s

starter reverse 10 μM 1 4. elongacja** 72°C 20 s

matryca cDNA/dsDNA 1 ^{5. powtarzanie etapów [2}_{6. topnienie 52°C * -95°C} ^{-4] 40 x} H2O uzupełnienie do 25 μl ^{* temperatura annealingu zależna od} _{temperatury wiązania starterów} * mieszanina buforu reakcyjnego, barwnika

SYBR Green I, dNTP, jonów Mg²⁺, polimerazy DNA,

** czas elongacji zależny od długości produktu reakcji

Tabela 12. Schemat reakcji PCR w czasie rzeczywistym zastosowany podczas analiz genów: Tm =60°C (Mtoee1, Mt14-3-3, Mtgh17)

Skład mieszaniny qPCR stężenie ^Ilość

[μl] ^{Etap temperatura Czas}

SYBR Green I mix* 2 x 12.5 ^{1. denaturacja} _{2. denaturacja} ^95°C_95°C ^{5 min} _{10 s} starer forward 10 μM 1 3. annealing i

elongacja ** 60°C 60 s

starter reverse 10 μM 1

matryca cDNA/dsDNA 1 ^{5. powtarzanie etapów [2}_{6. topnienie 60°C -95°C} ^{-4] 40 x} uzupełnienie H2O do 25 μl

*mieszanina buforu reakcyjnego, barwnika SYBR Green I, dNTP, jonów Mg²⁺, polimerazy DNA,

**czas annealingu i elongacji zależny od długości produktu reakcji