Porównanie mechanicznego rozwijania fibronektyny i kontaktyny

Eksperyment mechanicznego rozwijania fibronektyny i kontaktyny przeprowadzony został z wykorzystaniem tej samej aparatury pomiarowej (z wyjątkiem trzykrotnie wymienianego skanera, zob. § D2.6), z zastosowaniem takiej samej preparatyki próbek oraz metody pomiaru. Uzyskane dane pomiarowe opracowywano według jednakowej procedury.

Tabela 3.5 zawiera zestawienie wszystkich wartości liczbowych, otrzymanych w wyniku

analizy mechanicznego rozwijania fibronektyny i kontaktyny, charakteryzujących własności mechaniczne poszczególnych domen.

Domeny typu FnIII obu białek wykazywały podobne zachowanie podczas mechanicznego rozwijania. Na podstawie analizy pełnych rozwinięć domen, oszacowano ich długości

______________________________________________________________ 3. Analiza wyników eksperymentu

konturowe ((35.5 ± 2.5) nm dla Fn, (36.0 ± 1.5) nm dla Cnt), dobrze zgadzające się ze średnimi liczbami aminokwasów wchodzących w ich skład (90AA dla Fn, 95AA dla Cnt). Obok pełnych rozwinięć domen obserwowano także rozwijanie ich fragmentów, następujące w wyniku częściowej denaturacji, poprzedzającej proces rozwijania (por. § 3.1.3). W przypadku fibronektyny, na podstawie znajomości struktury drugorzędowej wybranych domen FnIII, brakujący fragment, równy (8.5 ± 1.5) nm, został przypisany częściowej denaturacji skrajnych nici β, F i G.

W przypadku kontaktyny, dokładna interpretacja otrzymanej długości konturowej, równej (22.0 ± 1.5) nm, nie była możliwa, ze względu na wkład do otrzymanej wartości, pochodzący od częściowego rozwijania kontaktynowych domen typu IgC2. W warunkach fizjologicznych, rozwinięciu ulega dostępna część łańcucha białkowego, leżąca poza mostkiem siarkowym domeny. Wyciągnięto wniosek, że częściowe rozwinięcia domen IgC2 zachodzą także w środowisku czynnika redukującego. Oznacza to również, że czynnik redukujący TCEP nie działa jednakowo efektywnie na wszystkie domeny.

W Tabeli 3.5 zamieszczono kinetyczne parametry rozwijania, wyznaczone dla

jednoetapo-wego rozwijania domen FnIII i IgC2 obu białek, w oparciu o model Bella (Dąbrowska et al. 2007a, Dąbrowska et al. 2007b).

Tabela 3.5

fibronektyna kontaktyna domena FnIII FnIII IgC2

x_u [nm] 0.30 ± 0.06 0.33 ± 0.10 0.39 ± 0.06

ku^o [s ^–1] 0.023 ± 0.039 0.011 ± 0.033 0.020 ± 0.026

LC1 [nm] 27 ± 1.5 22 ± 1.5

LC2 [nm] 35.5 ± 2.5 36 ± 1.5 33 ± 1.5*

* podana wartość jest w rzeczywistości uśrednioną wartością dla dwóch domen: IgC2 i FnIII (por. § 3.2.1)

Wartości obu parametrów, szerokości potencjału rozwijania xu i szybkości rozwijania ku^o, wyznaczono z dokładnością typową dla pomiaru AFM. Z uwagi na znaczną niepewność oszacowania wartości szybkości rozwijania, istotny jest jedynie otrzymany w pomiarze jej rząd wielkości. Obydwa typy domen obu białek charakteryzuje podobna, stosunkowo duża, szybkość rozwijania.

Wartość szerokości potencjału, uśredniona dla 15 domen fibronektyny naturalnej, równa 0.33 nm, jest wartością pośrednią pomiędzy wartościami x_u otrzymanymi dla kilku zbadanych domen FnIII (por. Tabela 3.1). Z kolei rząd wielkości szybkości rozwijania domen FnIII

fibronektyny, jest bliższy większym wartościom ku^o zawartym w Tabeli 3.1, co mogłoby sugerować, że większość pozostałych, niezbadanych domen FnIII fibronektyny, dla których nie znaleziono indywidualnych wartości ku^o, rozwija się z szybkością rzędu 10 ^–2 s^-1.

Parametry charakteryzujące kinetykę rozwijania domeny IgC2 kontaktyny dostarczają nowych informacji. Zarówno dla synaptotagminy, jak i układu domen Ig melanomy, pokrewnych kontaktynie, badane były układy spolimeryzowane, przy czym tylko dla tego ostatniego, podano oszacowane szerokości potencjału rozwijania, wynoszące średnio 1.6 nm, przy założonej szybkości rozwijania k_u^o = 3⋅10 –3

s^-1.

W celu wyciągnięcia z otrzymanych wyników informacji na temat mechanicznej stabilności domen, za Dietzem i Riefem przyjęto wysokotemperaturową wartość szybkości rozwijania ωo = 10 ⁹ s^-1 (por. § 2.4.2). Dzięki temu, ze wzoru 2.6a, dla T=296 K, otrzymano wartości ∆G U-‡ wynoszące: 24.5 kcal/mol (dla FnIII, Fn), 25.2 kcal/mol (dla FnIII, Cnt) oraz 24.6 kcal/mol (dla IgC2, Cnt). Z bardzo dobrym przybliżeniem można przyjąć jednakową stabilność mechaniczną wszystkich trzech typów domen, porównywalną do wartości wyznaczonych dla domen innych białek (Carrion-Vazquez et al. 1999b, Li et al. 2000a, Craig

et al. 2004).

Szerokość potencjału rozwijania xu , może być interpretowana jako droga, na której siły wykonują pracę rozwijania domeny. Bezwzględną miarą reakcji domeny na mechaniczne rozwijanie jest zmiana energii swobodnej, związana z pracą rozwijania domeny (por. § 2.4.2). Dlatego też spodziewane iloczyny obserwowanych sił rozwijania i szerokości potencjału powinny być jednakowe dla wszystkich analizowanych domen, oczywiście uwzględniając jednakowe warunki pomiarowe. Ponieważ linie proste, ilustrujące zależność siły rozwijania od logarytmu r_f , otrzymane dla domen FnIII oraz IgC2, są w dobrym przybliżeniu równoległe (Rys.3.16), wartość siły rozwijania domeny IgC2 oszacowano na 80% wartości siły rozwijania domeny FnIII, w całym zbadanym zakresie r_f .

Zatem: 06 . 1 39 . 0 8 . 0 33 . 0 2

2 _IgC = ^FnIII_FnIII ≈

u IgC FnIII u FnIII F F x F x F (3.2) Przeprowadzenie mechanicznego rozwijania dwóch dowolnych białek modularnych i policzenie iloczynów Fx_u , pozwala zatem wstępnie porównać stabilności kinetyczne dwóch rodzajów domen (bez wykonywania żmudnego pomiaru dynamiki rozwijania).

______________________________________________________________ 3. Analiza wyników eksperymentu

Powyższy wynik potwierdza zaobserwowaną prawidłowość, dotyczącą sposobu reakcji domen na działającą na nie siłę: mniejsza stabilność domen IgC2 kontaktyny jest wywołana dłuższą drogą działania siły.

Uzyskany wynik niesie informację interesującą z punktu widzenia możliwości projektowania i konstrukcji nowej jakości biomateriałów, charakteryzujących się ściśle określonymi właściwościami, w tym również właściwościami mechanicznymi, które mogą być w pewnym stopniu zdeterminowane własnościami mechanicznymi białek wchodzących w ich skład. Istotnymi parametrami wydają się być przede wszystkim siły rozwijania białkowych domen, przyrosty ich długości konturowej, a także długości konturowe całych białkowych molekuł. W opisywanym tutaj eksperymencie zbadano trzy rodzaje domen. Domeny typu FnIII zarówno fibronektyny jak i kontaktyny, w jednakowych warunkach pomiarowych wykazały podobne zachowanie podczas mechanicznego rozwijania.

Dla domen typu FnIII obu analizowanych białek, zaobserwowano jednakowy przebieg mechanicznego rozwijania: zarejestrowano jednakową stabilność mechaniczną oraz podobne długości charakterystyczne odpowiadające rozwinięciom całych domen. Co ważne, analiza obserwowanych mniejszych długości charakterystycznych, pozwala przypuszczać, że także częściowa denaturacja zachodzi podobnie dla obu białek. Wymienione podobieństwa pozwalają traktować fragmenty obu białek zawierające domeny typu FnIII, jako obiekty równorzędne pod względem mechanicznym.

Domeny typu IgC2 kontaktyny, od domen typu FnIII odróżnia odmienna topologia wiązań wodorowych oraz obecność wewnętrznych mostków dwusiarkowych. Te ostatnie są odpowiedzialne za olbrzymią stabilność domen IgC2 w środowisku fizjologicznym. W takich warunkach, domeny stabilizowane mostkami, odporne na naprężenia sięgające kilku nanoniutonów, będą pozostawały w stanie zwiniętym. Redukcja mostków, następująca w momencie wystawienia białka na działanie czynnika redukującego, odblokowuje na rozwijanie domeny o mniejszej stabilności. Wprowadzenie związku chemicznego posiadającego zdolności redukujące, może zatem modyfikować własności mechaniczne hipotetycznego biomateriału, zawierającego domeny typu kontaktynowych domen IgC2. Analiza wyników otrzymanych dla redukowanych domen kontaktyny każe przypuszczać, że działanie zastosowanego czynnika redukującego TCEP nie było stuprocentowe, jednakże skuteczne, w przeciwieństwie do zastosowanego poprzednio czynnika redukującego DTT (Han & Han 1994). Metoda AFM pozwala zatem sprawdzić wydajność działania czynnika redukującego, dla wybranego typu domen.