Z przetwarzanych w ramach niniejszej pracy stosów obrazów wybrano pi¦¢ ko-mórek i dokonano ich r¦cznej rekonstrukcji. Rekonstrukcja zostaªa wykonana z wykorzystaniem programu Neuromorpho.org. Otrzymane w ten sposób szkielety komórek zostaªy porównane ze szkieletami uzyskanymi w drodze automatycz-nej rekonstrukcji. W tym celu ka»d¡ par¦ szkieletów naniesiono na jeden obraz 3D. Osobnymi kolorami zaznaczono pokrywaj¡ce si¦ cz¦±ci szkieletu, a innymi te, które nie maj¡ odpowiadaj¡cego fragmentu w drugim szkielecie. Wyniki takiego porównania zostaªy przedstawione na rysunkach 7.10-7.15. Kolorem niebieskim zaznaczono te cz¦±ci szkieletu otrzymanego w wyniku automatycz-nej rekonstrukcji, które pokrywaªy si¦ ze szkieletem wyznaczonym r¦cznie. Po-zostaª¡ cz¦±¢ wyznaczonego automatycznie szkieletu oznaczono kolorem czer-wonym. Analogicznie podzielono szkielet wyznaczony r¦cznie. Cze±¢ szkieletu, pokrywaj¡ca si¦ ze szkieletem wyznaczonym automatycznie, zostaªa zaznaczona kolorem zielonym. Pozostaª¡ cz¦±¢ szkieletu zaznaczono kolorem
pomara«czo-Rysunek 7.5: Szkielety zrekonstruowanych komórek ze stosu B2. Cz¦±¢ ródªowy dopasowanego stos szkieletu wzgl¦dem r¦cznej rekonstrukcji A3 (1) 89,9% A3 (2) 75,5% B1 37,6% B2 83,4% B3 34,9% B4 61,8%
Tablica 7.1: Zgodno±¢ szkieletu komórek zrekonstruowanych r¦cznie i automa-tycznie
Rysunek 7.6: Szkielety zrekonstruowanych komórek ze stosu B3.
Rysunek 7.8: Szkielety zrekonstruowanych komórek ze stosu B5.
Rysunek 7.10: Porównanie szkieletów komórki ze stosu A3 (komórka 1) otrzy-manych w drodze r¦cznej i automatycznej rekonstrukcji.
Rysunek 7.11: Porównanie szkieletów komórki ze stosu A3 (komórka 2) otrzy-manych w drodze r¦cznej i automatycznej rekonstrukcji.
Rysunek 7.12: Porównanie szkieletów komórki ze stosu B1 otrzymanych w dro-dze r¦cznej i automatycznej rekonstrukcji.
Rysunek 7.13: Porównanie szkieletów komórki ze stosu B2 otrzymanych w dro-dze r¦cznej i automatycznej rekonstrukcji.
Rysunek 7.14: Porównanie szkieletów komórki ze stosu B3 otrzymanych w dro-dze r¦cznej i automatycznej rekonstrukcji.
Rysunek 7.15: Porównanie szkieletów komórki ze stosu B4 otrzymanych w dro-dze r¦cznej i automatycznej rekonstrukcji.
wym.
Aby sprawdzi¢ stopie« pokrycia si¦ porównywanych szkieletów, obliczono ich dªugo±ci oraz dªugo±ci ich pokrywaj¡cych si¦ fragmentów. Za dªugo±¢ szkieletu przyj¦to tutaj sumaryczn¡ dªugo±¢ jego kraw¦dzi w reprezentuj¡cej go struk-turze SWC. W tabeli 7.1 zostaªy zebrane wyniki porównania dªugo±ci dopaso-wanego fragmentu szkieletu do jego caªkowitej dªugo±ci. wyniki otrzymane dla obrazów B1 i B3 s¡ wyra¹nie gorsze ni» dla pozostaªych danych. Jest to spo-wodowane bardzo maª¡ rozdzielczo±ci¡ tych obrazów w osi Z. Podobna sytuacja ma miejsce dla stosu B4. Jego rozdzielczo±¢ wzdªu» osi Z jest wyra¹nie lepsza ni» stosów B1 i B3, lecz nadal jest ona zbyt niska. W pozostaªych przypadkach, tj. dla komórek ze zbiorów A3 i B2, automatyczna rekonstrukcja byªa w stanie prawidªowo wykry¢ co najmniej 75% struktury komórki.
Braki w automatycznie otrzymanych szkieletach s¡ gªównie spowodowane poprzez nierównomierne wybarwienie cytoszkieletu komórek. Dotyczy to w szczególno±ci cie«szych wypustek cytoszkieletu, gdzie niewielki brak w wybar-wieniu powoduje uci¦cie gaª¦zi w otrzymanym w wyniku automatycznej re-konstrukcji szkielecie. Fragmenty automatycznie zrekonstruowanego szkieletu, których nie ma w r¦cznie wyznaczonym szkielecie, s¡ w rzeczywisto±ci fragmen-tami szkieletu innych komórek, lub prawidªowymi gaª¦ziami szkieletu, które nie zostaªy wykryte przez operatora.
Rozdziaª 8
Podsumowanie
8.1 Wnioski ko«cowe
W caªej niniejszej pracy konsekwentnie zmierzano do udowodnienia tezy przed-stawionej w podrozdziale 1.1, która brzmiaªa:
Za pomoc¡ opracowanych algorytmów przetwarzania obrazów, mo»-liwa jest automatyczna, trójwymiarowa rekonstrukcja struktur komó-rek glejowych mózgu. Danymi wej±ciowymi, przyjmowanymi przy tym przetwarzaniu, s¡ serie dwuwymiarowych obrazów, b¦d¡cych ciami preparatu histologicznego tkanki mózgowej. Wykorzystane zdj¦-cia pochodz¡ z mikroskopu konfokalnego.
Tez¦ t¦ dowodzono w sposób konstruktywny, to znaczy w ramach pracy zaprojektowano, zaimplementowano i przetestowano system do automatycznej, trójwymiarowej rekonstrukcji struktury komórek glejowych mózgu. Rekonstruk-cji dokonywano na podstawie stosów obrazów, otrzymanych za pomoc¡ mikro-skopu konfokalnego. Stworzony system, b¦d¡cy najwa»niejszym praktycznym osi¡gni¦ciem pracy zostaª zaprojektowany pod k¡tem automatycznej rekonstruk-cji struktury pewnej klasy komórek glejowych mózgu, a konkretnie tak zwanych astrocytów. Rekonstrukcji dokonywano na podstawie dwóch stosów obrazów, b¦d¡cych wynikiem barwienia preparatu w kierunku GFAP i DAPI. Opracowany i zaimplementowany system jest odpowiedzialny za nast¦puj¡ce etapy procesu rekonstrukcji struktury komórek glejowych mózgu:
• wst¦pne przetwarzanie stosów obrazów otrzymanych za pomoc¡ mikro-skopu konfokalnego
• ekstrakcja z otrzymanego obrazu 3D pojedynczych astrocytów • rekonstrukcja struktury 3D znalezionych komórek
Wszystkie te etapy s¡ wykonywane w peªni automatycznie. Wyznaczone struk-tury wyekstrahowanych komórek mog¡ by¢ zapisane w postaci plików SWC.
W podrozdziale 7.2 porównano struktury komórek otrzymane za pomoc¡ zaprojektowanego systemu z wynikami r¦cznej rekonstrukcji. Pomijaj¡c wyniki
otrzymane dla obrazów o bardzo maªej rozdzielczo±ci, system byª w stanie au-tomatycznie rozpozna¢ struktury analizowanych komórek. Uzyskiwano wyniki na poziomie 75% zgodno±ci (w porównaniu do wyników r¦cznej rekonstrukcji), co mo»na uzna¢ za dobry wynik. Automat zdecydowanie odtwarzaª generaln¡ struktur¦ badanej komórki i prawidªowo j¡ lokalizowaª i orientowaª przestrzen-nie. Rozbie»no±ci pojawiaªy si¦ na etapie odtwarzania drobnych szczegóªów struktury, na przykªad takich, które zostaªy ¹le odwzorowane w procesie bar-wienia. Je±li na przykªad na dªugo±ci której± wypustki znajdowaª si¦ nie wy-barwiony fragment, to do±wiadczony czªowiek, wykonuj¡cy rekonstrukcj¦ 3D r¦cznie, widz¡c dalej dalszy ci¡g wypustki potra ª zaznaczy¢ i wª¡czy¢ do trój-wymiarowej rekonstrukcji tak»e t¦ jej cz¦±¢, która w istocie byªa caªkowicie niewidoczna. Zbudowany w tej pracy system takiej umiej¦tno±ci nie posiada, wi¦c pojawia si¦ rozbie»no±¢ mi¦dzy rekonstrukcj¡ automatyczn¡ i rekonstruk-cj¡ r¦czn¡ obejmuj¡ca nie tylko ten drobny nie wybarwiony poprawnie frag-ment komórki, ale odcinaj¡ca caªy dalszy fragfrag-ment ju» prawidªowo wybarwio-nej wypustki, które jednak nie jest doª¡czona do budowawybarwio-nej rekonstrukcji i daje (mi¦dzy innymi) ten pozornie wysoki poziom rozbie»no±ci mi¦dzy rekonstrukcj¡ r¦czn¡ i automatyczn¡.
W istocie jednak porównanie wyników dziaªania opiniowanego systemu oraz wyników pracy eksperta, mo»liwe do przeprowadzenia na podstawie przykªa-dowych wyników pokazanych w rozdziale 7, dowodzi u»yteczno±ci stworzonego systemu. W przypadku korzystania z oprogramowania stworzonego w ramach tej pracy wynik (w postaci potrzebnego cytoszkieletu komórki) uzyskuje si¦ caª-kowicie automatycznej, podczas gdy uzyskanie tego samego rezultatu za pomoc¡ pracy r¦cznej wymaga od kilkunastu do kilkudziesi¦ciu godzin bardzo uci¡»liwej pracy czªowieka.
Co wi¦cej, wynik automatycznej rekonstrukcji cz¦sto pozwalaª na znalezie-nie fragmentów struktury pomini¦tych podczas r¦cznej rekonstrukcji. Otrzy-mane rezultaty pozwalaj¡ stwierdzi¢, »e na podstawie odpowiednio wykonanych stosów zdj¦¢ preparatu histologicznego tkanki mózgowej, mo»liwa jest automa-tyczna, trójwymiarowa rekonstrukcja struktur astrocytów. W zwi¡zku z powy»-szym mo»na stwierdzi¢, »e teza pracy przedstawiona w podrozdziale 1.1 zostaªa udowodniona.