Produkcja N-acetyloasparaginianu w neuronach cholinergicznych eksponowanych na

N-acetyloasparaginian (NAA) jest wtórnym metabolitem acetylo-CoA produkowanym w wysokich stężeniach. Wiedza na temat wpływu postępującej neurodegeneracji na poziom

NAA jest niewielka. Dostępne dane wskazują na lokalną redukcję poziomu metabolitu u osób cierpiących na AD. W tylnej części zakrętu obręczy mózgów pacjentów odnotowano 15-20%

spadek parametru NAA/Cr (bądź stężenia NAA) (Kantarci and Jack, 2003; Moats et al., 1994;

Moffett et al., 2007). Badania prowadzone u pacjentów z łagodną postacią AD ujawniły znamiennie obniżony poziom metabolitu w hipokampie mózgu (Jessen et al., 2011; Watanabe et al., 2012). W związku z tym, celowym jest ocena wpływu czynników toksycznych towarzyszących rozwojowi AD na produkcję NAA.

Produkcja NAA, w obecności Asp-NAT, odbywa się wyłącznie w neuronach mózgu.

W efekcie oznaczona aktywność tudzież zawartość Asp-NAT w komórkach SN56 była odpowiednio ponad 2 i 3 krotnie wyższa niżeli w homogenacie całego mózgu (Ryc. 16 A-B, Tabela 3) (Di Pietro et al., 2014; Madhavarao et al., 2003). Równolegle,

poziom NAA oznaczony w komórkach linii SN56 był zbliżony do poziomu oznaczonego w hipokampie mózgu (Tabela 7, Ryc. 17 B-C). Wskazuje to na konieczność prowadzenia

pomiary z zakresu metabolizmu NAA w regionach mózgu bogatych w neurony, jak również ponownie potwierdza celowość pracę z zastosowaniem komórek linii SN56 jak modelu

neuronów cholinergicznych. Wyznaczona na podstawie krzywej Hanes-Wollf’a wartość K_m dla acetylo-CoA jako substratu reakcji syntezy NAA wyniosła około 170 µM (Lu et al.,

2004). Niestety dostępność acetylo-CoA w różnicowanych komórkach SN56 tudzież zakończeniach nerwowych mieści się w zakresie 3-8 µM (Ryc. 14) (Bielarczyk et al.,

2015; Szutowicz et al., 2006; Szutowicz et al., 2004). W związku z tym, niższy poziom NAA

w SN56 KR niżeli SN56 KN może odzwierciedlać stan niższej dostępności acetylo-CoA w komórkach różnicowanych w wyniku czego dochodzi do kompetycji 3 ścieżek utylizacji

acetylo-CoA, tj. produkcji energii, syntezy NAA oraz syntezy acetylocholiny. Nawiązując do charakterystyki neuronów cholinergicznych należy przypuszczać, że w stosunku do pozostałych typów neuronów, są mniej efektywnym producentem NAA (patrz → podrozdziały 2.3, 2.5, 2.5.2) (Ryc. 17 B-C).

Miejsce produkcji wewnątrz neuronów pozostaje wciąż nie do końca nieustalone.

Obecność Asp-NAT potwierdzono w przedziale mitochondrialnym i bądź mikrosomalnym komórki (Ariyannur et al., 2010; Arun et al., 2009; Li et al., 2013; Lu et al., 2004;

Madhavarao et al., 2003; Wiame et al., 2010). Niestety, w kwestii fizjologicznej aktywności Asp-NAT w przedziałach komórkowych skutkującej produkcją NAA, cytowane prace wzajemnie się wykluczają. W niniejszej pracy, uzyskane wyniki wskazują na mitochondrialną produkcję NAA. Pierwszym, pośrednim dowodem jest wysoka korelacja pomiędzy

z jednoczesnym brakiem korelacji pomiędzy wspomnianym poziomem NAA a cytoplazmatycznym poziomem acetylo-CoA (Ryc. 52 A-B). W trakcie badań wykazano

również, że w komórkach SN56 niemalże 90% aktywności Asp-NAT przypadała na przedział

mitochondrialny. Uzyskane wyniki pokrywały się z oznaczonym poziomem NAA, który w tożsamej frakcji wahał się w zakresie 80-90% całkowitej puli metabolitu. Pozostałe

około 10% przypadało na frakcję cytoplazmatyczną zawierającą w swoim składzie m.in. mikrosomy. Niestety, na obecnym etapie badań nie można jednoznacznie stwierdzić,

czy uzyskany wynik 10% związany jest z ograniczoną czystością badanego materiału,

Ryc. 53. Korelacja pomiędzy całkowity poziomem N-acetyloasparaginianu a mitochondrialnym (A) tudzież cytoplazmatycznym (B) poziomem acetylo-CoA w komórkach SN56 z różną ekspresją fenotypu cholinergicznego. Poziomy metabolitów oznaczono w komórkach SN56 chronicznie eksponowanych na Zn (0-0.15 mmol/L). Wartość stężenia Zn (µmol//L) podano przy odpowiednim punkcie eksperymentalnym. Korelacje wyliczono na podstawie danych prezentowanych na Ryc. 14 i Ryc. 17 B.

Badania prowadzone na mysim modelu rodzinnej postaci choroby Alzheimera (5xFAD) wskazywały na wysoką korelację pomiędzy zmianami stanu energetycznego

neuronów mózgu a poziomem NAA (Zaroff et al., 2015). Podobną relację prezentowano w publikacjach badających wpływ mechanicznego uszkodzenia mózgu na stan energetyczny

neuronów (Di Pietro et al., 2014). W związku z udowodnionym inhibicyjnym wpływem Zn na produkcję energii (Ronowska et al., 2010; Ronowska et al., 2007) przeanalizowano

uzyskane w niniejszej pracy wyniki badań. W efekcie oprócz potwierdzenia wspomnianej zależności, uzyskano silną dodatnią korelację pomiędzy poziomem NAA a acetylo-CoA.

Zależność tą zaobserwowano również w badaniach z wykorzystaniem kofaktora PDHC (tj. lipoamidu), który zwiększając wydajność enzymu zwiększa dostępność acetylo-CoA w komórkach SN56. Zwiększenie poziomu acetylo-CoA skutkuje znamiennym

podwyższeniem poziomu NAA (Ryc. 13), co potwierdzają badania ostrego wpływu Zn. Zastosowanie antagonistów białek regulujących homeostazę Ca spowodowało obniżenie

akumulacji Zn z równoczesnym zwiększeniem poziomu całkowitego acetylo-CoA (Ryc. 33 A-B, 39 A-B). W efekcie, poziom NAA utrzymywał się w zakresach kontrolnych

(Ryc. 47 A-B). Ostatnim badanym aspektem był wpływ procesu różnicowania na poziom acetylo-CoA i NAA. Z uprzednich badań ZML wynika, że najwyższą efektywność

różnicowania uzyskano w trakcie hodowli komórek SN56 w obecności kwasu trans-retinowego oraz dibutyrylowej pochodnej cAMP (Bielarczyk et al., 2003a; Szutowicz

et al., 2000). Powtórzenie schematu badań ponownie potwierdziło, że spadek dostępności acetylo-CoA, będący wynikiem zwiększenia produkcji acetylocholiny, skutkuje obniżeniem poziomu NAA (Ryc. 7 A-B, 8 A-B). W dotychczas opublikowanych rezultatach badawczych prezentowany jest wpływ RA (Li et al., 2013) bądź db-cAMP (Arun et al., 2006) na poziom NAA oznaczony w komórkach SH-SY5Y. W przypadku RA, autorzy nie prezentowali poziomu NAA w komórkach nieróżnicowanych, w komórkach po 24-ro godzinnej hodowli

w obecność 1mmol/L db-cAMP poziom NAA znamiennie się zwiększył. Niestety, w obu przypadkach nie badano markerów ekspresji fenotypu. Z drugiej strony wiadomo, że obecność wymienionych faktorów w hodowli komórek SH-SY5Y zwiększa ekspresję

fenotypu dopaminergicznego (Edsjö et al., 2003; Ferreira et al., 2013; Presgraves et al., 2004).

Oznacza to, że ścieżka NAA w każdym z typów neuronów ma inny priorytet produkcyjny, prawdopodobnie zależny od funkcji neuronów. W komórkach SN56, nie zaobserwowano

istotnych zmian w aktywności Asp-NAT, co tym silniej wskazuje na acetylo-CoA jako czynnik warunkujący szybkość syntezy NAA w neuronach cholinergicznych (Ryc. 12 C-D, 16 A-B, 17 B-C).

Pozwala to na uszczegółowienie stawianej w cytowanych publikacjach hipotezy, że poziom NAA może odzwierciedlać zarówno stan energetyczny neuronów mózgu, jak i samą dostępność acetylo-CoA w przedziale mitochondrialnym neuronów mózgu (Ryc. 14 A-B, 37, 52 A).