Reakcje ogólne związków peptydowych

W celu poznania przebiegu najwaŜniejszych reakcji charakterystycznych dla połączeń oligopeptydowych niŜej zaproponowane doświadczenia moŜna z powodzeniem wykonywać dla roztworu białka kurzego lub Ŝelatyny.

• Przygotowanie roztworu białka kurzego

Dokładnie oddzielić białko od Ŝółtka z jednego jajka kurzego, po czym dodać 100 ml 2% roztworu wodnego NaCl. Tak przygotowany roztwór przeznaczyć do badań na obecność ugrupowań strukturalnych, występujących w peptydach/białkach.

• Wykrywanie układów wiązań peptydowych (reakcja „biuretowa”) Reakcję tę dają wszystkie połączenia,

które zawierają w cząsteczce co najmniej dwie grupy –CO-NH- połączone ze sobą bezpośrednio (jak w diamidzie kwasu szczawiowego), poprzez jeden atom azotu (jak w diamidzie mocznika – biurecie, NH2CONHCONH2) czy jeden atom węgla (jak w peptydach czy diamidzie kwasu malonowego). Próba jest takŜe pozytywna dla połączeń podobnych do wyŜej wymienionych,

np. dla związków zawierających fragmenty strukturalne typu –CH(NH2)-CH(OH)-. Reakcja daje negatywny wynik w odniesieniu do pojedynczych aminokwasów (z wyjątkiem histydyny), ich monoamidów i dipeptydów. W przypadku związków o budowie peptydowej reakcja biuretowa polega na tworzeniu się w środowisku silnie zasadowym barwnego związku kompleksowego pomiędzy kationem miedzi(II) a heteroatomami reszt aminokwasowych oddalonych od siebie o co najmniej jedną resztę w łańcuchu głównym peptydu lub białka. Ze wzrostem liczby wiązań peptydowych w cząsteczce rośnie intensywność fioletowej barwy powstającego kompleksu.

Rys. 93. Fragment strukturalny kompleksu powstającego z oligopeptydu lub białka poddanego reakcji biuretowej Wykonanie próby:

Do ok. 10-20 mg dokładnie sproszkowanej próbki lub 2 ml jej wodnego roztworu dodaje się 2 ml 10% roztworu NaOH, a następnie kroplami 1% wodnego roztworu CuSO₄, wstrząsając mieszaniną reagującą po dodaniu kaŜdej kropli. W przypadku obecności w strukturze badanego związku sąsiadujących ze sobą co najmniej dwóch wiązań peptydowych obserwuje się pojawienie zabarwienia początkowo róŜowego, przechodzącego poprzez fioletowe do niebieskofioletowego, a wytrącony wodorotlenek miedzi(II) ulega stopniowemu rozpuszczaniu.

• Wykrywanie wolnych grup aminowych (reakcja z ninhydryną) Wykonanie próby:

Do ok. 10-20 mg dokładnie sproszkowanej próbki rozpuszczonej w 1 ml wody dodać 0,5 ml odczynnika ninhydrynowego (przygotowanie – patrz rozdz. IX.1.) i ogrzać do wrzenia. Obserwuje się powstawanie róŜowego

N H N O R¹ O R2 O N N H O R¹ O R² O Cu²⁺ ... ...

Rys. 92. Wyniki reakcji biuretowej a) dla roztworu białka (pozytywna); b) dla glicyny (negatywna)

lub fioletowego zabarwienia. Barwa zaleŜna jest od rodzaju aminokwasu, białka lub peptydu. Przebieg reakcji – patrz dalej Rys. 98. Uwaga: badany roztwór powinien mieć

odczyn lekko zasadowy lub obojętny.

Reakcję tę moŜna takŜe wykonać metodą kroplową na bibule.

Wykonanie próby:

Dwie krople odczynnika ninhydrynowego umieszcza się na bibule, suszy w suszarce w temp. 100-105 ^oC, a następnie na wysuszoną plamę nakrapla się (1-2 krople) roztworu badanej substancji (o odczynie zbliŜonym do obojętnego). Po ponownym wysuszeniu bibuły (5-10 min. w temperaturze suszarki) w obecności aminokwasu lub peptydu zawierającego pierwszorzędową grupę aminową obserwuje się powstawanie niebieskiego, róŜowego lub fioletowego zabarwienia.

• Wykrywanie pierścieni aromatycznych w aminokwasach (reakcja ksantoproteinowa) Pod wpływem działania kwasu azotowego(V) układy aromatyczne obecne w łańcuchach bocznych aminokwasów (fenyloalanina, tyrozyna, tryptofan) ulegają nitrowaniu, a utworzone nitropochodne o barwie Ŝółtej poddane działaniu zasady przekształcają się w formę „aci” o barwie pomarańczowej. Nitrowanie fenyloalaniny wymaga dodatku stęŜ. kwasu siarkowego. Histydyna w wyniku tej reakcji daje produkt jasnoŜółtawy.

Wykonanie próby:

Do ok. 10-20 mg badanej próbki, rozpuszczonej w 1 ml wody dodać 0,5 ml stęŜ. kwasu azotowego(V) i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez ok. 5 minut. W przypadku obecności tyrozyny lub tryptofanu obserwuje się powstawanie Ŝółtego zabarwienia. Po ochłodzeniu dodać ostroŜnie 0,5 ml 20% roztworu NaOH. Barwa pogłębia się, przechodząc w pomarańczową. W przypadku otrzymania negatywnego wyniku próby, naleŜy powtórzyć ją z dodatkiem 0,5 ml stęŜ. kwasu siarkowego(VI), aby potwierdzić lub wykluczyć obecność fenyloalaniny.

• Wykrywanie grup tiolowych

Ogrzewanie związków zawierających ugrupowania tiolowe (np. w resztach cysteiny) lub mostki disiarczkowe (np. w resztach cystyny) w stęŜonych roztworach NaOH powoduje ich rozkład z wydzieleniem siarkowodoru, który w reakcji z octanem ołowiu(II) daje czarny osad siarczku ołowiu(II). Próba jest negatywna dla metioniny.

Rys. 94. Pozytywny wynik reakcji

α-aminokwasu z ninhydryną

Rys. 95. Reakcja ksantoproteinowa dla wybranych aminokwasów oraz dla białka kurzego

Wykonanie próby:

Do ok. 10-20 mg dokładnie sproszkowanej próbki rozpuszczonej w 1 ml wody dodać kroplami 0,3 ml 2% roztworu octanu ołowiu(II) oraz 2 ml 20% roztworu NaOH. Całość ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez ok.5 minut. Obserwuje się ciemnienie roztworu. Po oziębieniu i zakwaszeniu mieszaniny stęŜ. kwasem solnym wydziela się zapach siarkowodoru.

• Reakcja hydrolizy

Związki peptydowe poddane działaniu kwasu solnego w podwyŜszonych temperaturach ulegają hydrolizie, teoretycznie prowadzącej do składowych aminokwasów. Niestety, podczas hydrolizy przeprowadzanej zwykle w dość drastycznych warunkach (reakcja w środowisku 6N kwasu solnego w 110 ^oC przez 24 godziny lub w temperaturze ok. 165 ^oC przez 30-60 minut) niektóre reszty aminokwasowe mogą ulegać rozkładowi lub pewnym modyfikacjom na skutek np. utleniania czy reakcji rodnikowych. Do

aminokwasów posiadających najbardziej labilne łańcuchy boczne naleŜą: tryptofan, tyrozyna, cysteina/cystyna, seryna, treonina oraz aminocukry i połączenia fosforylowane. Aby zapobiec tego typu niepoŜądanym reakcjom hydrolizę prowadzi się często w obecności niewielkiej ilości rozmaitych dodatków - „antyutleniaczy” czy tzw. „zmiataczy” wolnych rodników (ang. scavengers), jak np. fenol i jego pochodne, kwas tioglikolowy, merkaptany. Przed rozpoczęciem reakcji mieszaninę dodatkowo przepłukuje się strumieniem gazowego azotu lub argonu celem usunięcia z niej powietrza.

Wykonanie próby:

Ok. 10 mg peptydu umieścić w naczyniu do hydrolizy

(w kształcie grubościennej Ŝaroodpornej probówki o wym. 15 x 150 mm, zaopatrzonej w boczną rurkę i teflonowy zawór, Rys. 96.), dodać 1 ml 6N kwasu solnego z 2-5% dodatkiem fenolu, 2-merkaptoetanolu lub kwasu tioglikolowego. Mieszaninę przepłukać strumieniem gazowego argonu lub azotu przez kilka minut, po czym naczynie szczelnie zamknąć i umieścić w metalowym bloku grzewczym, ustawionym na 165 ^oC. Reakcję prowadzić 1 godzinę. W przypadku prowadzenia hydrolizy przy temp. 110 ^oC czas reakcji naleŜy przedłuŜyć do ok. 22 godzin. Następnie, po ochłodzeniu mieszaniny reagującej do temp. pokojowej powoli otworzyć naczynie (OSTROśNIE!), otrzymany hydrolizat w razie potrzeby rozcieńczyć i przeznaczyć do badań na obecność aminokwasów.

• Analiza TLC hydrolizatów peptydowych Wykonanie:

Próbkę hydrolizatu peptydowego nanieść punktowo na dwie osobne płytki do TLC, z których jedna pokryta jest celulozą (np. DC Alufolien Cellulose 60 F 254; Merck, grubość warstwy: 0,1 mm), zaś druga Ŝelem krzemionkowym (np. DC Alufolien Kieselgel 60 F 254; Merck, grubość warstwy: 0,2 mm), rozwinąć chromatogram w układzie rozpuszczalników: chloroform – metanol – 25% NH₃ (8:8:3; v/v/v), po czym wywołać

Rys. 96. Naczynie do hydrolizy przeprowadzanej na skalę mikro

plamy w świetle UV (λ = 254 nm), a następnie odczynnikiem ninhydrynowym lub izatynowym. W przypadku uŜycia odczynnika izatynowego, który daje z aminokwasami produkty o bardziej zróŜnicowanej gamie barw, naleŜy po spryskaniu chromatogramów ogrzewać je kilkanaście minut w temp. 80-85 ^oC, względnie pozostawić w temp. pokojowej przez 20 godzin.

Identyfikację poszczególnych aminokwasów ułatwi chromatografia hydrolizatu wobec wzorców aminokwasowych, o ile będą dostępne.