1.3. Metaloproteinazy macierzy pozakomórkowej
1.3.2. Regulacja ekspresji MMPs
Homeostaza jest podstawą sprawnego i prawidłowego funkcjonowania organizmu. Jednym z licznych elementów warunkujących homeostazę jest utrzymanie właści-wego stanu macierzy pozakomórkowej [149]. Metaloproteinazy są odpowiedzialne za rozkład ECM , zatem ich synteza musi być regulowana na wielu poziomach, aby precyzja regulacji umożliwiła właściwe proporcje między syntezą a proteolizą skład-ników macierzy pozakomórkowej [172].
Mechanizmy regulacji ekspresji genów MMPs nie zostały jeszcze całkowicie po-znane. Istnieje wiele związków wykazujących pobudzający bądź hamujący wpływ na ekspresję genów MMPs [156,160,173]. Wiadomo jednak, że regulacja ekspresji
MMPs zachodzi zarówno na poziomie transkrypcji, modyfi kacji potranskrypcyjnej
jak i na poziomie modyfi kacji potraslacyjnej, ale także regulowana jest aktywność tych enzymów przez właściwe aktywatory i inhibitory [172]. Uwalnianie metalo-proteinaz w warunkach fi zjologicznych może być regulowane zatem na różne spo-soby [174]. I tak przykładowo regulacja ekspresji genów zachodzi poprzez czynniki wzrostu, cytokiny, estry forbolu oraz onkogeny, które powstają z protoonkogenów
FOS i JUN, a także gen HER2 [174]. Spośród czynników wzrostu największy wpływ
na syntezę i sekrecję MMPs posiada naskórkowy czynnik wzrostu (EGF ), śródbłon-kowy czynnik wzrostu (VEGF ), czynnik martwicy nowotworu α (TNF α), a także interleukina 1 (IL -1) [175]. Wszystkie te endogennie wydzielane związki, jak rów-nież zaistniałe interakcje międzykomórkowe i oddziaływania komórek z macierzą pozakomórkową posiadają funkcję stymulującą wydzielanie MMPs [122]. W przy-padku nowotworów istotną rolę w zwiększeniu poziomu metaloproteinaz odgrywa również obecność czynników kancerogennych, np. takich jak promieniowanie UV . TNF -β, kwas retinowy oraz glikokortykoidy prowadzą natomiast do wyciszenia ekspresji genów MMPs [156,160,173].
Kontrola ekspresji genów na poziomie transkrypcji dotyczy wszystkich MMPs za wyjątkiem MMP-2 [174]. W genie kodującym MMP-2 u człowieka znalezione
zostały w obrębie sekwencji promotora miejsca konserwatywne, charakterystyczne dla genów metabolizmu podstawowego [173].
Zatem w warunkach fi zjologicznych MMP-2 regulowana jest głównie poprzez procesy aktywacji i inhibicji na poziomie gotowego już enzymu. W niewielkim stopniu ekspresja może być modyfi kowana na poziomie potranskrypcyjnej stabili-zacji mRNA przez czynniki wzrostu [160,173].
Ekspresja genów dla MMPs na poziomie transkrypcji może być regulowana przez czynnik AP-1 [176,177]. Czynnik AP-1 to grupa strukturalnie i funkcjonal-nie podobnych do siebie białek z motywem tzw. suwaka leucynowego, wiążących się z nicią DNA poprzez specyfi czną sekwencję (5’-TGAG/CTCA-3’) (178). AP-1 jest dimerem zbudowanym z białek kodowanych przez protoonkogeny FOS i JUN [179,180].
Białka z rodziny JUN wchodzące w skład AP-1 to białko C-JUN , JUNB oraz JUND [181]. Rodzina FOS czynników transkrypcyjnych zawiera białko C-FOS, FOSB, antygen-1 związany z białkiem FOS , antygen-2 związany z białkiem FOS , FOSB, FOSB2 oraz DFOSB2. Dimery białek tworzących czynnik AP-1 łączą się z nicią DNA z różnym powinowactwem, co tłumaczy występowanie odmiennych biologicznie efektów [156,173,176,182,183].
Czynniki AP-2 również mogą uczestniczyć w regulacji ekspresji genów MMPs na poziomie transkrypcji, poprzez zwiększenie aktywności regionu promotorowe-go MMP-9 [184]. Nadekspresja AP-2 została stwierdzona w różnych typach no-wotworów, co ma bezpośredni związek ze zwiększoną ekspresją MMP-2 i MMP-9 [185,186,187,188]. W skład rodziny ludzkich czynników transkrypcyjnych AP-2 wchodzi pięć białek: AP-2α, AP-2β, AP-2γ, AP-2δ i AP-2ε. Czynniki AP-2 po-siadają w swojej budowie charakterystyczny motyw helisa-pętla-helisa (HLH) i wykazują zdolność rozpoznawania i wiązania palindromowej sekwencji DNA: 5’-GCCN3GGC-3’ [189].
Ekspresja MMPs może być regulowana również na poziomie modyfi kacji po-transkrypcyjnej mRNA. Transkrypty mRNA dla MMP-1 oraz MMP-3 są stabili-zowane przez estry forbolu, oraz EGF , natomiast MMP-13 przez PDGF i glikokor-tykoidy. Destabilizację transkryptu mRNA kodującego MMP-13 powoduje TGF -β [160,190]. Regulacja ekspresji mRNA kodującego MMP-1 na poziomie modyfi kacji potranskrypcyjnej zachodzi poprzez sekwencje bogate w AU w regionie 3’ nieule-gającym translacji. Prawdopodobnie analogiczne sekwencje biorą udział w regulacji ekspresji mRNA dla pozostałych MMPs [190].
MMPs z wyjątkiem MMP-11 , -23, -28, oraz wszystkie MT-MMPs są syntetyzo-wane i wydzielane na zewnątrz komórki w formie proenzymu. Procesem decydu-jącym o poziomie aktywnych form MMPs w komórce jest aktywacja pro-MMPs [160,161,173,191]. Grupa sulfh ydrylowa (-SH) cysteiny w domenie propeptydu
decyduje o braku aktywności proteolitycznej MMPs . Grupa –SH – Cys wiąże jon Zn2+ domeny katalitycznej, utrzymując enzym w formie proenzymu (pro-MMPs ) [163,173]. Aktywacja MMPs wymaga odsłonięcia katalitycznego Zn2+ przez cięcie proteolityczne. W następstwie tego cięcia dochodzi do odłączenia się prodomeny, co powoduje skrócenie łańcucha polipeptydowego o około 80 reszt aminokwasowych. Masa cząsteczkowa MMPs zmniejsza się o około 10 kDa. Cząsteczka H2O wstawia-na jest w miejsce grupy –SH dzięki czemu możliwa jest hydroliza wiązania pepty-dowego substratów dla MMPs [156]. W takiej postaci metaloproteinazy są zdolne do pełnienia swoich regulacyjnych i strukturalnych funkcji w organizmie. W wa-runkach fi zjologicznych aktywacja pro-MMPs zachodzi poprzez działanie proteaz serynowych, furyny, proteaz furynopodobnych, a także dzięki działaniu aktywnych form MMPs , np. pro-MMP-9 przez MMP-1 ,-2,-3,-7,-10, i -26 [161,173,192].
Możliwa jest też wewnątrzkomórkowa aktywacja pro-MMPs . Pro-MMP-11 , -14,-15,-16,-17,-23,-24,-25 i -28 aktywowane są w aparacie Golgiego i wydzielane do ECM w postaci aktywnych enzymów [160,161,172,193]. Enzymy aktywowane wewnątrzkomórkowo posiadają w domenie propeptydu sekwencję aminokwaso-wą rozpoznawaną przez furynę [172].
Aktywność MMPs jest również regulowana przez inhibicję [194]. Najczęściej wymienianymi inhibitorami MMPs są tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMPs ), α2-makroglobulina , inhibitor zewnątrzpochodnej drogi krzepnięcia krwi (TFPI2 ) oraz wzmacniacz C-końcowej proteinazy prokolagenu [161,195,196]. Poznano dotychczas strukturę czterech białek należących do rodziny TIMPs: TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 oraz TIMP-4 [160,161,197,198]. Każde z nich posia-da w swojej strukturze dwie domeny. Domena N-terminalna jest identyczna we wszystkich wymienionych tu rodzajach inhibitorów. Dzięki niej TIMP wiąże się z centrum aktywnym metaloproteinaz i blokuje ich aktywność [194]. Druga do-mena obejmująca C-końcową część łańcucha białkowego wpływa na połączenie się inhibitora z fragmentem podobnym do hemopeksyny metaloproteinaz . Wyją-tek stanowi TIMP-2, który może blokować MMP-2 i MMP-3 poprzez połączenie się z nimi właśnie tą domeną [23,199].
W tkankach najczęściej występuje TIMP-1 i TIMP-2. TIMP-1 jest rozpuszczal-ną glikoproteirozpuszczal-ną produkowarozpuszczal-ną przez większość komórek organizmu; TIMP-2 to białko powstające wyłącznie przy udziale fi broblastów i komórek endotelialnych [122]. Oprócz działania hamującego aktywność metaloproteinaz, oba te białka mają działanie angiogenne, poprzez bezpośrednie blokowanie migracji i prolife-racji komórek śródbłonka, a ponadto są promotorami wzrostu i hamują proces apoptozy [200, 201].
Niespecyfi cznymi, endogennymi inhibitorami metaloproteinaz są także
ste-roidowe, a także cytokiny przeciwzapalne–interferon gamma (IFN-γ) i interleu-kina 4 (IL -4) [171,202,203]. Syntetyzowana w wątrobie α2-makroglobulina jest proteiną o masie cząsteczkowej wynoszącej 750 kDa. Duży rozmiar cząsteczki uniemożliwia jej pełnienie optymalnego działania, gdyż ogranicza penetrację tego białka do przestrzeni pozanaczyniowej i w konsekwencji zmniejsza hamowanie metaloproteinaz poza wnętrzem naczyń [171]. Mechanizm działania hamującego α2-makroglobuliny jest zupełnie inny niż ten, który posiadają tkankowe inhibi-tory metaloproteinaz , α2-makroglobulina pod wpływem połączenia się z MMP zmienia swoją typową strukturę i zamyka MMP w swojej cząsteczce. Proces ten uniemożliwia MMP dalsze pełnienie funkcji enzymatycznych [23,202].
Schemat działania inhibitorów metaloproteinaz należących do grupy cyklin prozapalnych także różni się od schematów przedstawionych powyżej. Badania wykazały, że proces ten polega na zmniejszaniu produkcji czynników biorących udział w wytwarzaniu MMPs , takich jak takich jak prostaglandyna E2 (PGE2) i cykliczny adenozynomonofosforan (cAMP) [202].
Funkcja regulacyjna tkankowych inhibitorów metaloproteinaz sprowadza się do hamowania degradacji macierzy pozakomórkowej, zarówno poprzez rozkład, jak i dezaktywację MMPs [194].
1.3.3. Specyfika substratowa MMPs
W oparciu o swoistość substratową oraz różnice w strukturze czwartorzędowej łańcucha białkowego, MMPs zostały podzielone na 5 grup. Pierwszą z nich sta-nowią kolagenazy, do których zalicza się MMP-1 oraz MMP-8 . Enzymy te odpo-wiadają za degradację kolagenu typu I , II i III . Kolejną grupę tworzą żelatynazy (MMP-2 i MMP-9 ), które swoiście rozszczepiają kolagen typu IV w błonach pod-stawnych, kolagen typu V i VII , a także cząsteczki żelatyny. Następne z nich czyli stromielizyny (MMP3, 10, 11, 18) mają zdolność rozkładania składników białek przestrzeni pozakomórkowej: fi bronektyny, lamininy , proteoglikanów oraz tak samo jak żelatynazy, kolagenu typu IV w błonach podstawnych. Metaloproteina-zy błonowe, do których zalicza się MMP-14 /MT1-MMP, MMP-15 /MT-2-MMP, MMP-16 /MT3-MMP, /MT4-MMP aktywują niektóre pro-MMPs , w tym MT1-MMP i MT2-MT1-MMP.
Ostatnia grupa obejmuje nie wymienione wcześniej matrylizyny, czyli MMP-7 oraz MMP-12 [202,204]. Zestawienie rodzajów metaloproteinaz wraz z podzia-łem na grupy i lokalizacją na chromosomach przedstawia tabela 4.
Tabela 4. Rodzaje MMPs wraz z podziałem na grupy i położeniem poszczególnych genów na autosomach w genomie ludzkim [156,161,190]
Rodzaj
metaloproteinazy Nr EC Nazwa enzymu
Lokalizacja genu na chromosomie Kolagenazy MMP-1 3.4.24.7 kolagenaza śródmiąższowa, kolagenaza 1 11q22.2-22.3 MMP-8 3.4.24.34 kolagenaza neutrofi lów, kolagenaza 2 11q22.2-22.3 MMP-13 3.4.24.B4 kolagenaza 3 11q22.2-22.3 Żelatynazy
MMP-2 3.4.24.B7 żelatynaza A , kolagenaza typ IV 16q13- q21 MMP-9 3.4.24.35 żelatynaza B , żelatynaza 92 kDa 20q11.2-q13.1
Stromielizyny MMP-3 3.4.24.17 stromielizyna 1, proteoglikanaza 11q23 MMP-10 3.4.24.22 stromielizyna 2 11q22.3-q23 MMP-11 3.4.24.B3 stromielizyna 3 22q11.2 Matrylizyny MMP-7 3.4.24.23 matrylizyna 1, 11q21-q22 MMP-26 3.4.24.B7 matrylizyna 2, endometaza 11p15
Metaloproteinazy błonowe (MT- MMPs ) – MMPs transbłonowe
MMP-14 3.4.24.80 MT1-MMP 14q11-q12
MMP-15 3.4.24.B5 MT2-MMP 15q13-q21
MMP-16 nie nadano MT3-MMP 8q21
MMP-24 nie nadano MT5-MMP 20q11.2
Metaloproteinazy błonowe (MT- MMPs ) – MMPs związane z glikozylofosfatydyloinozytolem (GPI)
MMP-17 nie nadano MT4-MMP 12q24.3
MMP-25 nie nadano MT6-MMP 16p13.3
Inne MMPs
MMP-12 3.4.24.65 metaloelastaza makrofagów, MME 11q22.2-q22.3 MMP-19 nie nadano metaloproteinaza RASI, MMP-18 12q14
MMP-20 3.4.24.B6 enamelizyna 11q22.3
MMP-21 nie nadano potoczna nazwa nie występuje 10q26.2
MMP-23 nie nadano CA- MMP 1p36.3
MMP-27 nie nadano potoczna nazwa nie występuje 11q24
MMP-28 nie nadano epilizyna 17q21.1
* objaśnienia wszystkich użytych w tabeli skrótów znajdują się w wykazie skrótów.
Podział enzymów opiera się na budowie strukturalnej oraz specyfi ce substrato-wej poszczególnych białek. Wykaz substratów dla poszczególnych MMPs przedsta-wiono w tabeli 5.
Tabela 5. Substraty dla poszczególnych rodzajów MMPs [156,161,190]
MMP Substraty
Kolagenazy
MMP-1
kolageny typu I , II , III , VII , VIII, X , żelatyna , kazeina , witronektyna , fi bryna , fi brynogen , tenascyna , agrekan , brewikan , laminina , entaktyna , fi bronektyna , L-selektyna, IGFBP, IL -1β, pro-MMP-2 , pro MMP-9 , pro-TNFα, czynnik C1q,
α1-antychymotrypsyna, α2-makroglobulina , inhibitor α1-proteinazy
MMP-8 kolageny typu I , II , III , V , VII , VIII, XI , żelatyna , fi bronektyna , fi brynogen , agrekan , brewikan , inhibitor α1-proteinazy, ADAMTS
MMP-13
kolageny typu I , II , III , IV , VI , IX , X , XIV , fragment NC1 kolagenu XVIII, żelatyna , kazeina , fi bronektyna , fi brynogen , fi brylina, agrekan , brewikan , perlekan , osteonektyna, tenascyna , α2-makroglobulina , pro-MMP-9 , czynni k C1q, czynnik XII
Żelatynazy
MMP-2
kolageny typu I , IV , V , VII , X , XI , XIV , żelatyna , elastyna , fi bronektyna , elastyna, entaktyna , fi brylina, agrekan , brewikan , dekoryna, fi bulina, IGFBP, laminina -1, laminina-5, białko podstawowe mieliny, osteonektyna, tenascyna , witronektyna , α1-antychymotrypsyna, inhibitor α1-proteinazy, ADAMTS-1, czynnik C1q, endotelina, FGFR1, fi bryna , fi brynogen , galektyna-3, IL -1β, pro-MMP1, pro-MMP-9 ,
pro-MMP-13 , plazminogen, substancja P, latentna forma TGFβ , pro-TNFα
MMP-9
kolageny typu IV , V , VII , X , XI , XIV , fragment NC1 kolagenu XVIII, żelatyna , kazeina , agrekan , dekoryna, elastyna , fi bryna , fi brynogen , fi brylina, IGFBP, laminina , białko
podstawowe mieliny, osteonektyna, witronektyna , α2-makroglobulina , inhibitor α1-proteinazy, czynnik C1q, endotelina, galektyna-3, IL -1β, IL2Rα, pro-MMP-2 ,
plazminogen, latentna forma TGFβ , pro-TNFα
Stromielizyny
MMP-3
kolageny typu III , IV , V , VII , IX , X , XI , fragment NC1 kolagenu XVIII, żelatyna , kazeina , agrekan , brewikan , witronektyna , fi bryna , fi brynogen , dekoryna, elastyna ,
entaktyna , fi brylina, fi bronektyna , IGFBP, laminina , białko podstawowe mieliny, osteonektyna, osteopontyna, perlekan , tenascyna , plazminogen, kininogen T, α1-antychymotrypsyna, α2-makroglobulina , inhibitor α1-proteinazy, czynnik C1q,
E-kadheryna, IL -1β, L-selektyna, kompleks MMP-2 /TIMP-2, pro-MMP1, pro-MMP-7 , pro-MMP-8 , pro-MMP-9 , pro-MMP-13 , PAI-1, pro-TNFα MMP-10 kolageny typu III , IV , V , żelatyna , kazeina , agrekan , fi bronektyna , fi brynogen ,
brewikan , elastyna , pro-MMP-1 , pro-MMP-7 , pro-MMP-8 , pro-MMP-9 MMP-11 kolagen IV , kazeina , laminina IGFBP, α2-makroglobulina , inhibitor α1-proteinazy
Matrylizyny
MMP-7
kolageny typu IV , X , żelatyna , agrekan , brewikan , dekoryna, elastyna , entaktyna , fi bronektyna , fi bulina, laminina , białko podstawowe mieliny, osteonektyna, osteopontyna, tenascyna , witronektyna , plazminogen, transferyna, inhibitor α1-proteinazy, kazeina , E-kadheryna, ligand FAS, fi brynogen , pro-HB-EGF ,
β4-integryna, pro-MMP-1 , pro-MMP-2 , pro-MMP-9 , kompleks MMP-9/TIMP-1, pro-TNFα
MMP-26 kolagen IV , żelatyna , fi bronektyna , fi brynogen , witronektyna , kazeina , inhibitor α1-proteinazy, pro-MMP-9
Metaloproteinazy błonowe
MMP-14
kolageny typu I , II , III , żelatyna , agrekan , entaktyna , fi brylina, fi bryna , fi brynogen , fi bronektyna , perlekan , witronektyna , inhibitor α1-proteinazy, α2-makroglobulina ,
tenascyna , transglutaminaza tkankowa, czynnik XII, pro-MMP-2 , pro-MMP-13 , pro-TNFα
MMP-15 fi bronektyna , entaktyna , laminina , agrekan , perlekan , entaktyna, pro-MMP-2 , ADAMTS-1, transglutaminaza tkankowa
MMP-16 kolagen typu III , żelatyna , kazeina , fi bronektyna , pro-MMP-2 , tkankowa transglutaminaza
MMP-17 żelatyna , fi bryna , fi brynogen , pro-TNFα, pro-MMP-2 MMP-24 żelatyna , fi bronektyna , pro-MMP-2
MMP-25 kolagen typu IV , żelatyna , fi brynogen , fi bryna , fi bronektyna , pro-MMP-2
Inne MMPs
MMP-12
kolageny typu I , IV , fragment NC1 kolagenu XVIII, żelatyna , agrekan , fi brynogen , fi brylina, fi bronektyna , plazminogen, laminina , elastyna , entaktyna , białko podstawowe
mieliny, witronektyna , α2-makroglobulina , inhibitor α1-proteinazy, czynnik XII, IgG, pro-TNFα
MMP-19 kolageny typu I , IV , żelatyna , kazeina , agrekan , fi bronektyna , laminina , entaktyna , tenascyna ,
MMP-20 fragment NC1 kolagenu XVIII, agrekan , amelogenina,
MMP-21 elastyna , agrekan
MMP-23 elastyna , agrekan
MMP-27 elastyna , agrekan
MMP-28 kazeina , elastyna , agrekan
*objaśnienia wszystkich użytych w tabeli skrótów znajdują się w wykazie skrótów.
Miejscem działania MMPs w cząsteczkach substratów jest wiązanie peptydowe w pozycji poprzedzającej występowanie hydrofobowych aminokwasów, takich jak Leu, Ile, Met, Pro, a także Tyr. Na hydrolizę tak położonych wiązań pozwala przede wszystkim przestrzenna konfi guracji kieszeni S1’ [161,169].
MMPs degradują składniki ECM , a także są odpowiedzialne za selektywną pro-teolizę receptorów komórkowych, czynników adhezyjnych oraz czynników wzro-stu i cytokin oraz utrzymanie prawidłowych funkcji komórek tkanki łącznej [158]. Dzięki temu MMPs regulują strukturę macierzy pozakomórkowej . MMPs jako je-dyne enzymy posiadają zdolność do degradacji kolagenu typu IV , będącego pod-stawowym składnikiem błony podstawnej (BM) naczyń krwionośnych. Głównymi enzymami katalizującymi hydrolizę kolagenu IV są MMP-2 oraz MMP-9 . Możliwe jest to dzięki obecności domeny typu fi bronektyny II w cząsteczkach tych enzymów [150,154,169].
MMPs umożliwiają migrację komórek poprzez degradowanie składników ECM w tym kolagenów, proteoglikanów i laminin [153,205]. Efektem enzymatycznego działania metaloproteinaz jest zaburzenie struktury macierzy pozakomórkowej , dzięki czemu zwiększona zostaje objętość przestrzeni pomiędzy komórkami. Biał-ka macierzy posiadają bardzo istotne funkcje nie tylko w prawidłowej organizacji mikroarchitektury tkanek, ale również biorą udział w przewodzeniu sygnałów ze środowiska zewnętrznego komórek do ich wnętrza, pełnią funkcję ligandów dla in-tegryn oraz komórkowych receptorów adhezyjnych. Dodatkowo wiążą substancje obecne w przestrzeni międzykomórkowej w postaci latentnej, w tym także czynniki wzrostu [156].