Efektywne składanie wirionu to krytyczny etap cyklu replikacyjnego wirusa grypy. Pomimo, iż genom podzielony na segmenty przynosi ewolucyjne korzyści, to niewątpliwie stanowi on problem podczas pakowania wszystkich vRNP do potomnego wirionu. W związku z tym, że każdy segment koduje co najmniej jedno białko istotne w procesie namnażania, do nowopowstałego wirionu musi być włączona jedna kopia
30 każdego vRNP. Wirusy, które posiadają zaburzoną liczbę segmentów nie są zdolne do infekowania kolejnych komórek (30, 59).
Powstały dwa modele pakowania vRNP do potomnych wirionów. Model przypadkowego pakowania zakłada, że wszystkie segmenty posiadają jeden wspólny sygnał włączania vRNP do wirionu (60, 61). Według wyliczeń matematycznych system taki dawałby tylko 0,24% szansy na uzyskanie kompletnego, złożonego ze wszystkich ośmiu segmentów wirionu (62). Wynik taki nie odzwierciedla zdolności potomnych wirionów do infekcji w warunkach in vitro na poziomie 1-10% (63, 64).
Liczne badania sugerują występowanie specyficznego modelu pakowania vRNP do potomnych cząstek wirusa. Pierwsze przesłanki przemawiające za tym modelem pojawiły się, gdy opisano wadliwe interferujące RNA (DI-RNA, ang. Defecting Interfering RNA). Były to skrócone formy vRNA poszczególnych segmentów, które posiadały delecję środkowej części regionu kodującego zachowując rejony terminalne. DI RNA miały zdolność do replikacji i włączania do cząstek potomnych wirusa i współzawodniczyły one z cząsteczkami o pełnej długości. Sugeruje to obecność sygnałów pakowania w terminalnych końcach vRNA (60). Wykazano również, że długość segmentu jest jednym z warunków współzawodnictwa pomiędzy segmentami w procesie pakowania, a jednocześnie zaobserwowano, że krótsze vRNP ulegają wydajniejszej transkrypcji. Wykazano ponadto, że podczas włączania vRNP do nowopowstałego wirionu istniało współzawodnictwo między zmodyfikowanymi segmentami, które posiadały tą samą długość oraz niezmienione rejony terminalne. Oznacza to, że region kodujący spełnia również istotną rolę podczas pakowania (35). Zaproponowano kilka rejonów vRNA, które mogą mieć istotne znaczenie podczas pakowania vRNP do wirionu. Na rysunku 11 zilustrowano potencjalne rejony biorące udział w procesie składania potomnego wirionu zasugerowane przez różne grupy badawcze. Specyficzne sekwencje, które były istotne w procesie składania cząstki wirusa znaleziono zarówno na końcach 5’ i 3’ oraz w środkowej części rejonu kodującego. Delecje i mutacje punktowe wysoce konserwatywnych kodonów w wyznaczonych rejonach wykazały, że sygnał pakownia jest nieciągły, a jego siła maleje wraz z odległością od terminalnych końców. Dodatkowo zauważono, że mutacja prawdopodobnego sygnału pakowania jednego segmentu powoduje zaburzenia wbudowywania innych segmentów (32, 59, 61, 64-73).
31
Rysunek 11. Rejony kodujące i niekodujące vRNA istotne w procesie pakowania wirusa
grypy typu A. Schematyczny model przedstawia vRNA w orientacji 3’→5’. Konserwatywne końce 12 i 13 nukleotydowe odpowiednio z końca 3’ i 5’ zaznaczono na czarno. Strzałka wskazuje miejsce inicjacji translacji, natomiast czarna kropka – kodon stop. Sekwencje istotne w procesie pakowania zaznaczono zgodnie z ich referencjami (30).
32 Kolejnych dowodów przemawiających na korzyć specyficznego modelu pakowania dostarczyły wyniki uzyskane za pomocą mikroskopii elektronowej i tomografii. Udało się uzyskać obraz makromolekuły, która zbudowana jest ze wszystkich 8 segmentów wirusa (Rys. 12). Zakłada się dwa możliwe ułożenia vRNP w molekule: łańcuchowy (ang. daisy chain) lub 7+1 (ang. master segment) (Rys. 13) (29, 60, 74). Sugeruje się również, że 4 segmenty (segmenty kodujące PB1, PA, NP i M) mogą mieć większe znaczenie w stosunku do pozostałych. Poprzez wzajemne oddziaływania mogą one tworzyć zorganizowaną strukturę, do której następnie włączają kolejne vRNP tworząc model 7+1 (75). Dodatkowo, za pomocą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH, ang. fluorescent in situ hybridization) zaobserwowano, że powstawanie makromolekuły zbudowanej ze wszystkich segmentów zachodzi podczas transportu vRNP do apikalnej części komórki, gdzie następnie dochodzi do składania wirionu i jego pączkowania (76-78).
Rysunek 12. Trójwymiarowy model ułożenia ośmiu vRNP w różnych wirionach (a-d).
Schematy przedstawione w prawej kolumnie przedstawiają możliwe ułożenie 8 segmentów w molekule. Numeracja 3-8 oznacza malejącą długość segmentu, przy czym 3 oznaczono trzy pierwsze najdłuższe segmenty. Najdłuższe segmenty łącznie z 4 zaznaczono na różowo (74).
33
Rysunek 13. Model selektywnego pakowania vRNP do wirionu. Sugeruje się, że selektywne
pakowanie związane jest z tworzeniem się kompleksowej molekuły złożonej ze wszystkich 8 segmentów. Formowanie się molekuły inicjowane jest przez specyficzne oddziaływanie sygnałów pakowania pomiędzy segmentami: a) bezpośrednie oddziaływanie RNA-RNA z możliwością zaangażowania struktury drugorzędowej, b) pośrednie z udziałem niezidentyfikowanych jak dotąd białek. Schematy c) i d) przedstawiają możliwe ułożenie i zależności segmentów względem siebie, c) układ łańcuchowy (ang. daisy chain), d) układ „7+1” (ang. master segment) (60).
Pomimo wzrastających dowodów sprzyjających modelowi specyficznego pakowania vRNP do wirionu, mechanizmy tego procesu wciąż pozostają nieznane. Selektywna włączanie segmentów do wirionu wymaga co najmniej siedmiu wewnętrznych oddziaływań pomiędzy vRNP. Interakcje te mogłyby być inicjowane przez białka wiążące RNA. Jednakże do tej pory nie zidentyfikowano ani komórkowych, ani wirusowych białek, które potwierdzałyby takie hipotezy (30). Sugeruje się więc, że istotne znaczenie mają oddziaływania RNA-RNA. Wykazano, że vRNA poszczególnych segmentów w warunkach in vitro może tworzyć heterodimery. Delecje rejonów wyznaczonych jako istotnych podczas składania wirionu oraz zastosowanie oligonukleotydów antysensowych oddziałujących z tym regionem, wykazywały obniżenie powstawania heterodimerów (29, 30, 79). Nie wykazano jednak, zachowanego schematu oddziaływań vRNA-vRNA pomiędzy szczepami, co miałoby istotne znaczenie i wyjaśniałoby możliwość występowania reasortacji segmentów (61, 79). Przypuszcza się, że bardziej niż specyficzne sekwencje, ważną rolę może odgrywać
34 struktura drugorzędowa RNA. Natomiast nukleoproteina, która wiąże vRNA może dodatkowo ułatwiać oddziaływania vRNA-vRNA (30, 59).