Roztwory kwasu octowego

Kwas octowy o cząsteczce CH3COOH jest cieczą o polarnym charakterze cząs-teczek. W rozpuszczalniku AA (z ang. acetic acid) czyli czystym kwasie octowym jego cząsteczki pozostają niezdysocjowane. Natomiast po dodaniu wody pewien procent jego cząsteczek ulega dysocjacji. Kwas octowy jest słabym kwasem or-ganicznym o wartości stałej dysocjacji wynoszącej pKa = 4.76. Opisuje ona stan równowagi dla chemicznej reakcji dysocjacji na jony. W obecności wody stopień jego dysocjacji wzrasta, ponieważ jego cząsteczka jest donorem jonu wodorowego, który po przekazaniu do cząsteczki wody tworzy tzw. jon hydroniowy H3O⁺, [99]. Policzone na podstawie pKa, oraz molowego stężenia roztworu procentowe wartości stopnia dysocjacji cząsteczek kwasu na jony CH3COO⁻ i H⁺ dla roz-puszczalników AA30 i AA15 wynoszą odpowiednio: 0.097 i 0.098. Stopień dyso-cjacji kwasu w obu rozpuszczalnikach jest rzędu jednej dziesiątej procenta. Nato-miast policzona na podstawie tych samych danych wartość pH w obu roztworach kwasu octowego z woda wynosi 1.78 dla AA30 i 1.79 dla AA15. Najniższy ra-portowany wskaźnik pH w wakuoli (lizosomie) pasożyta malarii Plasmodium fal-ciparum wynosi 4.5-4.9 [100], zatem roztwory meso-hematyny z dodatkiem cząs-teczek wody są zdecydowanie bardziej kwaśne. Grupy propylowe pierścienia FeP-PIX również są potencjalnymi donorami jonu wodorowego, ponieważ w obecności wody mogą ulegać dysocjacji. Ich stała dysocjacji ma wartość pK_a = 4.8-5.0. W kwaśnym pH, charakterystycznym dla wakuoli pasożyta, antymalaryczny lek chlo-rochinina jest akceptorem dwóch jonów wodorowych. Stąd wytłumaczenie nagro-madzenia jej cząsteczek w kwaśnym środowisku lizosomu czyli wakuoli organizmu pasożyta [101, 102]. Kwas octowy został wybrany jako rozpuszczalnik po to, by odtworzyć kwasowe właściwości środowiska wakuoli pasożyta. Dodanie pewnej ob-jętości wody powoduje uaktywnienie właściwości dysocjacjacyjnych kwasu i grup propylowych meso-hematyny. Takie a nie inne objętości dodanej wody zostały wybrane ze względu na otrzymane przez grupę S.D. Bohle’a rezultaty spektrosko-powych badan UV, do których nie można się w tym momencie odnieść ze względu na brak publikacji.

5.2. STRUKTURA CZĄSTECZKI SUBSTYTUTU... 73

Analiza widm EXAFS

Transformaty Fouriera eksperymentalnych widm EXAFS dla par widm roztworu meso-hematyny bez i z chlorochininą dla rozpuszczalnika o identycznym składzie umieszczono na rys. 5.17, rys. 5.18, rys. 5.19. Analiza, podobnie jak dla związków proszkowych, została ograniczona do strefy o promieniu 4.35Å wokół absorbu-jącego atomu żelaza i taką przyjęto wartość górnej granicy przestrzeni transformat Fouriera χ(k) przy porównaniu ich kształtu.

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5 6

FT k3 *χ(k)

r [A]

MDAAQ

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5 6

FT k3 *χ(k)

r [A]

MDAA

Rysunek 5.17. Transformata fouriera funkcji χ(k) dla MDAA i MDAAQ.

Różnice pomiędzy kształtem transformat Fouriera dla MDAA i MDAAQ są zauważalne w zakresie 1.5 - 4.2Å. Wskazują one na zmiany uporządkowania struk-turalnego w strefie osiowego atomu tlenu i czterech atomów azotu z pierścieni pirylowych protoporfiryny, oraz ubytek, bądź znaczne nieuporządkowanie atomów w strefach oddalonych od absorbera o około 2.8Å i 3.3 - 3.5Å po dodaniu chloro-chininy.

W zakresie odpowiadającym pierwszej strefie, szczególnie dla położenia osio-wego atomu tlenu najbliższego do żelazoosio-wego absorbera ulega zmianie kształt transformaty Fouriera widma dla roztworu MDAAQ30 w stosunku do transfor-maty widma MDAA30. Na podstawie różnicy można wyciągnąć wniosek o zmia-nie odległości żelazo - tlen osiowy po oddziaływaniu pomiędzy cząsteczką meso-hematyny a cząsteczką antymalarycznego leku. Widoczne są również różnice w zakresie 2.8Å 3.5 - 4.3Å dla obu transformat.

Różnice kształtu transformat Fouriera funkcji χ(k) dla pary roztworów MDAA15 i MDAAQ15 są widoczne przede wszystkim w zakresie 1.4 - 3.2Å i wskazują na zmiany uporządkowania strukturalnego w strefie osiowego atomu tlenu i czte-rech atomów azotu pierścienia ferriprotoporfirynowego. Przedstawiono również zestawienie transformat Fouriera wszystkich roztworów meso-hematyny bez do-datku chlorochininy, oraz wszystkich roztworów w obecności antymalarycznego lekarstwa, rys. 5.20. Wyraźne różnice już dla pierwszej strefy osiowego atomu tlenu i czterech pierścieniowych atomów azotu w obu grupach świadczą o znacznym wpływie właściwości i składu rozpuszczalnika, w tym wypadku dodanej objętości

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5 6

FT k3 *χ(k)

r [A]

MDAAQ30

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5 6

FT k3 *χ(k)

r [A]

MDAA30

Rysunek 5.18. Transformata fouriera funkcji χ(k) dla MDAA30 i MDAAQ30.

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5 6

FT k3 *χ(k)

r [A]

MDAAQ15

0 10 20 30 40 50

1 2 3 4 5 6

FT k3 *χ(k)

r [A]

MDAA15

Rysunek 5.19. Transformata fouriera funkcji χ(k) dla MDAA15 i MDAAQ15.

wody, na rozkład i uporządkowanie atomów wokół absorbującego atomu żelaza w rozpuszczonej meso-hematynie.

Położono zatem nacisk na analizę i porównywanie parametrów dopasowania EXAFS w następujących parach widm: MDAA i MDAAQ, MDAA30 i MDAAQ30, oraz MDAA15 i MDAAQ15, czyli absorpcyjnych widm na krawędzi K żelaza dla cząsteczek meso-hematyny bez i w obecności chlorochininy w tym samym roz-puszczalniku.

Kolejne zestawienie funkcji χ(k) i transformat Fouriera zostało przedstawione na rys. 5.21 i dotyczy funkcji EXAFS przykładowego widma roztworu meso-hematyny w kwasie octowym MDAA15 i funkcji EXAFS proszkowej meso-meso-hematyny.

Zakres transformowanej funkcji χ(k) dla związku proszkowego został ograniczony do 13Å⁻¹i jest to zakres z którego funkcja χ(k) była transformowana do przestrzeni odległości dla każdego roztworu kwasu octowego.

5.2. STRUKTURA CZĄSTECZKI SUBSTYTUTU... 75

Rysunek 5.20. Zestawienie transformat Fouriera funkcji χ(k) dla meso-hematyny w roztworach bez chlorochininy (po lewej) i meso-hematyny w roztworach z chlorochininą (po prawej).

Rysunek 5.21. Przykładowa funkcja χ(k) dla roztworów - MDAA15 oraz jej transfor-mata Fouriera w zestawieniu z funkcja χ(k) oraz jej transfortransfor-mata dla meso-hematyny w postaci proszku. Zakres funkcji χ(k) tej ostatniej został ograniczony do 13Å⁻¹.

Różnice w funkcji χ(k) obu związków są widoczne przede wszystkim w za-kresie 4-5Å⁻¹ oraz 5.2-6Å⁻¹. Struktura w zakresie od 7 do 9Å⁻¹ jest wyraźnie przesunięta dla roztworu w kierunku wyższych wartości wektora falowego. Nato-miast w transformacie Fouriera ulega zawężeniu pik w zakresie odległości osiowego tlenu i czterech atomów azotu, co można interpretować jako ujednolicenie odleg-łości atomów azotu od żelaza przy jednoczesnym ich skróceniu. Znaczna różnica zostaje odnotowana w zakresie 2.9 - 3.5Å, gdzie intensywność piku w maksimum ok. 3.1Å dla roztworu bardziej odpowiada intensywności piku w tym położeniu dla hematyny niż meso-hematyny. W każdej z transformat widm roztworów pojawia się dodatkowa struktura w położeniu 2.8Å, której nie ma w kształcie transformaty meso-hematyny proszkowej.

Pierwszym krokiem w analizie widm EXAFS powyżej wyszczególnionych rozt-worów było dopasowanie ich według modelu jednostki strukturalnej dla cząsteczki złożonej z dwóch pierścieni protoporfiryny IX, dokładnie takiej, jaka wykorzystano uprzednio przy analizie meso-hematyny w postaci mikrokrystalicznego proszku. Z założenia przyjęto, że pod wpływem roztworu bez dodatku chlorochininy dimerowa

struktura cząsteczki meso-hematyny nie ulegała zmianie. Okazało się jednak, że model cząsteczki dimerowej nie jest w tym wypadku poprawny. Liczba koordy-nacyjna osiowego tlenu nie przekroczyła wartości 0.35 przy dopasowaniu widma jakiegokolwiek z roztworów. Co więcej taka wartość liczby koordynacyjnej osiowego tlenu jest bardziej zbliżona do odpowiadającej jej wartości dla związku o cząsteczce zbudowanej z pojedynczego pierścienia FePPIX - hematyny, gdzie została wyzna-czona z wartością 0.5 niż dla meso-hematyny - 1. Strategia dopasowania została zatem zmieniona i każde z widm roztworu dopasowywano według jednostki struk-turalnej związku złożonego z pojedynczego pierścienia FePPIX z dodatkowymi atomami tlenu i węgla, które mogą pochodzić zarówno od cząsteczek roztworu (tlen, węgiel) jak i cząsteczek chlorochininy (węgiel). Jako najbardziej odpowiedni model struktury wejściowej uznano model pierścienia FePPIX otrzymany po koń-cowym dopasowaniu związku mikrokrystalicznej meso-hematyny, ponieważ tak scharakteryzowany materiał był następnie wykorzystany do przygotowania rozt-worów.

Parametry uzyskane w procesie dopasowania funkcji χ(k) dla pary roztworów MDAA i MDAAQ przedstawiono w tab. 5.11 a graficzne porównanie funkcji χ(k) i dopasowanej funkcji EXAFS na rys. 5.22.

MDAA MDAAQ

R 53.29 61.04

FI 0.00208 0.00312

EF -3.0±0.8 -3.0±1.2

X N(X) r(Fe-X) [Å] 2σ²(X) [Ų] N(X) r(Fe-X) [Å] 2σ²(X) [Ų] O1 os. 0.34±0.03 1.77±0.02 0.002±0.001 0.35±0.04 1.78±0.04 0.0022±0.0017

N1234 4 2.05±0.01 0.013±0.002 4 2.05±0.02 0.015±0.004

Cα 8 3.08±0.02 0.011±0.004 8 3.08±0.03 0.012±0.008

Cmeso 4 3.40±0.04 0.012±0.006 4 3.41±0.06 0.014±0.009

Cβ 8 4.31±0.06 0.018±0.008 8 4.31±0.07 0.018±0.011

O1p.p. d. 2.10±0.08 2.85±0.04 0.006±0.003 1.50±0.11 2.85±0.06 0.006±0.004 O²p.p. d. 1.11±0.11 3.34±0.07 0.004±0.002 0.61±0.16 3.29±0.12 0.004±0.002 C¹ p.p. d. 2.22±0.25 3.61±0.11 0.003±0.002 1.88±0.23 3.59±0.08 0.003±0.002 O3p.p. d. 1.56±0.22 3.75±0.09 0.004±0.002 2.86±0.30 3.75±0.11 0.004±0.002

Tabela 5.11. Parametry dopasowania dla atomów i ich grup w strukturze jednostki strukturalnej dla cząsteczki o pojedynczym pierścieniu FePPIX + dodatkowe atomy tlenu i węgla (oznaczone jako p.p. d.) dla roztworów meso-hematyny w kwasie octowym:

MDAA i MDAAQ.

Parametry dopasowania funkcji χ(k) dla pary MDAA i MDAAQ wskazują na brak zmian w granicach wyznaczonych niepewności w pierścieniu FePPIX zarówno pod względem odległości pierwiastków w poszczególnych strefach jak i ich nieupo-rządkowania strukturalnego. Nie zanotowano również różnic w parametrach dla osiowego tlenu. Występuje on średnio w co trzeciej cząsteczce jako ligand żelaza w tej samej odległości i z tym samym nieuporządkowaniem strukturalnym dla roztworu zarówno przed jak i po dodaniu chlorochininy. Z wartości liczby ko-ordynacyjnej tlenu w cząsteczce pierścienia FePPIX dla MDAA wynika, że już sam roztwór wpływa na zerwanie wiązań mostkowych w cząsteczce dimerowej a osiowy atom tlenu podlega ciągłej wymianie z otaczającymi atomami tego samego rodzaju. Atom tlenu może pochodzić z grupy OH i OH2podobnie jak w hematynie, lub tez być częścią cząsteczki kwasu octowego. To samo dotyczy osiowego tlenu dla cząsteczek pierścienia FePPIX roztworu MDAAQ z chlorochininą. Zauważalne

5.2. STRUKTURA CZĄSTECZKI SUBSTYTUTU... 77 Funkcja χ dla MDAAQ

Eksperyment Funkcja χ dla MDAAQ

Dopasowanie

Transformata Fouriera χ dla MDAAQ

Eksperyment

Transformata Fouriera χ dla MDAAQ

Dopasowanie Funkcja χ dla MDAA

Eksperyment Funkcja χ dla MDAA

Dopasowanie

Transformata Fouriera χ dla MDAA

Eksperyment

Transformata Fouriera χ dla MDAA

Dopasowanie

Rysunek 5.22. Funkcje χ(k) wraz z funkcją dopasowaną dla MDAA i MDAAQ, oraz ich transformaty Fouriera.

zmiany zachodzą dla parametru liczby koordynacyjnej atomu tlenu w odległości 2.85Å od centralnego absorbera. Takie same zmiany dotyczą atomów tlenu i węgla w pozycjach odpowiednio 3.29-3.34Å. We wszystkich trzech pozycjach po doda-niu chlorochininy zmniejsza się liczba atomów. Natomiast w pozycji 3.75Å wys-tępuje tendencja odwrotna. Parametry dopasowania dla widm obydwu roztworów wskazują na tendencje wzrostu nieuporządkowania parametrów w pierwszej stre-fie koordynacyjnej dla atomów osiowego tlenu i czterech atomów azotu, co może tłumaczyć widoczne różnice w ich transformatach Fouriera.

Rezultaty dopasowania dla kolejnej pary roztworów MDAA30 i MDAAQ30 przedstawiono w tab. 5.12 a graficznie na rys. 5.23.

Podobnie jak dla poprzednio omawianej pary parametr liczby koordynacyjnej tlenu osiowego w roztworze MDAA30 jest na takim samym poziomie, będąc jed-nocześnie mniejszy od jeden, co świadczy o zerwaniu wiązań mostkowych i o za-chodzącej wymianie osiowego atomu. Dodanie określonej objętości wody do kwasu octowego (w stosunku 1:30) w rozpuszczalniku powoduje jednak zwiększenie śred-niej odległości żelazowy absorber - osiowy tlen o 0.1Å w stosunku do odległości tego atomu w roztworach MDAA i MDAAQ bez dodatku wody. Co więcej w roz-puszczalniku AA30 po dodaniu chlorochininy maleje znacząco o 34 procent liczba koordynacyjna osiowego tlenu a długość jego wiązania skraca się o 0.05Å. Nie ule-gają zmianie natomiast ani parametry odległości ani parametry uporządkowania strukturalnego w atomach pierścienia FePPIX w ramach wyznaczonej niepew-ności. Parametry dopasowania świadczą o występowaniu w pozycji około 2.85Å kolejnego atomu tlenu w roztworze MDAA30, jednak w mniejszej liczebności niż

MDAA30 MDAAQ30

R 44.65 41.81

FI 0.00166 0.00138

EF -3.0±0.6 -3.0±0.6

X N(X) r(Fe-X) [Å] 2σ²(X) [Ų] N(X) r(Fe-X) [Å] 2σ²(X) [Ų] O¹ os. 0.32±0.02 1.87±0.01 0.0014±0.0008 0.21±0.03 1.82±0.02 0.002±0.001

N¹²³⁴ 4 2.05±0.01 0.012±0.002 4 2.05±0.01 0.013±0.003

Cα 8 3.08±0.02 0.013±0.003 8 3.08±0.03 0.013±0.002

Cmeso 4 3.40±0.03 0.013±0.006 4 3.41±0.06 0.016±0.006

Cβ 8 4.31±0.03 0.018±0.006 8 4.31±0.04 0.018±0.005

O¹p.p. d. 1.50±0.07 2.85±0.07 0.006±0.003 1.26±0.06 2.86±0.09 0.006±0.004

O²p.p. d. - - - - -

-C1 p.p. d. 2.28±0.15 3.62±0.12 0.003±0.001 2.35±0.23 3.61±0.13 0.003±0.002 O3p.p. d. 2.90±0.28 3.76±0.12 0.004±0.003 1.91±0.20 3.75±0.20 0.004±0.002

Tabela 5.12. Parametry dopasowania dla atomów i ich grup w strukturze jednostki strukturalnej cząsteczek o pojedynczym pierścieniu FePPIX + dodatkowe pozapierś-cieniowe atomy oznaczone jako p.p. d. w modelu struktury dla roztworów meso-hematyny w kwasie octowym: MDAA30 i MDAAQ30.

-8 Funkcja χ dla MDAAQ30

Eksperyment Funkcja χ dla MDAAQ30

Dopasowanie

Transformata Fouriera χ dla MDAAQ30

Eksperyment

Transformata Fouriera χ dla MDAAQ30

Dopasowanie Funkcja χ dla MDAA30

Eksperyment Funkcja χ dla MDAA30

Dopasowanie

Transformata Fouriera χ dla MDAA30

Eksperyment

Transformata Fouriera χ dla MDAA30

Dopasowanie

Rysunek 5.23. Funkcje χ(k) wraz z funkcją dopasowaną dla MDAA30 i MDAAQ30, oraz ich transformaty Fouriera.

w roztworze bez wody. Jego liczba koordynacyjna zmniejsza się po dodaniu chloro-chininy podobnie jak liczba koordynacyjna kolejnego atomu tlenu w pozycji 3.76Å która maleje znacząco po dodaniu antymalarycznego leku. Nie stwierdzono na-tomiast obecności atomu tlenu w odległości 3.34Å ani w modelu strukturalnym dla MDAA30 ani dla roztworu MDAAQ30. Brak znaczących różnic w położeniach dodatkowych węgli pozapierścieniowych w wyznaczonej strukturze wokół żelaza dla MDAA30 i MDAAQ30.

Rezultaty dopasowania kolejnej pary widm EXAFS roztworów MDAA15 i

5.2. STRUKTURA CZĄSTECZKI SUBSTYTUTU... 79

MDAAQ15 przedstawiono w tab. 5.13 a graficznie na rys. 5.24.

MDAA15 MDAAQ15

R 37.75 40.31

FI 0.00112 0.00133

EF -3.0±0.4 -3.0±0.6

X N(X) r(Fe-X) [Å] 2σ²(X) [Ų] N(X) r(Fe-X) [Å] 2σ²(X) [Ų] O1 os. 0.18±0.03 1.80±0.02 0.0020±0.0008 0.09±0.07 1.71±0.06 0.0016±0.0015

N¹²³⁴ 4 2.05±0.01 0.012±0.002 4 2.04±0.02 0.017±0.002

Cα 8 3.08±0.01 0.012±0.003 8 3.08±0.04 0.011±0.002

Cmeso 4 3.40±0.03 0.011±0.006 4 3.40±0.06 0.015±0.004

Cβ 8 4.31±0.03 0.018±0.008 8 4.31±0.04 0.018±0.008

O1p.p. d. 1.35±0.07 2.85±0.07 0.006±0.002 0.95±0.10 2.86±0.06 0.006±0.001

O2p.p. d. - - - - -

-C¹ p.p. d. 2.56±0.15 3.61±0.09 0.003±0.002 2.48±0.13 3.62±0.10 0.003±0.001 O³p.p. d. 1.96±0.13 3.76±0.09 0.004±0.002 1.85±0.10 3.75±0.08 0.004±0.002

Tabela 5.13. Parametry dopasowania dla atomów i ich grup w strukturze jednostki strukturalnej cząsteczek o pojedynczym pierścieniu FePPIX + dodatkowe pozapierś-cieniowe atomy oznaczone jako p.p. d. w modelu struktury dla roztworów meso-hematyny w kwasie octowym: MDAA15 i MDAAQ15.

-8 Funkcja χ dla MDAAQ15

Eksperyment Funkcja χ dla MDAAQ15

Dopasowanie

Transformata Fouriera χ dla MDAAQ15

Eksperyment

Transformata Fouriera χ dla MDAAQ15

Dopasowanie Funkcja χ dla MDAA15

Eksperyment Funkcja χ dla MDAA15

Dopasowanie

Transformata Fouriera χ dla MDAA15

Eksperyment

Transformata Fouriera χ dla MDAA15

Dopasowanie

Rysunek 5.24. Funkcje χ(k) wraz z funkcją dopasowaną dla MDAA15 i MDAAQ15, oraz ich transformaty Fouriera.

Parametry dopasowania MDAA15 i MDAA15Q wskazują na ten sam charakter zmiany liczby koordynacyjnej osiowego tlenu po dodaniu chlorochininy co para-metry dopasowania EXAFS dla MDAA30 i MDAA30Q. Dla MDAA15Q wartość jej jest na poziomie dziesiątej części jedności, ale została określona z duża nie-pewnością pozwalającą na założenie, że liczba koordynacyjna atomu może być

bliska zeru. Skróceniu ulega również odległość osiowego tlenu do centralnego ab-sorbera o 0.09Å. Nieobecność osiowego tlenu w dziewięciu pierścieniach FePPIX na dziesięć w roztworze MDAA15Q jest najprawdopodobniej silnie skorelowana ze skróceniem odległości (zmiana mieści się w granicy niepewności dopasowywanego parametru) czterech pierścieniowych atomów azotu, oraz znaczącym wzrostem o 0.005 ich nieuporządkowania strukturalnego. Odległości oraz nieuporządkowanie strukturalne na podstawie parametrów w granicy wyznaczonej niepewności po-zostałych atomów pierścienia FePPIX pozostają niezmienione. Wartość parametru liczby koordynacyjnej tlenu zidentyfikowanego w odległości 2.85Å ulega kolejnemu zmniejszeniu po dodaniu antymalarycznego leku. W przypadku pary MDAA15 i MAA15Q nie zauważono znaczących zmian liczby koordynacyjnej odległości czy nieuporządkowania pozostałych pozapierścieniowych atomów. Podobnie jak dla MDAA30 i MDAAQ15 nie stwierdzono obecności atomu tlenu w pozycji 3.34Å.

Charakterystyczną zmianą pozostającą jednak w granicach wyznaczonej nie-pewności dla wszystkich par roztworów MDAA i MDAAQ, MDAA30 i MDAA30Q oraz MDAA15 i MDAA15Q jest wzrost wartości czynnika Debya-Wallera czyli wzrost nieuporządkowania strukturalnego w strefie węgli typu C_meso. Znacząco inne zachowanie osiowego tlenu zaobserwowano po dodaniu chlorochininy tylko w obecności wody, co świadczyłoby o istotnym znaczeniu procesu dysocjacji lub hydrofobowości pierścienia FePPIX dla tworzenia stabilnego kompleksu pierścień FePPIX - chlorochinina w roztworze kwasu octowego. Zaproponowane w literatu-rze [103] funkcje poszczególnych grup atomów w cząsteczce chlorochininy w na-turalnym środowisku wakuoli pasożyta zamieszczono na rys. 5.25. Zgodnie z tym schematem tylko aromatyczna grupa atomów, oraz atom Cl oddziałuje bezpośred-nio z cząsteczką FePPIX, natomiast obecność pozostałych atomów jest niezbędna do akumulacji antymalarycznego leku w wakuoli pasożyta.

Rysunek 5.25. Cząsteczka chlorochininy (CQ) z zaznaczeniem funkcji poszczególnych grup jej atomów [103]. Kolorem zielonym oznaczono atom chloru, szarym - atomy węgla a niebieskim atomy azotu.

Uzyskane wyniki analizy EXAFS wskazują jednoznacznie na brak dodatkowych

5.2. STRUKTURA CZĄSTECZKI SUBSTYTUTU... 81

atomów zarówno lekkich typu węgiel i azot jak też cięższego atomu chloru mogą-cych pochodzić z cząsteczki chlorochininy w strefie koordynacyjnej w odległości poniżej 3.4Å od absorbującego atomu żelaza. Dla atomu chloru dopasowania EX-AFS rozszerzają ten zakres do 4.0Å. Jest to atom silniej rozpraszający dlatego jego obecność w dalszej odległości od żelaza jest jednoznacznie rozpoznawalna.

Efekt działania chlorochininy zaobserwowano w widmach χ(k) roztworów dla roz-puszczonej meso-hematyny tylko w obecności wody i polega on na zmniejszeniu wartości liczby koordynacyjnej dla osiowego tlenu oraz tlenu w pozycji 2.85Å.

Tlen w pozycji 2.85Å jest najprawdopodobniej atomem pochodzącym z cząsteczki kwasu octowego, ponieważ został dopasowany już w modelu strukturalnym doty-czącym roztworów bez obecności chlorochininy. Można zatem wysunąć wniosek, że chlorochinina tworzy z pierścieniem FePPIX kompleks redukując jednocześnie wpływ atomów roztworu. Redukcja liczby koordynacyjnej tlenu osiowego wyk-lucza wiązanie chlorochininy poprzez ten atom, ponieważ gdyby tak było wiązanie żelazo - osiowy tlen pozostałoby stabilne, tak jak ma to miejsce w przypadku wiązania w cząsteczce dimerowej w roztworze dimetylosulfotlenku (patrz kolejny rozdział dotyczący meso-hematyny w DMSO). Chlorochinina nie wiąże się zatem z pojedynczym pierścieniem FePPIX w podobny sposób jak halofantrine [104].

Być może kompleks pierścienia FePPIX powstaje przez wiązanie atomu azotu grupy niearomatycznej chlorochininy z grupami propylowymi pierścienia tak jak zaproponowane zostało przez M. Dascombe [105] dla wiązania hemina - chloro-chinina, zachodzi to jednak w odległości przekraczającej analizowane strefy koor-dynacyjne. Analiza EXAFS nie przedstawia dowodów na istnienie wiązania π − π części pierścieni aromatycznych obydwu związków nie wykluczając jednocześnie tej możliwości z zastrzeżeniem, że najbliższy atom cząsteczki chlorochininy od że-lazowego absorbera jest w odległości nie mniejszej od 3.6Å. Obserwowane zmiany parametrów dopasowania w obecności chlorochininy dla danego roztworu tylko w wypadku dodania cząsteczek wody potwierdzają wcześniejsze doniesienia w litera-turze o zwiększonym prawdopodobieństwie tworzenia kompleksu FePPIX - chlo-rochinina w obecności H2O [106]. Badanie tego efektu za pomaca wyznaczania logarytmicznej wartości stałej równowagi w metodzie miareczkowania dotyczyło związków typu chinina w tym chlorochininy w pH = 7.5 dla roztworu. EXAFS potwierdza znaczenie obecności wody dla stworzenia stabilnego kompleksu również w roztworze o kwaśnym pH.

Wpływ obecności wody na strukturę cząsteczki FePPIX przedstawia tab. 5.14, w której porównano parametry dopasowania funkcji χ(k) dla meso-hematyny roz-puszczonej w trzech rodzajach rozpuszczalnika AA, AA30 i AA15 oraz proszkowej meso-hematyny.

Z zestawienia wynika, że bez względu na objętość dodanej wody (1 jednostka na 30 i 15 jednostek kwasu octowego) wartości parametrów odległości poszcze-gólnych pierwiastków w strefach pierścienia FePPIX, oraz ich nieuporządkowanie strukturalne pozostają bez zmian na poziomie wyznaczonej niepewności dla każ-dego z roztworów. Natomiast w stosunku do proszkowej meso-hematyny można zauważyć następujące znaczące zmiany takie jak: ujednolicenie i skrócenie odleg-łości wiązań czterech pierścieniowych atomów azotu w stosunku do ich średniej dla proszkowej meso-hematyny - 2.072Å, skrócenie odległości od absorbera dla ato-mów w strefie węgli typu Cmeso, oraz wzrost nieuporządkowania strukturalnego

MDAA MDAA30 MDAA15 meso-hematyna

R= 53.29 44.65 37.75 27.85

FI= 0.00208 0.00166 0.00112 0.00007

N(Fe-O¹ os.) 0.34 ±0.03 0.32±0.02 0.18±0.03 1 r(Fe-O¹os.) 1.77 ±0.03 1.87±0.01 1.80±0.02 1.90±0.02

r(Fe-N¹) 2.05 ±0.01 2.05±0.01 2.05±0.01 2.058±0.009

r(Fe-N²) 2.05 2.05 2.05 2.065±0.009

r(Fe-N³) 2.05 2.05 2.05 2.077±0.009

r(Fe-N⁴) 2.05 2.05 2.05 2.088±0.009

r(Fe-Cα) 3.08x8 ±0.02 3.08x8±0.02 3.08x8±0.01 3.088x4±0.007 3.095x4±0.007 r(Fe-Cmeso) 3.40 ±0.04 3.40±0.03 3.40±0.03 3.46±0.01

r(Fe-Cβ) 4.31x8 ±0.06 4.31x8±0.03 4.31x8±0.03 4.27x4±0.03 4.30x4±0.04 2σ²(O1) 0.002±0.001 0.0014±0.0008 0.0020±0.0008 0.012±0.002 2σ²(4N) 0.013±0.002 0.012±0.002 0.012±0.002 0.0073±0.0005 2σ²(Cα) 0.011±0.004 0.013±0.003 0.012±0.003 0.007±0.001 2σ²(Cmeso) 0.012±0.006 0.013±0.006 0.011±0.006 0.009±0.002 2σ²(Cβ) 0.018±0.008 0.018±0.006 0.018±0.008 0.021±0.006

Tabela 5.14. Parametry dopasowania EXAFS dla roztworów bez obecności chlorochi-niny w porównaniu z parametrami dla meso-hematyny proszkowej.

dla strefy atomów azotu oraz węgli typu Cα w pierścieniu FePPIX. Bardzo istotne jest to, że w zależności od dodanej objętości wody zmienia się charakterystyka wiązania osiowego tlenu pozapierścieniowego. Dla MDAA30 zwiększa się odległość tego atomu od absorbera o 0.1Å w stosunku do roztworu bez wody a dla MDAA15 zmniejsza się o 47 procent jego liczba koordynacyjna. W analizie EXAFS parametr liczby koordynacyjnej jest skorelowany z parametrem nieuporządkowania struktu-ralnego 2σ², dlatego dopasowanie parametru liczby koordynacyjnej z wartością znacznie mniejszą niż 1 wpłynęło również na zmniejszenie wartości nieuporządko-wania strukturalnego.

Jeśli efektem działania chlorochininy w obecności cząsteczek wody jest, tak jak sugeruje EXAFS, wzrost ilości cząsteczek FePPIX z żelazem na trzecim stopniu utlenienia bez stabilnego wiązania ligandu, to lek ten powoduje wzrost ilości reak-tywnego Hemu Fe(III) w wakuoli i cytoplazmie komórki pasożyta a zatem działa poprzez stres oksydacyjny i w konsekwencji powoduje rozpad komórki pasożyta.

Analiza widm XANES

Porównanie widm dla par roztworów: MDAA-MDAAQ, MDAA30-MDAAQ30, oraz MDAA15-MDAAQ15 przeprowadzono również w zakresie energetycznym XA-NES. Na rys. 5.26 przedstawiono przykładowe widmo XANES i jego pochodną dla meso-hematyny w roztworze kwasu octowego, z zaznaczeniem charakterystycznych struktur.

Wszystkie widma XANES dla roztworów, rys. 5.27, rys. 5.28, rys. 5.29 za-wierają charakterystyczne struktury: P ( 7113eV), A ( 7118eV), szerokie platou D w maksimum w położeniu od 7131eV do 7135eV i najwyraźniej zarysowaną dla pary MDAA-MDAAQ strukturę C2 w położeniu 7153eV. W parach pomiędzy XANES dla roztworów z i bez chlorochininy różnią się nieznacznie MDAA30 z

5.2. STRUKTURA CZĄSTECZKI SUBSTYTUTU... 83

Rysunek 5.26. Eksperymentalne widmo XANES i jego pochodna dla meso-hematyny w roztworze kwasu octowego MDAA15 z zaznaczonymi miejscami pojawiania się charak-terystycznymi struktur dla widma porfiryn z centralnym atomem żelaza i osiowymi li-gandami. Duże litery odnoszą się do widma XANES a małe do jego pochodnej. Cudzys-łów oznacza ze dana struktura w danym widmie nie występuje, lub jest bardzo słabo zarysowana.

MDAAQ30 oraz MDAA15 i MDAAQ15. Zaobserwowano przesuniecie położenia krawędzi absorpcji o mniej niż 0.5eV w kierunku niższych energii dla roztworów z chlorochininą. Poza tym stosunek amplitudy maksimum krawędzi do amplitudy XANES powyżej 7160eV jest nieco mniejszy dla roztworu z chlorochininą w tych parach a w szczególności dla MDAA15 i MDAAQ15. Wskazuje to najprawdopo-dobniej na zmianę wzajemnych położeń atomów stref węgli w FePPIX. Zmiany

MDAAQ30 oraz MDAA15 i MDAAQ15. Zaobserwowano przesuniecie położenia krawędzi absorpcji o mniej niż 0.5eV w kierunku niższych energii dla roztworów z chlorochininą. Poza tym stosunek amplitudy maksimum krawędzi do amplitudy XANES powyżej 7160eV jest nieco mniejszy dla roztworu z chlorochininą w tych parach a w szczególności dla MDAA15 i MDAAQ15. Wskazuje to najprawdopo-dobniej na zmianę wzajemnych położeń atomów stref węgli w FePPIX. Zmiany

W dokumencie Polska Akademia Nauk (Stron 82-100)