Wykład 7/8: Zastosowanie metod analizy strukturalnej
Wykład 5: Rozwiązywanie struktur krystalicznych
W trakcie pomiaru dyfraktometrycznego promieniowanie rentgenowskie rozpraszane jest przez elektrony. Liczba atomowa atomu rozpraszającego oraz kąt rozproszenia (2θ), wyrażonego atomowym czynnikiem rozpraszania f, wpływają na stopień tego rozproszenia. W przypadku grupy atomów amplitudę i fazę promieniowania rentgenowskiego rozpraszanego przez komórkę podstawową wyraża się za pomocą czynnika struktury:
dla każdego odbicia.
Można go obliczyć za pomocą równań:
przy czym sumowania dokonuje się po wszystkich atomach w komórce elementarnej. Fale można przedstawić za pomocą liczb zespolonych:
ej - amplituda, αj - kąt fazowy.
Odwzorowanie to stanowi dogodny sposób przedstawienia dwóch prostopadłych składowych wektora (dla 0o i 90o) w jednym równaniu (A jest składową dla 0o, a B dla 90o).
Celem pomiaru jest uzyskanie trójwymiarowej mapy gęstości elektronowej, której interpretacja pozwala ustalić położenie atomów. Aby to osiągnąć należy wykonać trójwymiarowe sumowanie Fouriera. Szeregi Fouriera stosuje się ze względu na możliwość wykorzystania ich do opisu periodycznych funkcji i periodycznego rozmieszczenia rozpraszającej materii tworzącej kryształ. Liczbę elektronów przypadającą na jednostkę objętości lub gęstość elektronową w danym punkcie x,y,z oznaczoną symbolem ρ(x,y,z), podaje wyrażenie:
Projekt pn. „Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki
74
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Vk - objętość komórki elementarnej,
F(hkl) - czynnik struktury dla wskaźników hkl.
Uwzględniając prawidłowość struktury i zakładając, że:
część wyrażeń na gęstość elektronową znosi się i otrzymujemy:
Gdybyśmy znali wartość F i φ dla każdego hkl moglibyśmy obliczyć ρ dla wszystkich wartości x,y,z uzyskując trójwymiarową mapę gęstości elektronowej. Jednak dane eksperymentalne dostarczają tylko modułu |F| obliczonego na podstawie natężenia I, nie dostarczają natomiast fazy tej funkcji zespolonej. Dlatego też problem fazowy jest podstawowym problemem, jaki należy rozwiązać w analizie strukturalnej. Istotę problemu fazowego obrazuje diagram Hosemanna i Bagchiego (Rysunek 5.1). ) ( ) ( ) (b FF* b F b I ) (u P
(r)Rysunek 5.1 Diagram Hosemanna i Bagchiego, w którym I(b) oznacza natężenie wiązki ugiętej,
F(b) – czynnik struktury, P(u) – funkcja Pattersona i ρ(r) – gęstość elektronowa.
Etapy możliwe do wykonania oznaczone są linią ciągłą, natomiast linią przerywaną zaznaczone są etapy, w których wymagana jest znajomość fazy czynników struktury. Rozwiązanie problemu fazowego dla związków małocząsteczkowych można znaleźć poprzez interpretację funkcji Pattersona P(u) lub metodami bezpośrednimi. Podstawą metod bezpośrednich są oczywiste fakty, że gęstość elektronowa w żadnym miejscu nie może być mniejsza niż zero, oraz że ma ona rozkład "atomowy", tj. skoncentrowana jest głównie w rdzeniach atomowych struktury. Te proste warunki wprowadzają tak silne ograniczenia na zależności między czynnikami struktury, że udaje się ostatecznie wyprowadzić relacje wiążące ich fazy. Wybór jednej z metod uzależniony jest w dużej mierze od składu chemicznego analizowanego kryształu. Funkcję Pattersona można stosować w przypadku struktur zawierających tzw. atomy ciężkie o dużej liczbie atomowej.
Projekt pn. „Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki
75
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Niestety o ponad dwa rzędy wielkości większe struktury kryształów makromolekuł nie dają się rozwiązać metodami bezpośrednimi. Należało opracować inne. Pionierem na tym polu był Max Perutz, który pracując nad strukturą hemoglobiny stworzył w latach 50. metodę podstawienia izomorficznego (MIR). W latach 60., głównie dzięki pracom Michaela Rossmanna, powstała metoda podstawienia cząsteczkowego (MR). W latach 80. przyszła kolej na metodę dostrojonej dyfrakcji anomalnej (MAD), kojarzoną zwykle z nazwiskiem Wayne'a Hendricksona. Wszystkie trzy metody bazują w pewnym stopniu na funkcji Pattersona.
Rentgenowska analiza strukturalna monokryształów opiera się na zjawisku dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego na kryształach. Na podstawie obrazu dyfrakcyjnego (Rysunek 5.2a) otrzymanego przez rozpraszanie promieni rentgenowskich na molekułach lub atomach periodycznie ułożonych w krysztale można obliczyć mapę rozkładu gęstości elektronowej (Rysunek 5.2b). Model struktury otrzymany przez interpretację rozkładu gęstości elektronowej jest rozbudowywany i udokładniany z użyciem danych z pomiaru dyfrakcyjnego, co pozwala na otrzymanie dokładnej struktury badanego kryształu.
a) b)
Rysunek 5.2 a) Przykładowy obraz dyfrakcyjny. b) Przykładowa mapa gęstości elektronowej.
Proces analizy rentgenowskiej monokryształów można podzielić na dwa etapy:
wyznaczenie parametrów komórki elementarnej, klasy Lauego, typu sieci przestrzennej i układu krystalograficznego,
wyznaczenie położeń atomów lub jonów w komórce elementarnej na podstawie pomiaru i analizy natężeń promieni ugiętych (refleksów).
Projekt pn. „Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki
76
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
Wstępny pomiar rentgenograficzny (pre-experiment) umożliwia ocenę jakości wybranego do pomiaru monokryształu. Jeżeli jego „zdolność dyfrakcji” jest dobra oraz jest trwały podczas naświetlania promieniowaniem rentgenowskim, możemy przejść do pomiaru głównego. Wstępny pomiar umożliwia również poprawne zaplanowanie dalszego pomiaru. Pakiet programów CrysAlis, który jest na wyposażeniu dyfraktometru, umożliwia obsługę oraz kontrolę w trakcie pomiaru. Pakiet ten składa się z dwóch programów: CrysAlisCCD, który pozwala sterować procedurami pomiarowymi oraz CrysAlisRED, służący do redukcji danych uzyskanych z pomiaru rentgenograficznego.
Z pomiaru dyfraktometrycznego uzyskuje się parametry komórki elementarnej oraz wartości intensywności promieni ugiętych dla badanego kryształu. Jest to zbiór danych eksperymentalnych niezbędnych do rozwiązania struktury.
Pierwszy etap polega na analizie tabeli pików w celu znalezienia trzech najkrótszych wektorów liniowo niezależnych. Wybór trzech niskokątowych refleksów i początku współrzędnych umożliwia znalezienie tych wektorów. Można w ten sposób zbudować komórkę elementarną w sieci odwrotnej. Następnie, program w tak zbudowanej przestrzeni próbuje wywskaźnikować wszystkie uzyskane podczas pomiaru refleksy. Procedura ta może być powtarzana, program szuka nowych trzech wektorów i ponownie przypisuje wskaźniki refleksom, aż do momentu wywskaźnikowania większości z nich. Wskaźniki hkl, położenie refleksów (kąty θ) oraz długość fali użytego promieniowania program używa do wyznaczenia parametrów komórki elementarnej.
Trójwymiarowy kształt refleksów zostaje odtworzony, przy pomocy procedur, które określają położenie, podają wskaźniki hkl oraz mierzą zintegrowane intensywności refleksów wykorzystując udokładnioną macierz orientacji.
Kolejnym etapem jest redukcja danych, która polega na integracji i korekcji natężeń otrzymanych z pomiaru refleksów. Proces ten może potrwać nawet kilkadziesiąt minut, uzależnione jest ro od mocy komputera oraz od liczby uzyskanych refleksów. Po redukcji danych otrzymujemy plik *.hkl, który zawiera wskaźniki refleksów, kwadraty czynników struktury (F2) oraz odchylenie standardowe dla F2. Kolejny plik (*.sum), otrzymany na tym etapie, zawiera techniczne informacje dotyczące pomiaru, szczegóły procesu redukcji danych a także parametry komórki elementarnej. Posiadając oba pliki można przejść do dalszych obliczeń, które doprowadzą nas do rozwiązania struktury.
W celu rozwiązania problemu fazowego jak i dalszego udokładnienia struktury można skorzystać z programów opracowanych przez Georgea Sheldricka. Analizy wygaszeń systematycznych oraz wyboru grupy przestrzennej dokonuje się za pomocą programu XPREP (lub GRAL – program z pakietu CrysAlis). W przypadku związków małocząsteczkowych, do rozwiązania problemu fazowego metodami bezpośrednimi lub metodą Pattersona stosuje się program SHELXS. W kolejnym etapie następuje udokładnienie struktury przy pomocy programu
Projekt pn. „Wzmocnienie potencjału dydaktycznego UMK w Toruniu w dziedzinach matematyczno-przyrodniczych” realizowany w ramach Poddziałania 4.1.1 Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki
77
Projekt współfinansowany przez Unię Europejską w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego
SHELXL. Pracując z biomakromolekułami używa się XDS, MOSFLM oraz programy z pakietu CCPR (SHELXC, SHELXD, SHELXE, PHASER, REFMAC). Do analizy otrzymanych wyników w sposób graficzny oraz do przygotowania rysunków związków małocząsteczkowych stosować można program XP, ORTEP, MERCURY. W przypadku makrocząsteczek program COOT, PyMol oraz RasMol.
Ogólnie proces udokładnienia struktury składa się z następujących etapów:
zbudowanie modelu struktury ze wszystkimi atomami niewodorowymi, udokładnienie struktury z izotropowymi czynnikami temperaturowymi,
udokładnienie położeń atomów niewodorowych z zastosowaniem anizotropowych czynników temperaturowych oraz lokalizacja atomów wodoru z różnicowej mapy gęstości elektronowej, udokładnienie wszystkich atomów z różnymi czynnikami temperaturowymi dla
poszczególnych typów atomów (anizotropowymi dla atomów niewodorowych i izotropowymi dla atomów wodoru). Zazwyczaj nie udokładnia się położeń i czynników temperaturowych atomów wodoru. Stosowane są więzy nałożone na geometrię grup zawierających atomy wodoru, zaś wartości ich czynników temperaturowych wiąże się z czynnikami temperaturowymi atomów, z którymi są związane.