Sączenie molekularne

4.2.3. Sączenie molekularne

Uwzględniając niepowodzenia przedstawionych wcześniej metod oczyszczania, na kolej-nym etapie zastosowano rozdział badanych białek na sitach molekularnych.

Toksyna killerowa D. hansenii KI2a

Bazując na doniesieniach literaturowych, na podstawie których większość białek killero-wych ma stosunkowo niewielką masę cząsteczkową, w zakresie od około 20 kDa do około 85 kDa, do rozdziału toksyny szczepu D. hansenii KI2a w pierwszej kolejności zastosowa-no złoże dzielące białka w zakresie od 70 do 3 kDa.

Spośród 42 zebranych frakcji aktywność killerową stwierdzano we frakcjach od 5 do 20. Najwyższą aktywnością bójczą cechowała się frakcja 10, wywołująca strefę inhibicji wzrostu szczepu wzorcowego o wielkości ok. 10 mm (rys. 12).

55

Rys. 12. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyny killerowej szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu Superdex 75

Fig. 12. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin collected during molecular filtration on Superdex 75 Wyrażenie aktywności killerowej w umownych jednostkach pokazało, że zakres frakcji zawierający znaczące ilości toksyny killerowej nie jest zbyt szeroki; w przedziale od 6 do 12 frakcji. Oznacza to, że aktywność killerowa obserwowana jest we frakcjach wypływających z kolumny w objętości bardzo bliskiej do tzw. pustej objętości (Ve/Vo = 1,03). Szacowana wielkość tego białka jest więc poza zakresem rozdziału złoża, czyli powyżej 70 kDa.

Do kolejnego rozdziału zastosowano zatem złoże dzielące białka w zakresie od 600 do 10 kDa. Frakcja 23 o najwyższej aktywności

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji – inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 12. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyny killerowej

szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu Superdex 75 Fig. 12. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin

collected during molecular filtration on Superdex 75

Wyrażenie aktywności killerowej w umownych jednostkach pokazało, że zakres frakcji za-wierający znaczące ilości toksyny killerowej nie jest zbyt szeroki; w przedziale od 6 do 12 frakcji. Oznacza to, że aktywność killerowa obserwowana jest we frakcjach wypływających z kolumny w objętości bardzo bliskiej do tzw. pustej objętości (Ve/Vo = 1,03). Szacowana wielkość tego białka jest więc poza zakresem rozdziału złoża, czyli powyżej 70 kDa.

Do kolejnego rozdziału zastosowano zatem złoże dzielące białka w zakresie od 600 do 10 kDa. Frakcja 23 o najwyższej aktywności bójczej, uzyskana podczas tego rozdziału, wska-zuje, że szacunkowa masa cząsteczkowa badanej toksyny nie przekracza 25 kDa (rys. 13).

43 Mimo wykalibrowania obydwu kolumn szacowane na podstawie tych rozdziałów masy białek, obecnych we frakcjach o najwyższej aktywności, pozostawały ze sobą w sprzecz-ności. Biorąc pod uwagę zarówno powyższe rezultaty, jak i wyniki uzyskane z zastosowa-niem chromatografii powinowactwa z konkanawaliną A, można przypuszczać, że dochodzi do niespecyficznych oddziaływań pomiędzy toksynami a matrycą tych złóż – agarozą i/lub dekstranem, szczególnie złoża Superdex 200.

56

bójczej, uzyskana podczas tego rozdziału, wskazuje, że szacunkowa masa cząsteczkowa badanej toksyny nie przekracza 25 kDa (rys. 13). Mimo wykalibrowania obydwu kolumn, szacowane na podstawie tych rozdziałów masy białek, obecnych we frakcjach o najwyższej aktywności, pozostawały ze sobą w sprzeczności. Biorąc pod uwagę zarówno powyższe rezultaty, jak i wyniki uzyskane z zastosowaniem chromatografii powinowactwa z konkanawaliną A, można przypuszczać, że dochodzi do niespecyficznych oddziaływań pomiędzy toksynami, a matrycą tych złóż – agarozą i/lub dekstranem, szczególnie złoża Superdex 200.

Rys. 13. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyny killerowej szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu Superdex 200 HR 10/30

0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji – inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 13. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyny killerowej szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu Superdex 200 HR 10/30

Fig. 13. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin collected during molecular filtration on Superdex 200 HR 10/30

W celu wyeliminowania niespecyficznej adsorpcji toksyn killerowych z agarozą na kolej-nym etapie badań zastosowano syntetyczne złoże poliakrylamidowe BioGel P-150. Jest to polimer z grupy poliakrylanów (Polyacrylamide-co-methylene-bis-acrylamide) dzielący białka w zakresie ich mas cząsteczkowych, w przedziale od 70 do 3 kDa. W profilu aktyw-ności killerowej wyrażonej w umownych jednostkach aU, uzyskanym w wyniku tego roz-działu, ujawniały się dwa piki o najwyższej aktywności bójczej, frakcje 4 i 9. Wyznaczona na podstawie objętości elucyjnej masa białka obecnego we frakcji 4 wynosiła powyżej 60– 70 kDa, a we frakcji 9 około 45 kDa (rys. 14).

44

58

Rys. 14. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-150

Fig. 14. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin collected during molecular filtration on BioGel P-150 Rozdział tego białka na złożu Biogel P-200, dzielącym białka w szerszym zakresie mas cząsteczkowych (200–30 kDa) potwierdził obecność 2 aktywnych frakcji białkowych; ich szacunkowa masa wynosi ok 78 kDa (frakcje 28–30) i 46 kDa (frakcje 35–38) (rys. 15).

W celu wykazania ewentualnych różnic pomiędzy białkami obecnymi w obu pikach sprawdzano aktywność bójczą każdego z preparatów wobec trzech różnych szczepów: Y. lipolytica PII6a, Y.

lipolytica ATCC 20460 i S. occidentalis ATCC 44442 na agarze

YPB-MB. Każdy z preparatów wykazywał taką samą aktywność bójczą wobec 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji – inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 14. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych

szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-150 Fig. 14. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin

collected during molecular filtration on BioGel P-150

Rozdział tego białka na złożu Biogel P-200, dzielącym białka w szerszym zakresie mas cząsteczkowych (200–30 kDa), potwierdził obecność 2 aktywnych frakcji białkowych; ich szacunkowa masa wynosi ok 78 kDa (frakcje 28–30) i 46 kDa (frakcje 35–38) (rys. 15).

W celu wykazania ewentualnych różnic pomiędzy białkami obecnymi w obu pi-kach sprawdzano aktywność bójczą każdego z preparatów wobec trzech różnych szcze-pów: Y. lipolytica PII6a, Y. lipolytica ATCC 20460 i S. occidentalis ATCC 44442 na agarze YPB-MB. Każdy z preparatów wykazywał taką samą aktywność bójczą wobec odpowied-niego szczepu wrażliwego, a strefy zahamowania wzrostu wynosiły 6,6, 4,4 i 6,1 mm, od-powiednio w przypadku szczepu Y. lipolytica PII6a, Y. lipolytica ATCC 20460 i S. occiden-talis ATCC 44442 (dane niepublikowane).

45

59

odpowiedniego szczepu wrażliwego, a strefy zahamowania wzrostu wynosiły 6,6, 4,4 i 6,1 mm, odpowiednio w przypadku szczepu Y.

lipolytica PII6a, Y. lipolytica ATCC 20460 i S. occidentalis ATCC 44442

(dane niepublikowane).

Rys. 15. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-200

Fig. 15. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin collected during molecular filtration on BioGel P-200 Toksyna killerowa D. hansenii AII4b

Toksynę killerową szczepu D. hansenii AII4b oczyszczano na złożach Superdex 200, BioGel P-150 i BioGel P-200. W wyniku rozdziału na

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1. 4. 7. 10. 13. 16. 19. 22. 25. 28. 31. 34. 37. 40. 43. 46. 49. 52. 55. 58. aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji; inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 15. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych

szczepu D. hansenii KI2a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-200 Fig. 15. Killer activity of individual fractions of D. hansenii KI2a killer toxin

collected during molecular filtration on BioGel P-200 Toksyna killerowa D. hansenii AII4b

Toksynę killerową szczepu D. hansenii AII4b oczyszczano na złożach Superdex 200, Bio-Gel P-150 i BioBio-Gel P-200. W wyniku rozdziału na pierwszym z wymienionych złóż aktyw-ność bójczą wykazywało tylko kilka ostatnich frakcji, co sugeruje, że toksyna jest białkiem o masie cząsteczkowej poniżej 25 kDa.

Wyniki uzyskane w trakcie rozdziału toksyny tego szczepu na kolumnie wypełnionej złożem BioGel P-150, podobnie jak w przypadku toksyny KI2A, były sprzeczne z uzyska-nymi podczas sączenia na Superdex 200. Aktywne frakcje wypłynęły tuż za tzw. pustą ob-jętością, co wskazuje, że badane białko ma wielkość przekraczającą zakres podziału złoża, czyli powyżej 70 kDa (dane niepublikowane).

W dalszej części zastosowano więc złoże dzielące białka w zakresie większych mas czą-steczkowych BioGel P-200. Natywna masa białek obecnych we frakcjach 17–18 wykazują-cych najwyższą aktywność killerową wynosi powyżej 232 kDa (rys. 16).

Otrzymane wyniki są zaskakujące, gdyż żadna z poznanych dotychczas toksyn nie cechuje się tak dużą masą cząsteczkową. Wyniki te pozostają również w sprzecz-ności z uzyskanymi w wyniku zagęszczania płynu pohodowlanego szczepu AII4b na membranach o różnym punkcie odcięcia sugerujących, że masa białka tego szczepu nie przekracza 50 kDa.

46

61

Rys. 16. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych szczepu D. hansenii AII4b, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-200

Fig. 16. Killer activity of individual fractions of D. hansenii AII4b killer toxin collected during molecular filtration on BioGel P-200 Toksyna killerowa D. hansenii MI1a

Oczyszczanie toksyny killerowej szczepu MI1a przeprowadzono analogicznie do toksyny szczepu AII4b. Uzyskana, podczas rozdziału na złożu Superdex 200, najwyższa aktywność bójcza we frakcjach od 19 do 24 pozwala sądzić, że masa cząsteczkowa tego białka mieści się w zakresie 25–45 kDa (rys. 17).

Biorąc jednak pod uwagę możliwość wiązania białka killerowego do matrycy złoża-agarozy i zakłócenia w ich prawidłowym rozdziale, w

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1. 4. 7. 10. 13. 16. 19. 22. 25. 28. 31. 34. 37. 40. 43. 46. 49. 52. 55. 58. aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji – inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 16. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych

szczepu D. hansenii AII4b, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-200 Fig. 16. Killer activity of individual fractions of D. hansenii AII4b killer toxin

collected during molecular filtration on BioGel P-200 Toksyna killerowa D. hansenii MI1a

Oczyszczanie toksyny killerowej szczepu MI1a przeprowadzono analogicznie do toksyny szczepu AII4b. Uzyskana – podczas rozdziału na złożu Superdex 200 – najwyższa aktyw-ność bójcza we frakcjach od 19 do 24 pozwala sądzić, że masa cząsteczkowa tego białka mieści się w zakresie 25–45 kDa (rys. 17).

Biorąc jednak pod uwagę możliwość wiązania białka killerowego do matrycy złoża--agarozy i zakłócenia w ich prawidłowym rozdziale, następnie przeprowadzono sączenie na syntetycznym złożu BioGel P-200, dzielącym w zakresie mas cząsteczkowych 200–30 kDa. Podczas rozdziału na kolumnie wypełnionej tym złożem najwyższą aktywność kille-rową odnotowano we frakcjach 23–25, co świadczy o tym, że masa cząsteczkowa zawarte-go w nich białka wynosi ok. 152 kDa (rys. 18).

47

62

kolejnym etapie przeprowadzono sączenie na syntetycznym złożu BioGel P-200, dzielącym w zakresie mas cząsteczkowych 200–30 kDa. Podczas rozdziału na kolumnie wypełnionej tym złożem najwyższą aktywność

Rys. 17. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyny killerowej szczepu D. hansenii MI1a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu Superdex 200 HR 10/30

Fig. 17. Killer activity of individual fractions of D. hansenii MI1a killer toxin collected during molecular filtration on Superdex 200 HR 10/30 0 100 200 300 400 500 600 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji – inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 17. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyny killerowej szczepu D. hansenii MI1a, zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu Superdex 200 HR 10/30

Fig. 17. Killer activity of individual fractions of D. hansenii MI1a killer toxin collected during molecular filtration on Superdex 200 HR 10/30

Rys. 18. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych szczepu D. hansenii MI1a zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-200

Fig. 18. Killer activity of individual fractions of D. hansenii MI1a killer toxin collected during molecular filtration on BioGel P-200 killerową odnotowano we frakcjach 23–25, co świadczy o tym, że masa cząsteczkowa zawartego w nich białka wynosi ok. 152 kDa (rys. 18).

W celu określenia skuteczności oczyszczania na sitach molekularnych wykonano elektroforezę białkową SDS-PAGE, zarówno zagęszczonych prób przed ich rozdziałem, jak i aktywnych frakcji z rozdziałów na Super-dex 75, Super-dex 200 oraz BioGel P-150.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 2 4 6 8 10 12 14 1. 5. 9. 13. 17. 21. 25. 29. 33. 37. 41. 45. 49. 53. 57. aU/ml strefa inhibicji [mm] inhibition zone numer frakcji fraction number

strefa inhibicji – inhibition zone aktywność killerowa – killer activity

Rys. 18. Aktywność killerowa poszczególnych frakcji toksyn killerowych szczepu D. hansenii MI1a zebranych podczas sączenia molekularnego na złożu BioGel P-200

Fig. 18. Killer activity of individual fractions of D. hansenii MI1a killer toxin collected during molecular filtration on BioGel P-200

48

W celu określenia skuteczności oczyszczania na sitach molekularnych wykonano elektro-forezę białkową SDS-PAGE zarówno zagęszczonych prób przed ich rozdziałem, jak i ak-tywnych frakcji z rozdziałów na Super-dex 75, Super-dex 200 oraz BioGel P-150.

Rys. 19. Elektroforeza białkowa SDS-PAGE toksyn killerowych badanych szczepów

D. hansenii przed rozdziałem metodą sączenia molekularnego. Żel wybarwiony roztworem

koloidalnego Coomassie (EZBlueTM Gel Staining Reagent (SIGMA) Fig. 19. SDS-PAGE of tested D. hansenii strains of killer toxins before separation

using molecular filtration method. Gel was coloured with colloidal Coomassie dye (EZBlueTM Gel Staining Reagent (SIGMA))

Zawartość poszczególnych ścieżek:

1. Marker Unstained Protein Molecular Weight Marker (Pharmacia); 2. białko killerowe szczepu KI2a;

3. białko killerowe szczepu AII4b; 4. białko killerowe szczepu MI1a.

W próbkach nieoczyszczonych obserwowano obecność siedmiu prążków o wielkości od 30 do 66 kDa (rys. 19). Prążki te widoczne były również po procesie sączenia mole-kularnego na wyżej wymienionych złożach (rys. 20). W żadnej aktywnej frakcji, uzyska-nej w wyniku rozdziału, nie otrzymano jednak czystego białka. Widoczne na rysunku 19 ciemno wybarwione obszary w zakresie mas cząsteczkowych 14,4–20 kDa były wynikiem obecności związków barwnych pochodzących ze składników podłoża, które w przypad-ku białka killerowego szczepu KI2a zostały usunięte w trakcie sączenia moleprzypad-kularnego na Superdex 75 i BioGel P-150.

49

Rys. 20. Elektroforeza białkowa SDS-PAGE toksyn killerowych badanych szczepów D. hansenii poddanych rozdziałowi na sitach molekularnych. Żel wybarwiony roztworem

koloidalnego Coomassie (EZBlueTM Gel Staining Reagent (SIGMA) Fig. 20. SDS-PAGE of tested D. hansenii strains of killer toxins after separation

using molecular filtration method. Gel was coloured with colloidal Coomassie dye (EZBlueTM Gel Staining Reagent (SIGMA))

Zawartość poszczególnych ścieżek:

1. Frakcje nieaktywne z rozdziału na złożu BioGel P-150 (KI2a);

2–3. Aktywne frakcje z rozdziału na złożu BioGel P-150 (KI2a): 2 – szczyt I; 3 – szczyt II; 4. Aktywne frakcje z rozdziału na złożu Superdex 75 (KI2a);

5. Aktywne frakcje po rozdziale na złożu Superdex 200 (KI2a); 6. Marker Unstained Protein Molecular Weight Marker (Fermentas); 7. Aktywne frakcje po rozdziale na złożu BioGel P-150 (AII4b); 8. Aktywne frakcje po rozdziale na złożu Superdex 200 (AII4b); 9. Aktywne frakcje po rozdziale na złożu BioGel P-150 (MI1a); 10. Aktywne frakcje po rozdziale na złożu Superdex 200 (MI1a);

Podsumowując, oczyszczanie toksyn killerowych drożdży D. hansenii okazało się pro-cesem żmudnym i stwarzającym ogromne trudności. Najlepszą metodą wstępnego oczysz-czania toksyn było wysalanie siarczanem amonu i zagęszczanie supernatantu na membranie o punkcie odcięcia 18 kDa. Oczekiwanych efektów nie przyniosło oczyszczanie białek me-todą chromatografii powinowactwa z konkanawaliną A i β-glukanem oraz chromatografia jonowymienna. W wyniku sączenia molekularnego badanych toksyn uzyskano różne obra-zy rozdziałów. Toksyna szczepu D. hasenii KI2a cechowała się obecnością dwóch aktywnych białek o masach 46 i 78 kDa. W preparatach toksyn dwóch pozostałych szczepów (AII4b i MI1a) stwierdzano pojedyncze białka o masie cząsteczkowej odpowiednio powyżej 232 i około 152 kDa. W obrazie elektroforetycznym uzyskano kilka prążków wielkości od 30 do 66 kDa, trudno jest jednak oszacować natywną masę cząsteczkową toksyn killerowych.

50