Stabilność jonów i fragmentacja

długich oligonukleotydów. Do analizy oligonukleotydów, nie dłuŜszych niŜ 25 nukleotydów, często uŜywa się 2,4,6-THAP, 6-aza-2-tiotyminę lub mieszaninę kwasów aminobenzoesowego i nikotynowego.

Kwasy nukleinowe, ze względu na swój charakter, mają duŜe powinowactwo do jednowartościowych jonów metali. W ich obecności powstają sole oligonukleotydów, które utrudniają analizę, obniŜając lotność kwasów nukleinowych i wpływając tym samym na intensywność i szerokość sygnałów. W wyniku przejścia z fazy stałej do fazy gazowej oligonukleotyd przyłącza kationy metali, aby zredukować siły odpychania elektrostatycznego wywołane obecnością ładunków ujemnych w obrębie łańcucha. Powstają jony molekularne z róŜną liczbą kationów metali. W przypadku analizy wysokocząsteczkowych oligonukleotydów następuje znaczące poszerzenie sygnału. Szczególnie uciąŜliwe są jony sodu i potasu, poniewaŜ występują bardzo powszechnie w środowisku. Ten problem moŜna rozwiązać wymieniając je na kationy amonowe. Sole amonowe oligonukleotydów podczas procesu desorpcji/jonizacji ulegają rozkładowi z wytworzeniem wolnego kwasu i amoniaku.

Jest kilka sposobów na wymianę kationów metali na kationy amonu. Chyba najprostszym jest zastosowanie bezpośrednio przed analizą Ŝywicy jonowymiennej załadowanej jonami amonu [162]. Dość wydajną i popularną techniką jest wytrącanie oligonukleotydów za pomocą alkoholu z roztworu octanu amonu [168]. Inną moŜliwością jest dodanie do roztworu matrycy wspomnianych wcześniej soli amonowych [88]. Przeprowadzono równieŜ serię doświadczeń, w których testowano wpływ zasad organicznych na redukcję ilości adduktów oligonukleotydu z metalami oraz trwałość ich jonów molekularnych [169]. Badano takŜe wpływ innych substancji pomocniczych: amin biogennych [170, 171], cukrów [172] oraz poliakrylamidu [173] i glicerolu [174].

StęŜenia stosowanych roztworów matrycy są róŜne i zaleŜą od jej rozpuszczalności, poniewaŜ przygotowuje się roztwory nasycone. Zwykle zawierają się w granicach 500mM. Sygnały pochodzące od jonów matrycy występują w widmie w obszarze 100-1000Da.

4.2. Stabilność jonów i fragmentacja

W zaleŜności od przedziału czasu, w którym odbywa się fragmentacja powstające podczas analizy MALDI-TOF jony fragmentaryczne moŜna podzielić na cztery kategorie [175]:

powstające natychmiast – kiedy czas Ŝycia jonu macierzystego jest porównywalny z czasem jego powstania. Czas przelotu takich jonów fragmentarycznych będzie odpowiadał stosunkowi ich masy do ładunku,

SPEKTROMETRIA MAS MALDI-TOF

49
szybkie – gdy czas Ŝycia jonu macierzystego jest nieco dłuŜszy od czasu potrzebnego na jego wygenerowanie. Takie fragmenty obserwowane są w liniowym widmie jako „ogony” sygnałów skierowane w stronę wyŜszych mas. RóŜnice w szybkości kompensuje zastosowanie reflektronu,

wczesne metastabilne – gdy czas Ŝycia jonów macierzystych jest równy czasowi ich przyspieszenia. Powstałe jony fragmentaryczne są rozsiane w zakresie mas od jonu macierzystego do fragmentarycznego. Wczesna metastabilna fragmentacja jest przyczyną ograniczeń w zastosowaniu metody MALDI,

metastabilne – powstają w regionie wolnym od pola, mają więc tę samą prędkość co jony macierzyste i wraz z nimi docierają do detektora. Mimo, Ŝe mają tę samą prędkość, obdarzone są niŜszą masą od jonów macierzystych i mogą być wykryte za pomocą analizy PSD (ang. Post Source Decay). Jest to technika detekcji jonów metastabilnych, polegająca na stopniowym zmniejszaniu potencjału pola elektrycznego przyłoŜonego do reflektronu. NiŜsze wartości napięcia pozwalają na zbieranie jonów fragmentarycznych w obrębie coraz niŜszych mas [176-178]. Na zakres fragmentacji ma wpływ szereg czynników. Między innymi jest to rodzaj stosowanej matrycy, ale równieŜ czas przebywania oligonukleotydu w akceleratorze [179]. Tłumaczy to wzrastającą wraz z masą tendencją oligonukleotydów do fragmentacji. Jest główną przeszkodą podczas analizy MALDI-TOF długich sekwencji. Im dłuŜszy oligonukleotyd tym dłuŜej przebywa w akceleratorze.

Na podstawie analizy MALDI-IR oligonukleotydów z uŜyciem kwasu bursztynowego jako matrycy ustalono szereg reguł, od których zaleŜy fragmentacja kwasów nukleinowych (zarówno rodzaje jonów fragmentarycznych jak i ich nomenklaturę opisałam w rozdziale 3.2.3.3, Część I):

1. największe intensywności w widmie osiągają fragmenty niskocząsteczkowe,

2. ilość jonów fragmentarycznych wzrasta wraz ze wzrostem natęŜenia promieniowania,

3. nie obserwuje się fragmentacji w sąsiedztwie reszt tymidynowych,

4. w sąsiedztwie A, C, i G nie obserwuje się znaczących róŜnic w wydajności fragmentacji.

Jest kilka przyczyn, dla których sygnały pochodzące od jonów fragmentarycznych o niŜszej masie charakteryzują się większą intensywnością. Po pierwsze, bez wątpienia wydajność detekcji maleje wraz ze wzrostem masy. Po drugie, wraz ze wzrostem rozmiarów jonu fragmentarycznego zwiększa się prawdopodobieństwo powstania jonów drugiej

SPEKTROMETRIA MAS MALDI-TOF

50 generacji. To ostatnie zjawisko prowadzi do zwiększenia ilości jonów o mniejszej masie kosztem jonów o masie większej.

Przy zastosowaniu matryc innych niŜ HPA obserwuje się jony fragmentaryczne oligonukleotydów równieŜ w widmach MALDI-UV [99, 180]. Stosując kwas pikolinowy jako matrycę w połączeniu z długością promieniowania laserowego 266nm, Juhasz et al. na podstawie sygnałów pochodzących od jonów fragmentarycznych mogli zrekonstruować sekwencję 11-meru [103].

Analiza MALDI-PSD jak dotąd daje zadowalające rezultaty wyłącznie dla krótkich oligomerów i przedstawione zostały jedynie widma pięcio- i sześciomerów [181, 182].

O O P O O O OH B O O BH+ O O O P O O -B H -BH O O P O O O OH B O O O O O P O OH B H O O P O O O OH B O H O O O O P HO OH B O O P O OH O OH B O H₂C + +

Rys. 27. Mechanizm fragmentacji oligonukletydu w warunkach analizy MALDI.

Mechanizm powstawania jonów fragmentarycznych był szeroko badany i do dziś dyskutowane są jego szczegóły. Jednak, co do ogólnego schematu, badacze zajmujący się tą dziedziną są zgodni. Fragmentacja rozpoczyna się 1,2-eliminacją nukleozasady katalizowaną przeniesieniem protonu. Zdania na temat pochodzenia owego protonu są podzielone. Nordhoff uwaŜa, Ŝe rozerwanie wiązania N-glikozydowego odbywa się w wyniku przeniesienia protonu z sąsiedniej reszty fosforanowej [175]. Z kolei Zhu twierdzi, Ŝe proton przenoszony jest z cząsteczki matrycy [99]. Ta ostatnia hipoteza jest w zgodzie z obserwacjami dotyczącymi rozległości fragmentacji w zaleŜności od stosowanej matrycy, poniewaŜ cząsteczki matrycy wykazują róŜną kwasowość, a takŜe stabilnością tymidyny, która wykazuje wyjątkowo niską zasadowość, czy zwiększoną trwałością RNA w stosunku do DNA w warunkach MALDI [159]. Następnym etapem po eliminacji zasady jest rozerwanie wiązania 3’- a następnie 5’-fosfoestrowego i wytworzenie dwóch komplementarnych

SPEKTROMETRIA MAS MALDI-TOF

51 fragmentów. Zwykle sygnały pochodzące od obu jonów obserwowane są w widmie MALDI. Ogólny mechanizm fragmentacji przedstawiam na rysunku (Rys. 27).