STRES U ROŚLIN GÓRSKICH

W górach w miarę wzrostu wysokości n.p.m. ra­

dykalnemu pogorszeniu ulegają warunki wegetacji roślin. W wyniku naturalnej selekcji, w wysokich par­

tiach gór egzystują tylko gatunki najbardziej odporne.

Stąd, tak charakterystyczny dla górskich stoków, pię­

trowy układ roślinności. Pewne gatunki drzew w miarę wzrostu wysokości n.p.m. zanikają, a wiele ule­

ga przerzedzeniu z gęstego lasu, poprzez małe grupy, aż do pojedynczych osobników — w górnej granicy występowania (ryc. 1). Drzewami zasiedlającymi naj­

wyżej położone stanowiska n.p.m. (ang. timberline zone) w naszych warunkach klimatycznych są świerk Picea abies i kosówka Pinus mugo. Świerki tworzące las jeszcze na wysokości 1300 m n.p.m., na wyższych wysokościach spotykane są coraz rzadziej sięgając maksymalnie 1900 m n.p.m., gdzie można spotkać je­

dynie pojedyncze egzemplarze, a kosówka na tych wysokościach tworzy coraz to mniej rozległe płaty.

Na niesprzyjające warunki wegetacji na dużych wy­

sokościach n.p.m. składa się bardzo wiele czynników, w tym między innymi: silny wiatr, niska temperatura (podlegająca znacznym wahaniom dobowym i rocz­

nym), mała zasobność podłoża w materię organiczną i składniki nieorganiczne, ograniczony dostęp wody oraz silne napromieniowanie, któremu towarzyszy często generacja toksycznego ozonu troposferyczne- go. Ponadto, na terenach, gdzie masowo uprawiane jest narciarstwo i turystyka, należy wspomnieć jeszcze o stresie ciągłego przycinania i obłamywania

odro-stów, co prowadzi do wykształcania tzw. form „nar­

ciarskich" drzew (ryc. 2). W rejonach zurbanizowa­

nych oddziałują również szkodliwe czynniki antro- pogenne, takie jak zanieczyszczenia atmosferyczne i wibracje.

Wzrost intensywności napromieniowania wraz z wysokością n.p.m. wiąże się ze wzrostem udziału promieniowania UV. Krótkofalowa część widma sło­

necznego: UV-A (315-400 nm) i UV-B (280-315 ran) jest szkodliwa dla organizmów żywych. U roślin wyższych szczególnie narażone na działanie promie­

niowania UV są liście. Efekty szkodliwego oddziały­

wania UV-B kumulują się w czasie ich wzrostu i roz­

woju, co prowadzi do szeregu zmian: na poziomie morfologicznym (jak np. redukcja biomasy, skrócenie długości szpilek i zmniejszenie ich liczby w krótko- pędzie, uszkodzenia w budowie kutikuli, zmiana licz­

by aparatów szparkowych), fizjologicznym (zmiany w zawartości wosków epidermalnych, zawartości barwników chlorofilowych, karotenoidów i flawonoi- dów, oraz funkcjonalne modyfikacje aparatu foto- syntetycznego), a także biochemicznym (zaburzenie syntezy i aktywności wielu enzymów) i genetycznym (uszkodzenia struktury i funkqonowania kwasów nukleinowych).

Pod wpływem zbyt intensywnego promieniowania (w tym szczególnie w zakresie UV) maleje wydajność

(b) na północno-zachodnim stoku Kasprowego W ierchu (Tatry)

Ryc. 2. „N arciarska" forma św ierka Picea abies rosnąca w górnej strefie lasu, na stoku K asprow ego W ierchu (fot. P. Skaw iński)

fotosyntezy. Zahamowanie procesu fotosyntezy w re­

akcji na stres wynika w pierwszej kolejności z usz­

kodzenia fotoukładów (PSI i PSU), odpowiedzialnych za „przechwytywanie" energii świetlnej. PS II to ze­

spół cząsteczek białka, lipidów i barwników biorą­

cych udział w absorbowaniu kwantów światła. Zja­

wisko zmniejszenia aktywności PSII wywołane zaab­

sorbowaniem przez aparat fotosyntetyczny nadmier­

nej porcji energii wzbudzenia nosi nazwę fotoinhibi- cji. Funkcjonowanie PSII zależy między innymi od syntezy jednego z białek, które wchodzi w skład cen­

trum reakcji tego układu, tzw. białka D l. Białko to jest wrażliwe na promieniowanie w zakresie 315-580 nm i pod jego wpływem ulega szybkiej degradacji.

Światło jest równocześnie potrzebne do procesu od­

nowy tego białka. Wzmożona degradacja i resynteza (ang. tumover) białka D l wiąże się z silnym wzbu­

dzeniem donorów i akceptorów elektronów wcho­

dzących w skład PS U. Procesy degradacji i resyntezy białka D l umożliwiają utrzymanie aktywności PS II na optymalnym poziomie w panujących warunkach świetlnych, tak, aby ilość „przechwytywanej" przez fotoukład energii świetlnej była możliwa do związa­

nia w postaci wysokoenergetycznych wiązań chemi­

cznych i cukrów. Promieniowanie UV-B powoduje uszkodzenia szeregu struktur komórkowych takich jak białka enzymatyczne, membrany białkowo-lipido- we, cytoszkielet lub kwasy nukleinowe. Obniża rów­

nież poziom transkrypcji szeregu białek, m.in. tych budujących kompleksy fotosyntetyczne PS I i PS II.

Zaobserwowano między innymi oddziaływanie UV- B na poziom mRNA dla białka D l, kodowanego przez gen psbA zlokalizowany w chloroplastach. Ob­

niżenie poziomu transkrypcji wyżej wymienionych białek znajduje odzwierciedlenie w spadku aktywno­

ści

psn.

Ponadto promieniowanie UV hamuje aktywność deepoksydazy wiolaksantyny, enzymu warunkujące­

go chloroplastowy cykl ksantofilowy (ryc. 3), pełniący funkcję ochronną przed nadmiernym wzbudzeniem fotoukładów. Deepoksydaza wiolaksantynowa, zlo­

kalizowana po wewnętrznej stronie błony tylakoidu,

ę

^{AsA )} E n z y m I^pH~5 w iolaksantynow a; enzym II - epoksydaza w iolaksantynow a

katalizuje reakcję przemiany wiolaksantyny w ze­

aksantynę (maksimum aktywności wykazuje przy pH=5). Reakcję odwrotną, przemiany zeaksantyny w wiolaksantynę, przeprowadza epoksydaza wiola­

ksantynowa, zlokalizowana po zewnętrznej stronie błony tylakoidu. Do reakcji katalizowanej przez epo- ksydazę konieczne są produkty fotosyntezy: tlen i NADPH. Fizjologiczne znaczenie cyklu ksantofilowe­

go polega na ochronie aparatu fotosyntetycznego przed nadmiarem światła. Rośliny przetrzymywane w ciemności lub w słabym świetle zawierają stosun­

kowo wysoki poziom wiolaksantyny. W tych warun­

kach wiolaksantyna pełni funkcję anteny i przekazuje energię wzbudzenia na chlorofil a. Po oświetleniu ro­

ślin bardzo silnym światłem, na skutek intensywnie przebiegających procesów fazy świetlnej fotosyntezy, dochodzi do obniżenia pH wewnątrz tylakoidu. Ni­

skie pH oraz obecność zredukowanego askorbinianu aktywują deepoksydazę wiolaksantyny i przyspiesza­

ją przemianę wiolaksantyny w zeaksantynę. Reakcja ta osiąga największą szybkość, gdy natężenie światła przekracza poziom wysycający fotosyntezę. Powsta­

jąca zeaksantyna przejmuje nadmiar zaabsorbowanej energii wzbudzenia i powoduje jej rozproszenie w postaci ciepła. Przejmowanie części energii wzbudze­

nia przez zeaksantynę zapobiega powstawaniu sta­

nów trypletowych chlorofilu oraz tworzeniu aktyw­

nych form tlenu. Ważną rolę ochronną w tym pro­

cesie spełnia kwas aksorbinowy (witamina C) oraz glutation (GSH). Ponadto te drobnocząsteczkowe antyutleniacze, dzięki silnym właściwościom redu­

kcyjnym, zabezpieczają komórkę przed utlenianiem ważnych fizjologicznie związków, wrażliwych na procesy fotooksydacyjne. Promieniowanie UV powo­

duje inhibicję deepoksydazy wiolaksantynowej i w konsekwenq'i przyspiesza generację szkodliwych aktywnych form tlenu, takich jak: anionorodnik ponadtlenkowy (O2"), rodnik hydroksylowy (_*OH), nadtlenek wodoru (H2O2) i tzw. tlen singletowy CO2).

Aktywne formy tlenu (ang. active oxygen species, AOS) powstają w różnych przedziałach komórko­

wych, jako produkt uboczny reakcji związanych z transportem elektronów (tzw. „przeciek elektronów na tlen"). Są one znacznie bar­

dziej aktywne niż dwuatomowa cząsteczka tlenu w stanie podstawowym i łatwo wchodzą w reakcje, praktycznie ze wszys­

tkimi substancjami występującymi w ko­

mórce. Wzrost poziomu aktywnych form tlenu w komórkach określany jest termi­

nem stresu oksydacyjnego. Jeżeli funkcjo­

nujące w komórce mechanizmy ochronne nie są w stanie zapobiec toksycznemu dzia­

łaniu AOS, to dochodzi do zaburzeń stru­

kturalnych i funkcjonalnych, a w konse­

kwencji do śmierci komórki.

Szczególnie niekorzystne dla roślin jest oddziaływanie intensywnego światła w połączeniu z niską temperaturą. Promie­

niowanie o dużej intensywności, docierają­

ce do powierzchni liścia, powoduje nad­

mierne wzbudzenie anten fotosyntetycz- nych (czyli kompleksów barwnikowo-biał- kowych służących jako anteny

energetycz-OD JESIENI DO ZIMY. Fotografie Waldemara Frąckiewicza (Lublin)

OSTY O ZACHODZIE

http://sokrates.um cs.lublin.pl/fraw e7index.htm

N A Ś N IE G U

Wszechświat, 1.100, nr 10-12/1999

239

02 i H ' ;

Ryc. 4. Schem at fotosyntetycznego transportu elektronów z uwzględnieniem

° r

m iejsca generacji anionorodnika ponad tlenkow ego (O2 "). Skróty: PS I - fotou- kład I; fotoukład II

ne dla PSI i PSII. Przy normalnym przebiegu foto­

syntezy większość pochłoniętej energii zostaje wyko­

rzystana do redukcji NADP+ (faza świetlna fotosyn­

tezy), który następnie zużywany jest w procesie enzy­

matycznego wiązania CO2 (faza ciemna). W niskiej temperaturze aktywność enzymów jest znacznie ob­

niżona, i dlatego możliwość wykorzystania zaabsor­

bowanej energii świetlnej w fazie ciemnej jest silnie ograniczona. W takich warunkach zaabsorbowana energia wzbudzenia PS I i PS II znajduje swe „ujście"

w przekazywaniu elektronów na tlen, czyli do pro­

dukcji AOS (ryc. 4).

Powstające w komórce, a wysoce szkodliwe, aktyw­

ne formy tlenu są detoksyfikowane przez pulę współ­

działających ze sobą „zmiataczy": enzymatycznych (dysmutaza anionorodnika ponadtlenkowego, katala- za, peroksydazy) i nieenzymatycznych (askorbinian, glutation, tokoferol, karotenoidy, polifenole, flawonoi- dy). Wśród zmiataczy enzymatycznych istotną rolę przypisuje się dysmutazie anionorodnika ponadtlenko­

wego (ang. superoxide dismutase; SOD) — enzymowi rozkładającemu anionorodnik ponadtlenkowy (O2'-).

Podwyższona aktywność tego enzymu jest wskaźnikiem intensywnej generacji AOS. W ekstra­

ktach z tkanki liściowej można w łatwy sposób stwier­

dzić i unaocznić obecność SOD stosując test barwienia natywnego białek po elektroforezie na żelu poliakryla- midowym (ang. poliacrylamide gel elektroforesis; PA- GE). Miejsce na żelu, w którym w procesie elektrofo­

rezy zgromadziły się czynne cząsteczki enzymu zapo­

biegające powstawaniu barwnika, ujawnia się w po­

staci rozjaśnienia (ryc. 5). Poziom SOD jest dość stabil­

ny tzn. zmiana poziomu enzymu nie następuje bardzo gwałtownie ani w obrębie rośliny, ani w czasie prepa­

ratyki. Analizy SOD są w miarę proste w stosowaniu i dostępne nawet dla przeciętnie wyposażonych labo­

ratoriów. Stosując taki test z zastosowaniem roślin po­

chodzących z różnych wysokości (ryc. 5), możemy stwierdzić, że zależnie od wysokości n.p.m., z jakiej po­

brano próbkę, zmienia się stan „zestresowania" komó­

rek, a rośliny rosnące na dużych wysokościach egzy­

stują w stanie podwyższonego stresu oksydacyjnego.

Wykonując dodatkowe analizy, możemy się także do­

wiedzieć w jakich kompartmentach komórkowych (chloroplasty, mitochondria, jądro komórkowe) docho­

dzi do wzmożonego stresu.

Innym ważnym enzymem pełniącym rolę anty- oksydacyjną jest katalaza. Enzym ten katalizuje re­

akcję rozkładu H2O2. Katalaza, podobnie jak białko D l, jest wrażliwa na światło i jej aktywność jest ściśle zależna od ciągłej syn­

tezy de novo. W warunkach silnego światła procesy degradacji przeważają nad synte­

zą, co znajduje odzwierciedlenie w spadku aktywności tego enzymu. U niektórych ga­

tunków roślin rosnących na dużych wyso­

kościach stwierdzono ekstremalnie wysoką (wynikającą ze specyficznej struktury) od­

porność katalazy na stres nadmiernego promieniowania (w tym również w zakre­

sie UV), zapobiegającą degradacji tego ważnego enzymu.

Zdolność usuwania aktywnych form tlenu opisanych powyżej klasyfikuje się jako me­

chanizm tolerancji na stres (ang. stress tolerance). Ro­

śliny wykształciły także szereg strategii obronnych przeciwko stresowi oksydacyjnemu polegających na

„unikaniu stresu" (ang. stress avoidance). Polegają one na niedopuszczaniu do powstania stanu stresu. Dlate­

go np. rośliny górskie, w porównaniu do roślin rosną­

cych na niższych wysokościach, wykształcają zwykle grubszą epidemię oraz pokrywającą ją grubszą war­

stwę wosku, co znacznie ogranicza ilość promieniowa­

nia docierającego do wnętrza liścia. Dodatkowo, w ko­

mórkach epidermy i zewnętrznej części mezofilu mogą występować tzw. barwniki ekranujące (ang. screening pigments) chroniące liść przed szkodliwym promienio­

waniem UV. Do barwników tych zaliczane są flawony, flawonoidy, izoflawony i antocjany. Zawierają one li­

czne grupy hydroksylowe, dzięki czemu selektywnie pochłaniają promieniowanie UV-A i UV-B (tzw. „efekt filtrowania") ograniczając jego ilość nawet do 99%! Po­

ziom tych barwników zwykle wzrasta u roślin wraz z wysokością n.p.m. Za syntezę barwników ekranują­

cych, w komórkach odpowiedzialnych jest kilka enzy­

mów, w tym m.in.: amoniakoliaza fenyloalaninowa oraz synteza chalkonowa, a kodujące je geny uaktyw­

niane są między innymi światłem UV.

Grubsza epiderma i obecność barwników ekranu­

jących zwykle jednak nie stanowi całkowitego

zabez-R yc. 5. Izoform y SO D w ekstraktach ze szpilek świerka Picea abies i kosów ki Pinus mugo

240

0,6

0,4

I św ierk ■ kosów ka

11

_{1420 1460}

iii

_{1570 1870 1920}

w y sok o ść n.p.m . [m]

R yc. 6. Stosunek Fv/Fm (stosu nek fluorescencji zm iennej do m aksym alnej), w skazujący na poziom fotoinhibicji, w szpilkach św ierka i kosów ki rosnących na różnych w ysokościach n.p.m .

pieczenia roślin przed stresem nadmiernego wzbu­

dzenia anten fotosyntetycznych. Dlatego modyfikacji podlega także liczba i wielkość antert oraz ich stru­

ktura i konformacja. Szczególnie cenną dla roślin jest zdolność do bezpośredniego rozpraszania nadmiaru zaabsorbowanej przez barwniki fotosyntetyczne ener­

gii na sposób termiczny lub promienisty (tzw. foto- luminescencja). Rolę tę spełniają, obecne w antenach fotosyntetycznych obok chlorofilu, karotenoidy. W warunkach wysokiego natężenia promieniowania ka­

rotenoidy mogą bezpośrednio reagować z AOS, chro­

niąc w ten sposób przed uszkodzeniami inne, wra­

żliwe na fotooksydację, związki (a zwłaszcza niena­

sycone kwasy tłuszczowe lipidów chloroplastowych).

Poziom stresu w roślinie m ożna określić, między innymi, za pomocą metod fluorescencyjnych bazują­

cych na pomiarze promieniowania wyemitowanego przez wzbudzone cząsteczki chlorofilu. Fluorescencja to jeden z rodzajów fotoluminescencji polegający na szybkim (10'9-10'8 s) wypromieniowaniu światła o nieco większej, w stosunku do zaabsorbowanej, dłu­

gości fali. Na podstawie intensywności i przebiegu krzywej fluorescencji chlorofilu można ocenić stopień

„zestresowania rośliny". Metody te są bardzo cenne, gdyż nie uszkadzają delikatnej struktury tkanek, a ten sam materiał roślinny może być wykorzystywany do pomiarów wielokrotnie (np. przed i po zadziałaniu czynnika stresowego). Najczęściej w tym celu okre­

ślanym parametrem jest stosunek fluorescencji zmien­

nej do maksymalnej (Fv/Fm), który odzwierciedla aktywność fotochemiczną fotoukładu II. Obniżenie wartości tego parametru wskazuje na fotoinhibicję PS II. Posługując się metodą pomiaru fluorescencji stwierdzono, że poziom fotoinhibicji rośnie wraz z wysokością n.p.m. Zarówno w szpilkach kosówki, jak i świerka, w miarę wzrostu wysokości aż do górnej granicy lasu, stosunek Fv/Fm spada (ryc. 6).. Przy czym u świerka (charakteryzującego się niższą gra­

nicą występowania) spadek tego parametru wraz z wysokością n.p.m. jest większy niż u kosówki. Wy­

kazano również, że w szpilkach kosówki i świerka, znajdujących się zimą na gałę­

ziach pokrytych śniegiem, poziom stresu jest niższy w porównaniu do tych, pozo­

stających nad powierzchnią śniegu, i nara­

żonych na równoczesne oddziaływanie światła i niskiej temperatury.

W odporności roślin na stres ważną rolę odgrywają także takie procesy, które wa­

runkują naprawę już powstałych uszko­

dzeń. A w tym przypadku światło odgry­

wać może rolę pozytywną, uruchomiając niektóre komórkowe mechanizmy napra­

wcze. Światło aktywuje wiele enzymów poprzez stan redox grup SH. Do takich en­

zymów należy fotoliaza — enzym odpo­

wiedzialny za usuwanie toksycznych fotoproduktów.

Światło może także przyspieszać syntezę wielu białek enzymatycznych (np. tych syntetyzujących barwniki ekranujące), lub innych ważnych funkcjonalnie białek (np. białka D l). U roślin górskich, które są często pod­

dane oddziaływaniu promieniowania słonecznego o wyższym natężeniu, niż te rosnące na niższych wy­

sokościach n.p.m., szkody spowodowane ultrafiole­

tem mogą być łatwiej „naprawiane". Regulacja świat­

łem gwarantuje, że funkcjonowanie mechanizmów naprawczych jest zapewnione wtedy, kiedy są najbar­

dziej potrzebne.

Rośliny górskie wykształciły zatem, bądź znacznie usprawniły, cały szereg mechanizmów warunkują­

cych im wegetację w niekorzystnych warunkach śro­

dowiskowych. Stwierdzono, że większa odporność roślin górskich na wzrost szkodliwego promieniowa­

nia UV-B jest cechą utrwaloną genetycznie. Okazuje się, że np. świerki wyhodowane z nasion ze stano­

wisk z większej wysokości n.p.m. są bardziej toleran­

cyjne na wyższe natężenie promieniowania UV niż rośliny wegetujące na niższych wysokościach n.p.m.

Piętrowemu układowi roślinności w górach towarzy­

szy zatem także, nasilający się wraz z wysokością n.p.m., system roślinnych mechanizmów odporno­

ściowych. Obserwacje te stanowią cenny przyczynek do badań ekofizjologicznych, łączących wiedzę o strukturze i funkcjonowaniu organizmów żywych z tą, zajmującą się relacjami organizm — środowisko.

A także do tych zajmujących się badaniami odporno­

ści organizmu na poziomie genetycznym, co jest przedmiotem nowej dyscypliny wiedzy — genomiki.

Autorzy są wdzięczni Dyrekcji Tatrzańskiego Parku Narodowego za umożliwienie przeprowadzenia ba­

dań na terenie Kasprowego Wierchu.

Wptyneło 18 X 1999

Dr Ew a Niewiadomska i m gr Ewa Kępa pracują w Zakładzie Fi­

zjologii Roślin im. Franciszka Górskiego PAN w Krakowie D r Paw eł Skaw iński pracuje w Tatrzańskim Parku Narodowym w Zakopanem

Wszechświat, 1.100, nr 10-12/1999

241

JER ZY VETU LA N I (Kraków)

BADANIA N A ZW IERZĘTACH — NADZIEJA TERAPII CHORÓB OŚRODKOWEGO

W dokumencie PISMO PRZYRODNICZE (Stron 33-41)