Nośniki leków mogą przyczyniać się do poprawy skuteczności terapii poprzez akumulację substancji leczniczej, przedłużenie jej działania, wydłużenie okresu półtrwania substancji terapeutycznych, poprawę ich biodostępności oraz zmniejszenie toksyczności. Nośnik leku powinien charakteryzować się nanometrycznym rozmiarem, zdolnością wiązania i uwalniania leku, być bezpieczny dla organizmu oraz ulegać degradacji i eliminacji po spełnieniu swojej funkcji. Dodatkowo, materiał stosowany do wytwarzania nośników leku powinien być wystarczająco wytrzymały i stabilny, aby nie ulec degradacji w drodze do miejsca przeznaczenia. Wytwarzanie nośników leku z materiałów nieorganicznych oraz syntetycznych polimerów stwarza ryzyko toksyczności nośnika wobec tkanek organizmu, natomiast zastosowanie naturalnych biopolimerów może wiązać się ze zmiennymi właściwościami nośników. Jedwab pajęczy to biomateriał o dobrych właściwości mechanicznych, takich jak wiązkość, elastyczność i wytrzymałość mechaniczna. Jako białkowy biopolimer jest on biokompatybilny i biodegradowalny. Pomimo, iż trudno jest pozyskać naturalny jedwab pajęczy w czystej postaci i w wystarczających ilościach, rozwój technik produkcji bioinżynierowanego jedwabiu pajęczego i metod jego oczyszczania skutecznie rozwiązał problem jego dostępności i utorował drogę do dalszych badań nad wykorzystaniem tego białka do wytwarzania nośników leku.
Białka jedwabiu pajęczego mają zdolność do samoorganizacji w sferyczne cząstki, które mogą być stosowane jako nośniki do dostarczania leków. Metody inżynierii genetycznej zapewniają precyzyjną kontrolę nad sekwencją aminokwasową tych białek, przez co, na poziomie molekularnym, zapewniają wpływ na właściwości biomateriału takie jak ładunek, hydrofobowość oraz struktura drugorzędowa. Co więcej, właściwości jedwabnych nośników leku mogą być kontrolowane także na etapie oczyszczania białek, tworzenia sfer i ładowania leków.
Celem niniejszej pracy było opracowanie innowacyjnych nośników opartych na bioinżynierowanych białkach jedwabiu pajęczego. Badano właściwości nośników (sfer) w zależności od zastosowanego protokołu oczyszczania białka, sekwencji białka, warunków wytwarzania sfer i sposobu ładowania leku. Badania obejmowały także optymalizację warunków wytwarzania nośnika, automatyzację procesu produkcji sfer oraz analizę biokompatybilności i immunogenności nośników z bioinżynierowanych jedwabi pajęczych.
130
W pierwszym etapie realizacji projektu doktorskiego sklonowano sztuczny gen dla nowego bioinżynierowanego białka pajęczego – MS2(9x). Białko to wyprodukowano w systemie ekspresyjnym E. coli i oczyszczono za pomocą dwóch metod: denaturacji termicznej i ekstrakcji kwasowej. Metody te bazowały na naturalnych właściwościach jedwabiu: stabilności termicznej oraz odporności na działanie kwasu propionowego. Za pomocą obu metod uzyskano podobną wydajność oraz jakość oczyszczanego bioinżynierowanego białka jedwabiu pajęczego. Obserwowano różnice w strukturze drugorzędowej oraz potencjale dzeta białek rozpuszczalnych. Z białka MS2(9x) oczyszczanego obiema metodami wytworzono sfery poprzez wysalanie fosforanem potasu. Sfery otrzymane z białka oczyszczanego metodą denaturacji termicznej oraz ekstrakcji kwasowej posiadały różne właściwości takie jak: wielkość, morfologia, potencjał elektrokinetyczny i zdolność wiązania leku. Przyczyną zaobserwowanych różnic mogła być odmienna konformacja przestrzenna białek oczyszczanych za pomocą obu metod oraz jej wpływ na proces samoskładania białek jedwabiu. Dlatego też, dobór właściwej metody oczyszczania białka ma znaczenie w rozwoju systemu dostarczania leków bazującego na bioinżynierowanym jedwabiu pajęczym.
W kolejnym etapie badano wpływ sekwencji białka na właściwości nośnika leku. Analizowano dwa bioinżynierowane białka jedwabiu pajęczego: MS1 i MS2, których sekwencje oparto na sekwencjach białek pająka N. clavipes: odpowiednio MaSp1 i MaSp2. Białka te wyprodukowano w systemie ekspresyjnym E. coli i oczyszczono metodą ekstrakcji termicznej. Z obu białek wytworzono sfery poprzez wysalanie fosforanem potasu. Białka MS1 i MS2, różniące się sekwencją aminokwasową, tworzyły sfery o innej morfologii i wielkości. Wykazywały także różne właściwości fizyczne: potencjał dzeta i zawartość struktur drugorzędowych. Wielkość sfer formowanych z białek MS1 i MS2 mogła być kontrolowana za pomocą stężenia białek jedwabiu. Stężenie fosforanu potasu wpływało na proces tworzenia się sfer. Białko MS2 formowało sfery przy niższym stężeniu fosforanu potasu niż białko MS1. Sfery MS1 wykazały większą, niż sfery MS2, wydajność inkorporacji leków przeciwnowotworowych oraz wolniejsze tempo ich uwalniania. Wykazano, iż zdolność inkorporacji i kinetyka uwalniania leku zależy także od sposobu inkorporacji leku. Sfery z bioinżynierowanych jedwabi pajęczych ładowane doksorubicyną za pomocą dyfuzji oraz koprecypitacji powoli uwalniały lek przez 14 dni w sposób powolny zależny od pH. Oba typy nośników utrzymywały swoją sferyczną morfologię po 14 dniach uwalniania leku, in vitro. Sfery MS1 wykazały większe powinowactwo do leków przeciwnowotworowych, miały jednakże skłonność do agregacji i były większe niż cząstki MS2, które z kolei charakteryzowały się lepszą morfologią ale szybciej uwalniały badane
131
chemioterapeutyki. Aby połączyć korzystne cechy obu białek, w dalszych badaniach można zastosować sfery wykonane z mieszanki białek MS1 i MS2.
W kolejnym etapie badań opracowano automatyczną metodę wytwarzania sfer przy użyciu wysokociśnieniowych pomp strzykawkowych. Zastosowanie metody mikromieszania za pomocą pomp przyczyniło się do uzyskania znacznych ilości sfer z bioinżynierowanego jedwabiu w powtarzalnych warunkach wytwarzania. Produkcja sfer za pomocą mikromieszania powodowała zmniejszenie się wielkości oraz zakresu wielkości otrzymanych sfer, w porównaniu do mieszania za pomocą pipety. Optymalizacja procesu poprzez zastosowanie mniejszej średnicy trójnika oraz wężyków systemu pomp, a także zwiększenie szybkości przepływu powodowało dalsze zmniejszenie rozmiaru sfer i uzyskanie węższego rozrzutu ich wielkości. Wytwarzanie sfer przy użyciu pomp strzykawkowych skutkowało otrzymaniem dużych objętości zawiesiny sfer w fosforanie potasu. Badane techniki ultrafiltracji pozwoliły na szybkie i skuteczne odzyskiwanie sfer z roztworu fosforanu potasu. System mikromieszania oraz ultrafiltracji umożliwił otrzymywanie dużych ilości jedwabnych sfer w powtarzalnych i kontrolowanych warunkach. Ponadto przeprowadzono testy alternatywnej metody wytwarzania sfer – desolwatacji za pomocą acetonu, która skutkowała formowaniem się małych i jednorodnych sfer o średniej wielkości 200 i 300 nm odpowiednio dla białek MS1 i MS2.
Niezależnie od metody oczyszczania, sekwencji białka jedwabiu oraz metody wytwarzania sfer, żaden z wariantów sfer z bioinżynierowanych jedwabi pajęczych nie wykazywał właściwości cytotoksycznych. Badania immunogenności wykazały większą immunogenność sfer MS, w porównaniu do MS2 w stężeniu powyżej 12,5 µg/ml. Badania te potwierdziły, iż sfery z bioinżynierowanego jedwabiu pajęczego mogą być z powodzeniem stosowane do zastosowań biomedycznych.
Podsumowując, bioinżynierowany jedwab łączy w sobie cechy materiałów syntetycznych: precyzyjną kontrolę i powtarzalność produkcji oraz możliwość funkcjonalizacji z biokompatybilnością i biodegradowalnością naturalnych biomateriałów. Z białka tego uzyskać można nośniki leków, których właściwości mogą podlegać precyzyjnej kontroli, na wielu etapach procesu wytwarzania. Istnieje również możliwość automatyzacji i zwiększenia skali produkcji jedwabnych nośników. Cechy te, w połączeniu z powinowactwem do leków przeciwnowotworowych wskazują na duży potencjał sfer z bioinżynierowanego jedwabiu pajęczego jako nośnika leków, w tym chemioterapeutyków.
132