α1-Mikroglobulina (α1M), to niewielka glikoproteina z rodziny lipokalin, białek o strukturze antyrównoległej baryłki β z hydrofobowym wnętrzem, stanowiącym kieszeń wiążącą drobnocząsteczkowe ligandy. α1M posiada żółtobrązowe zabarwienie i jest heterogeniczna pod względem ładunku. Obydwie cechy wynikają z obecności niezidentyfikowanej substancji chromoforowej, która w ludzkiej α1M związana jest prawdopodobnie z jedyną wolną resztą cysteinową (Cys 34) oraz z trzema resztami lizynowymi (Lys 92, Lys 118 i Lys 130). Zgodnie z modelem strukturalnym wszystkie wspomniane reszty aminokwasowe leżą w pobliżu wejścia do kieszeni lipokalinowej. W moczu ludzkim wykryto dwie formy α1M; jedna ma pełną długość, a druga jest skrócona o C-końcowy tetrapeptyd Leu-Ile-Pro-Arg (LIPR). Funkcja biologiczna α1M nie została jak dotąd poznana, jednak ostatnie doniesienia wskazują coraz mocniej na jej rolę w ochronie antyoksydacyjnej organizmu. α1M wiąże hem oraz hemoglobinę, a forma pozbawiona tetrapeptydu LIPR degraduje hem z wytworzeniem charakterystycznego chromoforu.
Komórki wątrobiaka poddane działaniu oksy-, czy też methemoglobiny, hemu lub utworzonych w wyniku reakcji Fentona rodników hydroksylowych prowadzą wzmożoną syntezę kodującego α1M RNA i samego białka, a także zwiększają jego wydzielanie.
Stwierdzono także ochronną rolę α1M względem ludzkich komórek erytroidalnych poddanych działaniu oksydantów, takich jak hem, hemoglobina, czy rodniki hydroksylowe.
W niniejszej pracy badano rekombinowane warianty ludzkiej α1M, w tym typ dziki (wt), formę pozbawioną tetrapeptydu LIPR (wt∆LIPR) oraz muteiny, w których wspomniane wyżej reszty: cysteinową oraz lizynowe zastąpiono, odpowiednio, resztami:
serynową i treoninowymi. Pomiary widm dichroizmu kołowego potwierdziły prawidłową strukturę drugorzędową wszystkich badanych białek, charakteryzującą się zdecydowaną przewagą formy β−harmonijki. Widma absorpcyjne i fluorescencyjne wskazują na znacznie mniejszą zawartość charakterystycznego dla α1M chromoforu w białkach rekombinowanych, w porównaniu z odpowiednikami z osocza krwi i moczu ludzkiego.
Metodą ogniskowania izoelektrycznego stwierdzono również znacznie większą jednorodność badanych białek pod względem ładunku. Różnice w widmach absorpcyjnych poszczególnych form rekombinowanych α1M wskazują na to, że wszystkie spośród poddanych mutacjom reszty aminokwasowe są istotne dla procesu tworzenia chromoforu.
Brak charakterystycznych pasm absorpcji i fluorescencji w widmach mutein z podstawieniem reszty Cys 34 sugeruje, że jest ona kluczowa dla etapu wiązania liganda.
Muteina pozbawiona reszty Cys 34 wykazuje niewielką tendencję do tworzenia oligomerów, znacznie mniejszą w porównaniu z pozostałymi rekombinowanymi formami α1M oraz białkami pozyskanymi z ludzkich płynów ustrojowych. W pomiarach zaniku anizotropii fluorescencji wykorzystano formy wt oraz wt∆LIPR wyznakowane znacznikiem 1,5-I-AEDANS. Uzyskane wartości czasów rotacyjnej korelacji, około 14 ns, są zbliżone do wartości teoretycznej, obliczonej dla wspomnianego modelu α1M. Przy założeniu sferyczności obiektu rotującego dane eksperymentalne odpowiadają cząsteczce o promieniu hydrodynamicznym około 2,4 nm. Położenie maksimum fluorescencji znacznika związanego z resztą Cys 34 obydwu białek przy długości fali około 460 nm świadczy o jego hydrofobowym otoczeniu, co może wskazywać na ulokowanie fluoroforu wewnątrz kieszeni wiążącej α1M. Pozwala to wnioskować o rzeczywistym umiejscowieniu wyznakowanej reszty w pobliżu wejścia do kieszeni wiążącej, jak sugeruje opublikowany model strukturalny białka.
Główną część pracy stanowi badanie oddziaływania rekombinowanych form α1M z potencjalnymi fizjologicznymi ligandami – hemem oraz protoporfiryną IX (PPIX).
Pomiary spektrofluorymetryczne wskazują na przyłączanie dwóch cząsteczek hemu lub PPIX przez α1M. Wartości obserwowanych stałych dysocjacji wyznaczone na podstawie tych badań wynoszą około 6·10-8 M dla kompleksów hemu lub PPIX z białkiem typu dzikiego. Muteina pozbawiona reszty Cys 34 wykazuje nieco większe powinowactwo do badanych ligandów, podczas gdy podstawienie trzech reszt lizynowych powoduje niewielkie osłabienie wiązania, w szczególności w przypadku PPIX. Dane te wskazują na silne i specyficzne oddziaływanie obydwu ligandów z α1M. Zbliżone parametry wiązania hemu i PPIX pozwalają przypuszczać, że jon żelaza nie jest zaangażowany w oddziaływania białko-ligand w badanym układzie. Widma absorpcyjne i fluorescencyjne, jak również czasy życia fluorescencji PPIX związanej z poszczególnymi wariantami α1M, wykazują cechy charakterystyczne dla formy monomerycznej tej porfiryny. Położenie pasma Soreta przy długości fali poniżej 400 nm wskazuje na obecność oddziaływań polarnych obydwu badanych ligandów z resztami aminokwasowymi znajdującymi się w pobliżu miejsca wiążącego.
Pomiary kinetyczne wykazały, że proces wiązania ligandów zachodzi w co najmniej dwóch etapach. Zależność wartości wyższej obserwowanej stałej szybkości reakcji (k1obs)
od stężenia hemu ma charakter malejący, co sugeruje, że obrazuje ona zmianę konformacyjną niewiążącej formy α1M w formę zdolną do przyłączenia hemu. Parametr k2obs, przyjmujący wartości o rząd wielkości mniejsze od poprzedniego, opisuje prawdopodobnie proces następujący po związaniu kolejnej cząsteczki liganda. Zależność stężeniowa tej stałej dla białka typu dzikiego ma charakter lekko rosnący. W pomiarach rozdzielczej w czasie anizotropii fluorescencji, prowadzonych dla wyznakowanych białek w obecności hemu, zaobserwowano pojawienie się krótszego czasu rotacyjnej korelacji, około 0,5 ns. Parametr ten przyporządkowano rotacji znacznika AEDANS lub też fragmentu łańcucha białkowego w bezpośrednim jego otoczeniu. Przy nadmiarze liganda obserwuje się również przesunięcie maksimum emisji znacznika w kierunku dłuższych fal, co może być efektem wypierania znacznika ulokowanego w kieszeni wiążącej białka przez hem. W przypadku obydwu badanych białek wartość dłuższej składowej czasu rotacyjnej korelacji ulega podwojeniu przy przejściu od formy nieskompleksowanej do w pełni wysyconej ligandem, co wskazuje na proces dimeryzacji lub dalszej oligomeryzacji α1M.
W analogicznych pomiarach, lecz z wykorzystaniem fluorescencji liganda, wykonanych dla wszystkich rekombinowanych form α1M w obecności ilości PPIX prawie równomolowej w stosunku do białka, uzyskano jeden czas rotacyjnej korelacji odpowiadający rotacji całej cząsteczki. Jego wartość dla form wt i wt∆LIPR jest zgodna z uzyskanymi wcześniej wynikami eksperymentu wykonanego na białkach znakowanych. W przypadku mutein pozbawionych reszty Cys 34 uzyskano nieco wyższą wartość tego parametru, około 17 ns. Sugeruje to, że wspomniana reszta stabilizuje bardziej zwartą konformację białka.
Badania, przedstawione w rozprawie poszerzają wiedzę na temat właściwości strukturalnych α1M w roztworze, natury jej unikalnego chromoforu oraz mechanizmu oddziaływania białka z hemem, protoporfiryną IX i hemoglobiną.