Struktura miRNA determinuje ich właściwości i funkcje 1. Trwałość miRNA w lizatach z GBM

Trwałość miR-21, miR-93 oraz miR-296 w lizatach z guzów glejowych mózgu różni się między sobą. Okresy półtrwania w lizatach GBM poszczególnych miRNA przedstawiono w tabeli na Rysunek 3.1. Jest on ponad 200x i 80x dłuższy dla miR-296 niż odpowiednio dla miR-21 oraz miR-93. Dla badanych miRNA koreluje on z energią struktury spinki do włosów przyjmowanej przez dany miRNA.

A B

C miR-21 miR-93 miR-296

Energia spinki do włosów [kcal/mol] ^{-1.98 -3.9 -4.14} Okres półtrwania miRNA w lizacie z GBM [min] 7.91 22.19 1708 Rysunek 3.1

Stabilność miR-21, miR-93 oraz miR-296 w lizatach z GBM.

A, B. Autoradiogram 20 % żelu poliakrylamidowego obrazujący stopień hydrolizy miR-21, miR-93 and

miR-296 w lizacie z GBM (stężenie białek 0.01 mg/ml) w czasie.

C. Okresy półtrwania oraz energie struktur miR-21, miR-93 oraz miR-296.

3.2. Podobieństwo struktur miRNA oraz aptamerów RNA.

Wyniki otrzymane z użyciem algorytmu RNAforester wskazują na duże podobieństwo strukturalne miR-21, miR-93, miR-296 oraz aptameru TN-9.6 skierowanego przeciwko białku tenascyna C (Rysunek 3.2). Przykład ten oraz inne przytoczone wcześniej pokazujące podobieństwo struktury wybranych miRNA oraz tRNA, minihelis RNA i 5S RNA sugerują, że miRNA mogą funkcjonować poza kompleksem RISC, a ich struktura może determinować ich funkcje. Postuluję, że podobnie jak aptamery RNA, miRNA mogą modulować aktywność białek.

Rysunek 3.2

Podobieństwo struktury miR-21, miR-93, miR-296 oraz aptameru anty-Tn-C, TN-9.6, wg RNAforester.

A. Klaster struktury miR-21, miR-93, miR-296 oraz TN-9.6. B. Porównanie sekwencji i struktury

aptamera TN-9.6, 21, 93 oraz 296. C. Schematy struktury drugorzędowej 21, miR-93, miR-296 oraz TN-9.6. Pozycje o identycznej strukturze dla wszystkich badanych RNA oznaczono na czarno.

3.3. Badanie oddziaływań białko-miRNA

miR-21, miR-93, miR-296, miR-10b oraz miR-15b tworzą kompleksy z białkami lizatów otrzymanych z tkanek guza oraz komórek T98G (Rysunek 3.3). Kompleksy tworzone przez poszczególne miRNA różną się między sobą. Dodatkowo obserwowano odmienne profile kompleksów na żelach retardacyjnych obrazujących reakcje z lizatem z GBM oraz T98G. Kompleksy powstają w pH 7.5 oraz 4.5. Dodatek Mg2+

(10 mM) oraz Tritonu X-100 promuje ich tworzenie.

A B

Rysunek 3.3

Autoradiogram 10 % żelu poliakrylamidowego obrazujący kompleksy miR-21, miR-93, miR-296, miR-10b oraz miR-15b z białkami lizatu GBM (A) oraz lizatu z T98G (B). K - kontrola reakcji, 1-3 – reakcje w buforze 1 (50 mM Hepes pH 7.0, 750 mM NaCl, 50 mM DTT, 50 mM EDTA, 5 % Triton X-100), 2 (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂), 3 (50 mM CH₃COONa pH 4.5, 28 mM NaCl, 4.5 mM ZnSO₄).

Do niedawna uważano, że miRNA występują w komórkach jedynie w kompleksie RISC. Otrzymane przeze mnie wyniki oraz wcześniejsze badania in silico pokazują, że miRNA mogą występować w komórce w postaci spinki do włosów i/lub dupleksu, co może przekładać się na ich właściwości, dostępność i funkcje. Pokazałam, że istnieje zależność między trwałością miRNA przyjmujących strukturę spinki do włosów, a energią tych spinek. Wcześniej pokazano, że trwałość poszczególnych miRNA jest różna. Średni okres półtrwania miRNA wynosi 119 h (~5 dni) [189, 218, 219], w skrajnych przypadkach mierzony jest w minutach, choć może dochodzić nawet do 225 h. Wcześniejsze badania wskazują, że miRNA mogą występować w komórce w formie niezwiązanej z białkami Ago [220, 221]. Wnioskuję zatem, że przyjęcie przez miRNA struktury, przykładowo spinki do włosów, w pewnym stopniu może chronić je przed działaniem nukleaz komórkowych, w efekcie odgrywać istotną rolę w regulacji poziomu miRNA w komórce. Pokazano, że efekt komórkowy wywierany przez miRNA w dużym stopniu zależy od stosunku stężeń miRNA oraz mRNA [214].

Regulacja ekspresji genów z udziałem miRNA zależy od termodynamiki oddziaływań mRNA-miRNA, ta z kolei od dostępności sekwencji docelowej i miRNA, struktury tych RNA oraz ich zaangażowania w oddziaływania z białkami, co pokazano na przykładzie mRNA i białek Dnd1 oraz Pumilio [162, 163]. Przyjęcie przez miRNA struktury spinki do włosów, motywu często zaangażowanego w oddziaływania z białkami oraz innymi RNA, ogranicza ich dostępność do oddziaływań z mRNA targetowym. Pokazano jednak, że nie wyklucza odziaływań miRNA z mRNA targetowym. Spinki miRNA, przykładowo miR-451 będącego produktem Drosha, nieulegającego obróbce z udziałem Dicer, ale są włączane bezpośrednio do kompleksu RISC [111].

Motyw spinki do włosów RNA znany jest jako miejsce kontaktu RNA z innymi kwasami nukleinowymi i białkami [4]. Pokazano podobieństwo struktury 21, miR-93, miR-296 oraz aptameru TN-9.6 skierowanego przeciwko białku tenascyna C. Sugeruje to, że spinki do włosów miRNA, podobnie jak aptamery RNA, mogą bezpośrednio, niezależnie od kompleksu RISC, oddziaływać z białkami i regulować w ten sposób ich aktywność.

Udowodniono, że wybrane miRNA, w tym miRNA przyjmujące strukturę spinki, mogą tworzyć kompleksy z białkami guza GBM oraz komórek T98G. Zauważono specyficzność oddziaływań miRNA-białko. Część białek tworzy kompleksy z

wszystkimi badanymi miRNA, inne tylko z wybranymi z nich. Innym dowodem na to, że miRNA mogą specyficznie oddziaływać bezpośrednio z białkami spoza kompleksu RISC są miRNA rodziny miR-1/miR-206 [59]. U pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym stwierdzono kompleksy TDP-43-miR-1 oraz TDP-43-miR-201 [59]. Postuluje się, że rozwój choroby jest efektem zahamowania aktywności miRNA, będącej z kolei skutkiem uwikłania miRNA w kompleks miRNA-TDP-43. Nie ma jednak przesłanek pozwalających jednoznacznie wykluczyć opcję, że choroba jest następstwem zahamowania aktywności białka TDP-43 przez miRNA. Kolejnym przykładem są miR-888 i miR-146a, które oddziałują z jedną z domen wirusowego białka Gag. Białko to jest ważnym elementem strukturalnym wirusa HIV-1, a jego związanie z wspomnianymi miRNA zaburza składanie cząstek wirusowych [56]. Znane są aptamery anty-Gag, które wywołują dokładnie taki sam efekt jak wspomniane miRNA [57, 58].

Przytoczone przykłady pokazują, że za sprawą struktury, miRNA mogą funkcjonować niezależnie od kompleksu RISC. Struktura miRNA wpływa na ich dostępność oraz aktywność, a zatem stanowi kolejny poziom regulacji epigenetycznej.

Ponadto, odkrycie to stawia miRNA jako nowe cele terapeutyczne w nowym świetle. Znane są w literaturze przykłady związków małocząsteczkowych oraz antysensowych RNA i DNA, które zmieniając strukturę RNA znoszą ich aktywność. Postuluję, że zmiany struktury dojrzałych miRNA mają odzwierciedlenie w ich funkcji, a zastosowanie czynników modulujących ich strukturę może stanowić nowe podejście zależnej od miRNA regulacji ekspresji genów.