W kolbie rozpuszczono 2-chloro-4,6-dimetoksy-1,3,5-triazynę (30 mg; 1,71 mmol; 1 eq) w 2 mL chlorku metylenu. Dodano 1 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 2 h (w przypadku użycia metyloaminy) lub przez 24 h w przypadku użycia pozostałych amin. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 5:2 (Hex:EtOAc 5:2). Po zakończeniu reakcji mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano
137 wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 5:2.
9.1.1 2,4-dimetoksy-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (138)
Użyto 21 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (1 eq) uzyskując 23 mg produktu (wydajność 78%). Rf(Hex:EtOAc(5:2))=0,32 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,76 (q, J=4,8 Hz, 1H, NH); 3,83 (s, 3H, CH3O); 3,80 (s, 3H, CH3O); 2,78 (d, J=4,8 Hz, 3H, CH3N). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 172,44; 171,88; 168,46; 54,42; 27,67. MS (ESI, pos.) m/z 171 [M+H]+.
9.1.2 6-benzyloamino-2,4-dimetoksy-1,3,5-triazyna (139)
Użyto 19 µL benzyloaminy (1 eq) uzyskując 39 mg produktu (wydajność 92%).
Rf(Hex:EtOAc(5:2))=0,36
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,34 – 7,29 (m, 5H, 5xHAr); 5,94 – 5,89 (m, 1H, NH); 4.67 (d, J=6,0 Hz, 2H, CH2); 3,98 (s, 3H, CH3); 3,93 (s, 3H, CH3).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172,63; 172,14; 168,19; 138,15; 128,67; 127,57; 127,52; 54,69; 54,55, 45,01.
MS (ESI, pos.) m/z 247 [M+H]+, 269 [M+Na]+, 515 [2M+Na]+. MS (ESI, neg.) m/z 267 [M+Na–2H]-.
HRMS (ESI, pos.) m/z
obliczone obserwowane
[M+H]+ 247,1190 247,1185
[2M+H]+ 493,2306 493,2299
138
9.1.3 2,4-dimetoksy-6-furfuryloamino-1,3,5-triazyna (140)
Użyto 16 µL furfuryloaminy (1 eq) uzyskując 38 mg produktu (wydajność 94%).
Rf(Hex:EtOAc(5:2))=0,36 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 (dd, J=1,9; 0,8 Hz, 1H, CHOFur); 6,33 (dd, J=3,2; 1,9 Hz, 1H, CHFur); 6,26 (dd, J=3,2; 0,9 Hz, 1H, CHFur); 5,95 – 5,90 (m, 1H, NH); 4,65 (d, J=5,8Hz, 2H, CH2); 3,99 (s, 3H, CH3); 3,93 (s, 3H, CH3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172,55; 172,15; 167,99; 142,22; 110,38; 107,36; 99,97; 54,69; 54,58; 38,03.
MS (ESI, pos.) m/z 237 [M+H]+, 259 [M+Na]+, 495 [2M+Na]+. MS (ESI, neg.) m/z 235 [M–H]-, 257 [M+Na–2H]-.
HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 237,0982 237,0977 [2M+H]+ 473,1892 473,1885 [2M+Na]+ 495,1711 495,1703
9.1.4 2,4-dimetoksy-6-dimetyloamino-1,3,5-triazyna (141)
Użyto 30 µL 33% roztworu dimetyloaminy w absolutnym etanolu (1 eq) uzyskując 29 mg produktu (wydajność 91%).
Rf(Hex:EtOAc(5:2))=0,20
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3,95 (s, 6H, 2xCH3O); 3,17 (s, 6H, 2xCH3N).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 172,05; 167,29; 54,35; 36,47.
139
9.2 Synteza 6-aminopodstawionych pochodnych
2-chloro-4-metoksy-1,3,5-triazyny
W kolbie rozpuszczono 2,4-dichloro-6-metoksy-1,3,5-triazynę (200 mg; 1,12 mmol; 1 eq) w 5 mL chlorku metylenu. Dodano 1 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 2 h. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 1:1 (Hex:EtOAc 1:1). Po zakończeniu reakcji mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 5:2.
9.2.1 2-chloro-4-metoksy-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (142)
Użyto 138 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (1 eq) uzyskując 156 mg produktu (wydajność 80%). Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,52 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,39-8,38 (m, 1H, NH); 4,05 (s, 3H, CH3O), 3,89 (s, 3H, CH3N). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,68; 169,99; 169,02; 54,75; 27,06.
9.2.2 6-benzyloamino-2-chloro-4-metoksy-1,3,5-triazyna (143)
Użyto 122 µL benzyloaminy (1 eq) uzyskując 243 mg produktu (wydajność 87%), występującego w widmach NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,56
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,06 (t, J=6,3 Hz, 1H, NH); 7,34 – 7,30 (m, 5H, 5xHAr); 4,50 (d, J=6,3 Hz, 2H, CH2), 3,85 (s, 3H, CH3).
140 Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,00 (t, J=6,3 Hz, 1H, NH); 7,36 – 7,21 (m, 5H, 5xHAr); 4,50 (d, J=6,3 Hz, 2H, CH2); 3,87 (s, 3H, CH3). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,67; 170,29; 170,05; 169,35; 166,60; 166,57; 138,38; 138,35; 128,31; 127,35; 127,14; 126,99; 54,91; 54,89; 43,79; 43,72.
9.2.3 2-chloro-6-furfuryloamino-4-metoksy-1,3,5-triazyna (144)
Użyto 103 µL furfuryloaminy (1 eq) uzyskując 228 mg produktu (wydajność 85%), występującego w widmach NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,68
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,98 (t, J=6,0 Hz, 1H, NH); 7,58 – 7,57 (m, 1H, CHOFur); 6,39 – 6,38 (m, 1H, CHFur); 6,32 – 6,29 (m, 1H, CHFur); 4,50 (d, J=5,8 Hz, 2H, CH2); 3,89 (s, 3H, CH3).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,93 (t, J=6,1 Hz, 1H, NH); 7,59 – 7,57 (m, 1H, CHOFur); 6,42 – 6,36 (m, 1H, CHFur); 6,30 – 6,25 (m, 1H, CHFur); 4,48 (d, J=5,8 Hz, 2H, CH2); 3,86 (s, 3H, CH3).
Mieszanina izomerów 1 i 2:
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,63; 170,32; 169,99; 169,42; 166,47; 166,46, 151,17; 151,13; 142,29; 110,48, 110,46; 107,40; 107,28; 54,98; 54,92; 37,27; 37,18.
9.2.4 2-chloro-6-dimetyloamino-4-metoksy-1,3,5-triazyna (145)
Użyto 197 µL 33% roztworu dimetyloaminy w absolutnym etanolu (1 eq) uzyskując 106 mg produktu (wydajność 50,44%).
141
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,88 (s, 3H, CH3O); 3,13 (s, 3H, CH3N); 3,11 (s, 3H, CH3N).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,16; 169,47; 165,31; 54,80; 36,26; 36,20.
9.3 Synteza 4,6-diaminopodstawionych pochodnych
2-metoksy-1,3,5-triazny
W celu uzyskania pochodnych o jednakowych podstawnikach aminowych, w kolbie rozpuszczono 2,4-dichloro-6-metoksy-1,3,5-triazynę (200 mg; 1,12 mmol; 1 eq) w 5 mL chlorku metylenu. Dodano 4 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze argonu przez 24 h. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 1:1 (Hex:EtOAc 1:1). Po zakończeniu reakcji mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 1:1.
W celu uzyskania pochodnych o różnych podstawnikach aminowych otrzymano najpierw 6-aminopodstawione pochodne 2-chloro-4-metoksy-1,3,5-triazyny (podrozdział 9.2), które następnie w ilości 50 mg umieszczano w kolbie i rozpuszczano w 3 mL chlorku etylenu. Dodano 2,5 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C, w atmosferze argonu przez 24 h. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 1:1 (Hex:EtOAc 1:1). Po zakończeniu reakcji mieszaninę odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną heksanu i octanu etylu w stosunku objętościowym 1:1.
9.3.1 4,6-di(metyloamino)-2-metoksy-1,3,5-triazyna (146)
Użyto 0,55 mL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (4 eq) uzyskując 95 mg produktu (wydajność 50%).
142 Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,18 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,68 – 5,44 (m, 2H, 2xNH); 3,91 (br s, 3H, CH3O); 2,98 (br s, 6H, 2xCH3N). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,91; 167,65; 167,26; 53,54; 27,73; 27.54. MS (ESI, pos.) m/z 170 [M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 168 [M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 170,1036 170,1035 [M+Na]+ 192,0856 192,0855 [2M+H]+ 339,2000 339,1997 [2M+Na]+ 361,1819 361,1814
9.3.2 4,6-di(benzyloamino)-2-metoksy-1,3,5-triazyna (147)
Użyto 0,49 mL benzyloaminy (4 eq) uzyskując 251 mg produktu (wydajność 70%), który w widmie NMR występuje w postaci trzech izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,40 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,80 – 7,74 (m, 2H, 2xNH); 7,32 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,40 (d, J=6,5 Hz, 4H, 2xCH2); 3,73 (s, 3H, CH3). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,83 – 7,77 (m, 2H, 2xNH); 7,32 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,40 (d, J=6,5 Hz, 4H, 2xCH2); 3,73 (s, 3H, CH3). Izomer 3: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,73 – 7,59 (m, 2H, 2xNH); 7,32 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,46 (d, J=6,3 Hz, 4H, 2xCH2); 3,71 (s, 3H, CH3).
143 Mieszanina izomerów 1, 2 i 3:
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 166,76; 161,46; 140,14; 139,97; 128,09; 128,04; 127,28; 127,23; 127,12; 126,96; 126,48; 53,20; 43,48; 43,33; 43,19.
MS (ESI, pos.) m/z 322 [M+H]+, 643 [2M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 342 [M+Na–2H]-.
HRMS (ESI, pos.) m/z
obliczone obserwowane
[M+H]+ 322,1662 322,1602
[2M+H]+ 643,3252 643,3229
9.3.3 4,6-di(furfuryloamino)-2-metoksy-1,3,5-triazyna (148)
Użyto 0,41 mL furfuryloaminy (4 eq) uzyskując 313 mg produktu (wydajność 93%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,33
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,73 (t, J=6,0 Hz, 2H, 2xNH); 7,53 (br s, 2H, 2xCHOFur); 6,35 (br s, 2H, 2xCHFur); 6,21 (br s, 2H, 2xCHFur); 4,47 – 4,38 (m, 4H, 2xCH2); 3,76 (s, 3H, CH3).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,61 (t, 2H, 2xNH); 7,53 (br s, 2H, 2xCHOFur); 6,35 (br s, 2H, 2xCHFur); 6,17 (d, J=3,1 Hz, 2H, 2xCHFur); 4,47 – 4,38 (m, 4H, 2xCH2); 3,72 (s, 3H, CH3). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,49; 166,79; 166,59; 152,90; 152,81; 141,69; 110,35; 106,56; 53,26; 36,93; 36,82. MS (ESI, pos.) m/z 302 [M+H]+, 603 [2M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 300 [M–H]-, 322 [M+Na–2H]-.
144 HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 302,1248 302,1241 [2M+H]+ 603,2423 603,2415
9.3.4 4,6-di(dimetyloamino)-2-metoksy-1,3,5-triazyna (149)
Użyto 0,79 mL 33% roztworu dimetyloaminy w absolutnym etanolu (4 eq) uzyskując 143 mg produktu (wydajność 65%).
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,50
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,77 (s, 3H, CH3O); 3,05 (s, 12H, 4xCH3N).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,26; 165,98; 53,05; 35,55.
MS (ESI, pos.) m/z 198 [M+H]+, 417 [2M+Na]+.
HRMS (ESI, pos.) m/z
obliczone obserwowane
[M+H]+ 198,1349 198,1347
[2M+H]+ 417,2445 417,2437
9.3.5 4-benzyloamino-2-metoksy-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (150)
Użyto 62 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2,5 eq) uzyskując 32mg produktu (wydajność 65%). Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,22 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,36 – 7,26 (m, 5H, 5xHAr); 6,20 (br s, 1H, NH); 5,81 (br s, 1H, NH); 4,70 – 4,51 (m, 2H, CH2); 3,89 (s, 3H, CH3O); 2,97 – 2,89 (m, 3H, CH3N). 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166,79; 166,56; 166,43; 138,29; 128,03; 127,09; 126,75; 53,47; 44,27; 27,15.
MS (ESI, pos.) m/z 246 [M+H]+, 268 [M+Na]+. MS (ESI, neg.) m/z 244 [M–H]-, 266 [M+Na–2H]-.
145 HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 246,1349 246,1345 [2M+H]+ 491,2626 491,2621 [2M+Na]+ 513,2445 513,2439
9.3.6 4-furfuryloamino-2-metoksy-6-metyloamino-1,3,5-triazyna
(151)
Użyto 64 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2,5 eq) uzyskując 32 mg produktu (wydajność 86%)
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,20
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7,33 (br s, 1H, CHOFur); 6,33 – 6,26 (m, 1H, CHFur); 6,22 (br s, 1H, CHFur); 5,91 (br s, 1H, NH); 5,46 (br s, 1H, NH); 4,62 (br s, 2H, CH2); 3,90 (s, 3H, CH3O); 2,95 (br s, 3H, CH3N).
13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 166,42; 165,66; 151,43; 141,47; 109,82; 106,57; 53,47; 37,33; 27,12.
MS (ESI, pos.) m/z 236 [M+H]+.
MS (ESI, neg.) m/z 234 [M–H]-, 256 [M+Na–2H]-, 272 [M+K–2H]-.
HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 236,1142 236,1138 [2M+H]+ 471,2211 471,2206 [2M+Na]+ 493,2031 493,2024
9.3.7 4-dimetyloamino-2-metoksy-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (152)
Użyto 82 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2,5 eq) uzyskując 17 mg produktu (wydajność 34%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
146 Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,30 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,44 (br s, 1H, NH); 3,89 (s, 3H, CH3O); 3,15 (s, 6H, 2xCH3N); 2,97 (d, J=5,0 Hz, 3H, CH3NH). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5,26 (br s, 1H, NH); 3,89 (s, 3H, CH3O); 3,15 (s, 6H, 2xCH3 N); 2,97 (d, J=5,0 Hz, 3H, CH3 NH). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, CDCl3) δ 169,12; 166,95; 166,32; 165,85; 53,28; 35,74; 27,12. MS (ESI, pos.) m/z 184 [M+H]+.
9.3.8 4-benzyloamino-6-furfuryloamino-2-metoksy-1,3,5-triazyna
(153)
Użyto 57 µL benzyloaminy (2,5 eq) uzyskując 64 mg produktu (wydajność 98%), który w widmie NMR występuje w postaci dwóch izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,34
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,84 (t, J=5,3 Hz, 1H, NH); 7,68 (t, J=6,6 Hz, 1H, NH); 7,53 (br s, 1H, CHOFur); 7,33 – 7,17 (m, 5H, 5xHAr); 6,36 (br s, 1H, CHFur); 6,25 – 6,18 (m, 1H, CHFur); 4,50 – 4,35 (m, 4H, 2xCH2); 3,73 (s, 3H, CH3).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,67 (t, J=3,6 Hz, 1H, NH); 7,59 (t, J=5,7 Hz, 1H, NH); 7,51 (br s, H, CHOFur); 7,33 – 7,17 (m, 5H, 5xHAr); 6,31 (br s, 1H, CHFur); 6,05 (d, J=3,1 Hz, 1H, CHFur); 4,48 – 4,36 (m, 4H, 2xCH2); 3,76 (s, 3H, CH3).
Mieszanina izomerów 1 i 2:
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 152,91; 141,68; 141,64; 140,14; 128,09; 127,37; 127,23; 127,16; 127,07; 126,97; 126,50; 110,34; 106,46; 53,23; 53,17; 43,53; 36,90; 36,82.
147 MS (ESI, pos.) m/z 312 [M+H]+, 350 [M+K]+, 623 [2M+H], 645 [2M+Na]+.
MS (ESI, neg.) m/z 310 [M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 312,1455 312,1448 [2M+H]+ 623,2837 623,2828 [2M+Na]+ 645,2657 645,2645 [2M+K]+ 661,2396 661,2385
9.3.9 6-dimetyloamino-4-furfuryloamino-2-metoksy-1,3,5-triazyna
(154)
Użyto 0,61 µL furfuryloaminy (2,5 eq) uzyskując 55 mg produktu (wydajność 83%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,44
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,68 – 7,59 (m, 1H, NH); 7,53 (dd, J=1,9; 0,9 Hz, 1H, CHOFur); 6,39 – 6,33 (m, 1H, CHFur); 6,24 – 6,17 (m, 1H, CHFur); 4,46 – 4,38 (m, 2H, CH2); 3,75 (s, 3H, CH3O); 3,03 (s, 6H, 2xCH3N).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,68 – 7,59 (m, 1H, NH); 7,53 (dd, J=1,9; 0,9 Hz, 1H, CHOFur); 6,39 – 6,33 (m, 1H, CHFur); 6,24 – 6,17 (m, 1H, CHFur); 4,46 – 4,38 (m, 2H, CH2); 3,77 (s, 3H, CH3O); 3,06 (s, 6H, 2xCH3N).
Mieszanina izomerów 1 i 2:
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,37; 166,36; 166,04; 153,02; 152,98; 141,66; 110,33; 106,53; 106,41; 53,15; 36,99; 36,86; 35,65; 35,51.
MS (ESI, pos.) m/z 250 [M+H]+, 288 [M+K]+, 499 [2M+Ha]+. MS (ESI, neg.) m/z 248 [M–H]-.
148 HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 250,1298 250,1293 [2M+H]+ 499,2524 499,2512 [2M+Na]+ 521,2344 521,2297
9.3.10 4-benzyloamino-6-dimetyloamino-2-metoksy-1,3,5-triazyna
(155)
Użyto 73 µL benzyloaminy (2,5 eq) uzyskując 59 mg produktu (wydajność 85%), który w widmie NMR występuje w postaci dwóch izomerów.
Rf(Hex:EtOAc(1:1))=0,39 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,77 (t, J=6,5 Hz, 1H, NH); 7,.33 – 7,25 (m, 4H, 4xHAr); 7,26 – 7,16 (m, 1H, HAr); 4,43 (d, J=6,3 Hz, 2H, CH2); 3,74 (s, 3H, CH3O); 3,03 (s, 3H, CH3N); 3,01 (s, 3H, CH3N). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,72 (t, J=6,4 Hz, 1H, NH); 7,33 – 7,25 (m, 4H, 4xHAr); 7,26 – 7,16 (m, 1H, HAr); 4,43 (d, J=6,3 Hz, 2H, CH2); 3,74 (s, 3H, CH3O); 3,03 (s, 3H, CH3N); 3,01 (s, 3H, CH3N). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,34; 166,49; 166,08; 140,24; 128,07; 127,31; 127,11; 126,49; 53,12; 43,62; 43,32; 35,64; 35,51.
MS (ESI, pos.) m/z 260 [M+H]+, 541 [2M+Na]+. MS (ESI, neg.) m/z 280 [M+Na–2H]-.
HRMS (ESI, pos.) m/z
obliczone obserwowane
[M+H]+ 260,1506 260,1502
149
[2M+Na]+ 541,2758 541,2753
[2M+K]+ 557,2498 557,2493
9.4 Synteza 6-aminopodstawionych pochodnych
2,4-dichloro-1,3,5-triazyny
W kolbie rozpuszczono 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazynę (chlorek cyjanuru) (200 mg; 1,09 mmol; 1 eq) w 10 mL acetonitrylu. Mieszając, kroplami dodano 2 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 95:5 (DCM:MeOH 95:5). Po zakończeniu reakcji osad zwirowano i kilkukrotnie przepłukano acetonitrylem. Supernatant odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 95:5.
9.4.1 2,4-dichloro-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (156)
Użyto 0,27 mL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2 eq) uzyskując 190 mg produktu (wydajność 98%).
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,60
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,02 (br s, 1H, NH); 2,84 (d, J=4,8 Hz, 3H, CH3).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 169,38; 168,18; 165,51; 27,56.
MS (ESI, neg.) m/z 177 [M–H]-, 198 [M+Na–2H]-.
9.4.2 6-benzyloamino-2,4-dichloro-1,3,5-triazyna (157)
Użyto 0,24 mL benzyloaminy (2 eq) uzyskując 269 mg produktu (wydajność 97%).
150 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,60 (t, J=6,3 Hz, 1H, NH); 7,39 – 7,22 (m, 5H, 5xHAr); 4,53 (d, J=6,3 Hz, 2H, CH2). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 169,47; 168,59; 165,44; 137,42; 128,41; 127,26; 127,21; 43,95. MS (ESI, pos.) m/z 255 [M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 253 [M–H]-, 291 [M+K–2H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 255,0199 255,0013
9.4.3 2,4-dichloro-6-furfuryloamino-1,3,5-triazyna (158)
Użyto 0,2 mL furfuryloaminy (2 eq) uzyskując 259 mg produktu (wydajność 97%).
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,80
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,57 (t, J=5,9 Hz, 1H, NH); 7,60 (dd, J=1,9; 0,9 Hz, 1H, CHOFur); 6,40 (dd, J=3,2; 1,8 Hz, 1H, CHFur); 6,34 (dd, J=3,2; 0,9 Hz, 1H, CHFur); 4,52 (d, J=6,4 Hz, 2H, CH2).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 169,44; 168,70; 165,31; 150,23; 142,55; 110,53; 107,75; 37,47.
MS (ESI, neg.) m/z 243 [M–H]-.
9.4.4 2,4-dichloro-6-dimetyloamino-1,3,5-triazyna (159)
Użyto 0,39 mL 33% roztworu dimetyloaminy w absolutnym etanolu (2 eq) uzyskując 202 mg produktu (wydajność 96%).
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,59
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,14 (s, 6H, 2xCH3).
151
9.5 Synteza 4,6-diaminopodstawionych pochodnych
2-chloro-1,3,5-triazyny
W celu uzyskania pochodnych o jednakowych podstawnikach aminowych, w kolbie rozpuszczono chlorek cyjanuru (150 mg; 0,82 mmol; 1 eq) w 10 mL acetonitrylu. Kroplami dodawano 4 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej przez 4 h. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 95:5 (DCM:MeOH 95:5). Po zakończeniu reakcji osad zwirowano i kilkukrotnie przepłukano acetonitrylem. Supernatant odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 95:5.
W celu uzyskania pochodnych o różnych podstawnikach aminowych otrzymano najpierw 6-aminopodstawione pochodne 2,4-dichloro-1,3,5-triazyny (podrozdział 9.4), które następnie w ilości 100 mg umieszczano w kolbie i rozpuszczano w 10 mL acetonitrylu. Dodano kroplami 2 eq odpowiedniej aminy (metyloamina, benzyloamina, furfuryloamina, dimetyloamina). Mieszaninę mieszano w temperaturze pokojowej, przez 4 h. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 95:5 (DCM:MeOH 95:5). Po zakończeniu reakcji osad zwirowano i kilkukrotnie przepłukano acetonitrylem. Supernatant odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 95:5.
9.5.1 2-chloro-4,6-di(metyloamino)-1,3,5-triazyna (160)
Użyto 134 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (4 eq) uzyskując 64 mg produktu (wydajność 45%).
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,58
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,03 (br s, 2H, 2xNH); 2,84 (s, 6H, 2xCH3).
152
9.5.2 2-chloro-4,6-di(benzyloamino)-1,3,5-triazyna (161)
Użyto 0,36 mL benzyloaminy (4 eq) uzyskując 256 mg produktu (wydajność 96%), występującego w widmie NMR w postaci czterech izomerów.
Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,40 (t, J=6,2 Hz, 2H, 2xNH); 7,36 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,42 (d, J=6,2 Hz, 4H, 2xCH2). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,35 – 8,29 (m, 2H, 2xNH); 7,36 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,47 (m, 4H, 2xCH2). Izomer 3: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,31 – 8,26 (m, 2H, 2xNH); 7,36 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,42 (d, J=6,2 Hz, 4H, 2xCH2). Izomer 4: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,16 (t, J=6,2 Hz, 2H, 2xNH), 7,36 – 7,17 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,42 (d, J=6,2 Hz, 4H, 2xCH2). Analizy w 95°C: 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,92 (br s, 2H, 2xNH); 7,47 – 7,03 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,47 (d, J=6,3 Hz, 4H, 2xCH2). 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 165,88; 160,94; 139,28; 128,16; 127,31; 126,71; 43.87.
MS (ESI, pos.) m/z 326 [M+H]+, 348 [M+Na]+, 364 [M+K]+.
HRMS (ESI, pos.) m/z
obliczone obserwowane
[M+H]+ 326,1167 326,1159
9.5.3 2-chloro-4,6-di(furfuryloamino)-1,3,5-triazyna (162)
Użyto 0,3 mL furfuryloaminy (4 eq) uzyskując 135 mg produktu (wydajność 54%), występującego w widmie NMR w postaci czterech izomerów.
153 Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,54
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,35 (t, J=6,0 Hz, 2H, 2xNH); 7,57 (br s, 2H, 2xCHOFur); 6,38 (br s, 2H, 2xCHFur); 6,22 (br s, 2H, 2xCHFur); 4,44 (dd, J=13,7, 6,0 Hz, 4H, 2xCH2).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,29 (t, J=5,8 Hz, 2H, 2xNH), 7,57 (br s, 2H, 2xCHOFur); 6,38 (br s, 2H, 2xCHFur), 6,25 (br s, 2H, 2xCHFur); 4,44 (dd, J=13,7; 6,0 Hz, 4H, 2xCH2).
Izomer 3:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,24 (t, J=6,1 Hz, 2H, 2xNH); 7,57 (br s, 2H, 2xCHOFur); 6,38 (br s, 2H, 2xCHFur); 6,28 (br s, 2H, 2xCHFur); 4,44 (dd, J=13,7; 6,0 Hz, 4H, 2xCH2).
Izomer 4:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,11 (t, J=5,4 Hz, 2H, 2xNH); 7,57 (br s, 2H, 2xCHOFur); 6,38 (br s, 2H, 2xCHFur); 6,25 (br s, 2H, 2xCHFur); 4,44 (dd, J=13,7; 6,0 Hz, 4H, 2xCH2). Mieszanina izomerów 1, 2, 3 i 4: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 168,32; 167,88; 165,46; 165,25; 165,15; 151,97; 151,85; 142,04; 142,00; 141,97; 110,43; 110,40; 106,98; 106,77; 36,98; 36,94. MS (ESI, pos.) m/z 306 [M+H]+.
9.5.4 2-chloro-4,6-di(dimetyloamino)- 1,3,5-triazyna (163)
Użyto 0,58 mL 33% roztworu dimetyloaminy w absolutnym etanolu (4 eq) uzyskując 163 mg produktu (wydajność 99%).
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,86
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 3,08 (s, 6H, 2xCH3N); 3,05 (s, 6H, 2xCH3N);
154 MS (ESI, pos.) m/z 202 [M+H]+. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 202,0854 202,0850 [M+Na]+ 224,0673 224,0669
9.5.5 4-benzyloamino-2-chloro-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (164)
Użyto 97 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2 eq) uzyskując 85 mg produktu (wydajność 87%), występującego w widmie NMR w postaci czterech izomerów. Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,50 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,35 (t, J=6,3 Hz, 1H, NHCH2); 7,71 (q, J=4,6 Hz, 1H, NHCH3); 7,35 – 7,17 (m, 5H, 5xHAr); 4,49 – 4,39 (m, 2H, CH2); 2,77 – 2,68 (m, 3H, CH3N). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,31 (t, J=6,4 Hz, 1H, NHCH2); 7,66 (q, J=4,8 Hz, 1H, NHCH3); 7,35 – 7,17 (m, 5H, 5xHAr); 4,49 – 4,39 (m, 2H, CH2); 2,77 – 2,68 (m, 3H, CH3N). Izomer 3: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,20 (t, J=6,5; 3,3 Hz, 1H, NHCH2); 7,66 (q, J=4,8 Hz, 1H, NHCH3); 7,35 – 7,17 (m, 5H, 5xHAr); 4,49 – 4,39 (m, 2H, CH2); 2,77 – 2,68 (m, 3H, CH3N). Izomer 4: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,06 (t, 1H, NHCH2); 7,53 – 7,47 (m, 1H, NHCH3); 7,35 – 7,17 (m, 5H, 5xHAr); 4,49 – 4,39 (m, 2H, CH2); 2,77 – 2,68 (m, 3H, CH3N).
155 Mieszanina izomerów 1, 2, 3 i 4: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,52; 165,77; 165,66; 165,51; 165,44; 139,31; 128,21; 128,17; 127,45; 127,01; 126,95; 126,75; 126,69; 43,62; 43,33; 43,23; 27,20; 27,17; 27,06. MS (ESI, pos.) m/z 250 [M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 248 [M–H]-. HRMS (ESI, neg.) m/z obliczone obserwowane [M-H]- 248,0708 248,0696
9.5.6 2-chloro-4-furfuryloamino-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (165)
Użyto 101 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2 eq) uzyskując 94 mg produktu (wydajność 96%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,34
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,30 – 8,19 (m, 1H, NH); 7,79 – 7,76 (m, 1H, NH); 7,56 (br s, 1H, CHOFur); 6,38 (br s, 1H, CHFur); 6,29 – 6,20 (m, 1H, CHFur); 4,41 (br s, 2H, CH2); 2,74 (br s, 3H, CH3).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,18 – 8,10 (m, 1H, NH); 7,72 – 7,67 (m, 1H, NH); 7,56 (br s, 1H, CHOFur); 6,38 (br s, 1H, CHFur); 6,29 – 6,20 (m, 1H, CHFur); 4,47 (d,
J=5,8 Hz, 2H, CH2); 2,79 (br s, 3H, CH3). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 168,34; 167,95; 167,58; 165,78; 165,60; 165,51; 165,33; 164,90; 152,13; 152,03; 151,97; 141,97; 110,41; 107,05; 106,83; 106,77; 36,95; 27,18; 27,08; 24,19. MS (ESI, pos.) m/z 240 [M+H]+.
156 HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 240,0647 240,0643 [M+Na]+ 262,0466 262,0462
9.5.7 2-chloro-4-dimetyloamino-6-metyloamino-1,3,5-triazyna (166)
Użyto 128 µL 33% roztworu metyloaminy w absolutnym etanolu (2 eq) uzyskując 94 mg produktu (wydajność 97%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów. Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,48 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,68 (br s, 1H, NH); 3,10 (s, 3H, CH3N); 3,05 (s, 3H, CH3N); 2,78 (d, J=4,7 Hz, 3H, CH3NH). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,62 (br s, 1H, NH); 3,10 (s, 3H, CH3N); 3,03 (s, 3H, CH3N); 2,74 (d, J=4,7 Hz, 3H, CH3NH). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 168,88; 168,42; 167,67; 165,32; 164,63; 164,25; 35,85; 35,80; 27,19; 27,05. MS (ESI, pos.) m/z 188 [M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 186 [M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 188,0697 188,0696 [M+Na]+ 210,0517 210,0513
157
9.5.8 4-benzyloamino-2-chloro-6-furfuryloamino-1,3,5-triazyna (167)
Użyto 90 µL benzyloaminy (2 eq) uzyskując 100 mg produktu (wydajność 78%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,60
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,44 (t, J=6,2 Hz, 1H, NH); 8,31 (t, J=6,2 Hz, 1H, NH); 7,57 (s, 1H, CHOFur); 7,35 – 7,21 (m, 5H, 5xHAr); 6,39 (br s, 1H, CHFur); 6,31 – 6,20 (m, 1H, CHFur); 4,50 – 4,38 (m, 4H, 2xCH2).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,37 (t, J=7,0 Hz, 1H, NH); 8,23 (t, J=6,6 Hz, 1H, NH); 7,54 (s, 1H, CHOFur); 7,35 – 7,21 (m, 5H, 5xHAr); 6,33 (br s, 1H, CHFur); 6,10 (br s, 1H, CHFur); 4,50 – 4,38 (m, 4H, 2xCH2).
9.5.9 2-chloro-6-dimetyloamino-4-furfuryloamino-1,3,5-triazyna
(168)
Użyto 96 µL furfuryloaminy (2 eq) uzyskując 129 mg produktu (wydajność 98%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,68
Izomer 1:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,26 (t, J=5,6 Hz, 1H, NH); 7,56 (s, 1H, CHOFur); 6,38 (s, 1H, CHFur); 6,27 (s, 1H, CHFur); 4,48 – 4,39 (m, 2H, CH2); 3,09 (s, 3H, CH3); 3,05 (s, 3H, CH3).
Izomer 2:
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.19 – 8.14 (m, 1H, NH); 7,56 (s, 1H, CHOFur); 6,38 (s, 1H, CHFur); 6,23 (s, 1H, CHFur); 4,48 – 4,39 (m, 2H, CH2); 3,09 (s, 3H, CH3); 3,05 (s, 3H, CH3).
158 Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 168,40; 167,96; 165,24; 164,96; 164,88; 164,44; 152,16; 152,03; 141,98; 110,42; 110,39; 106,97; 106,76; 37,01; 36,97; 35,92; 35,80. MS (ESI, pos.) m/z 254 [M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 252 [M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 254,0803 254,0798 [M+Na]+ 276,0623 276,0617 [2M+H]+ 507,1534 507,1527 [2M+Na]+ 529,1353 529,1346
9.5.10 4-benzyloamino-2-chloro-6-dimetyloamino-1,3,5-triazyna (169)
Użyto 114 µL benzyloaminy (2 eq) uzyskując 133 mg produktu (wydajność 97%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(DCM:MeOH(95:5))=0,70 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,36 (br s, 1H, NH); 7,35 – 7,21 (m, 5H, 5xHAr); 4,45 (d, J=6,2 Hz, 2H, CH2); 3,04 (br s, 6H, 2xCH3). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,25 (br s, 1H, NH); 7,35 – 7,21 (m, 5H, 5xHAr); 4,45 (d, J=6,2 Hz, 2H, CH2); 3,04 (br s, 6H, 2xCH3). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 167,90; 165,00; 164,51; 139,33; 128,22; 128,19; 127,34; 126,99; 126,74; 43,68; 43,33; 35,90; 35,78. MS (ESI, pos.) m/z 264 [M+H]+.
159 HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 264,1010 264,1004 [M+Na]+ 286,0830 286,0822 [2M+H]+ 527,1948 527,1939 [2M+Na]+ 549,1768 549,1757 [2M+K]+ 565,1507 565,1495
9.6 Synteza diaminopodstawionych pochodnych 5-azacytozyny
Odpowiednią 4,6-diaminopodstawioną pochodną 2-chloro-1,3,5-triazyny (100 mg, 1 eq) umieszczano w niewielkiej ilości mieszaniny dioksanu i wody o stosunku objętościowym 4:1 (DIOXAN:H2O 4:1). Całość podgrzewano i następnie dodawano 8 eq 2 M roztworu wodorotlenku potasu. Mieszano w temperaturze wrzenia przez 24h. Postęp reakcji kontrolowano wykonując analizę TLC. Jako eluenta używano mieszaninę chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1 (DCM:MeOH 9:1). Po zakończeniu reakcji mieszaninę zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkty oczyszczano wykorzystując preparatywną chromatografię cienkowarstwową, eluując mieszaniną chlorku metylenu i metanolu w stosunku objętościowym 9:1.
9.6.1 5-aza-4-N-metylo-6-metyloaminocytozyna (170)
Użyto 2,3 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 72 mg produktu (wydajność 80%). Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,29 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,04 (s, 1H, HN-1); 8,48 (s, 2H, 2xNH); 2,64 (br s, 6H, 2xCH3). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 159,54; 156,76; 153,25; 28,97; 27,03.
9.6.2 5-aza-4-N-benzylo-6-benzyloaminocytozyna (171)
Użyto 1,23 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 79 mg produktu (wydajność 84%), występującego w widmach NMR w postaci dwóch izomerów.
160 Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,38 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,62 (t, J=6,6 Hz, 2H, 2xNH); 7,41 (br s, 1H, HN-1); 7,38 – 7,18 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,48 – 4,39 (m, 4H, 2xCH2). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7,51 (t, J=6,5 Hz, 2H, 2xNH); 7,41 (br s, 1H, HN-1); 7,38 – 7,18 (m, 10H, 2x5xHAr); 4,48 – 4,39 (m, 4H, 2xCH2). Mieszanina izomerów 1 i 2: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 164,56; 164,14; 158,86; 158,30; 140,14; 136,77; 128,26; 128,09; 126,93; 126,57; 126,45; 43,64; 43,16.
MS (ESI, pos.) m/z 308 [M+H]+, 346 [M+K]+, 390 [M+2ACN+H]+, 615 [2M+H]+, 653 [2M+K]+. MS (ESI, neg.) m/z 306 [M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+Na]+ 330,1325 330,1319 [2M+Na]+ 637,2758 637,2748
9.6.3 5-aza-4-N-furfurylo-6-furfuryloaminocytozyna (172)
Użyto 1,31 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 79 mg produktu (wydajność 84%), występującego w widmie NMR w postaci dwóch izomerów.
Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,27
Izomer 1:
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,54 (br s, 2H, 2xCHOFur); 7,38 (t, J=6,2 Hz, 2H, 2xNH); 7,33 (br s, 1H, HN-1); 6,36 (br s, 2H, 2xCHFur); 6,22 (d, J=3,2 Hz, 1H, CHFur); 6,18 (d, J=3,1 Hz, 1H, CHFur); 4,37 (d, J=6,1 Hz, 4H, 2xCH2).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 163,89; 158,07; 155,14; 152,97; 152,93; 141,74; 141,69; 110,39; 110,37; 106,45; 106,35; 36,89.
161 Izomer 2:
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,57 (br s, 2H, 2xCHOFur); 7,48 (t, J=6,2 Hz, 2H, 2xNH); 7,33 (br s, 1H, HN-1); 6,40 – 6,37 (m, 2H, 2xCHFur); 6,31 (s, 2H, 2xCHFur); 4,39 (d, J=6,3 Hz, 4H, 2xCH2).
13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 164,31; 158,57; 154,79; 149,73; 149,68; 142,37; 110,40; 110,37; 107,98; 107,91; 37,13.
MS (ESI, pos.) m/z 288 [M+H]+, 310 [M+Na]+, 351 [M+ACN+Na]+, 575 [2M+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 286 [M–H]-.
9.6.4 5-aza-4-N-dimetylo-6-dimetyloaminocytozyna (173)
Użyto 1,99 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 76 mg produktu (wydajność 83%).
Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,34
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,28 (br s, 1H, HN-1); 3,03 (s, 12H, 6xCH3).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160,84; 157,06; 36.09.
MS (ESI, pos.) m/z 184 [M+H]+, 222 [M+K]+, 266 [M+2ACN+H]+, 405 [2M+K]+. MS (ESI, neg.) m/z 182 [M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 184,1193 184,1191 [M+Na]+ 206,1012 206,1009 [2M+H]+ 367,2313 367,2308 [2M+Na]+ 389,2132 389,2125
9.6.5 5-aza-4-N-benzylo-6-metyloaminocytozyna (174)
Użyto 1,6 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 72 mg produktu (wydajność 78%), który w widmie NMR występuje w postaci trzech izomerów.
162 Izomer 1: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,15 (br s, 1H, HN-1); 8,89 (t, J=5,5 Hz, 1H, NHCH2); 8,31 – 8,21 (m, 1H, NHCH3); 7,48 – 7,23 (m, 5H, 5xHAr); 4,59 (d, J=5,9 Hz, 2H, CH2); 2,94 – 2,79 (m, 3H, CH3). Izomer 2: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,15 (br s, 1H, HN-1); 8,60 (t, 1H, NHCH2); 8,10 – 8,03 (m, 1H, NHCH3); 7,40 – 7,30 (m, 5H, 5xHAr); 4,54 (d, J=6,1 Hz, 2H, CH2); 2,94 – 2,79 (m, 3H, CH3). Izomer 3: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,15 (br s, 1H, HN-1); 9,68 (t, 1H, NHCH2); 9,21 – 9,13 (m, 1H, NHCH3); 7,40 – 7,30 (m, 5H, 5xHAr); 4,54 (d, J=6,1 Hz, 2H, CH2); 2,94 – 2,79 (m, 3H, CH3). Mieszanina izomerów 1, 2 i 3: 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 157,19; 156,70; 156,43; 156,21; 156,19; 148,47; 148,33; 147,72; 147,67; 137,53; 137,49; 128,45; 128,36; 127,71; 127,32; 127,24; 127,18; 44,22; 43,76; 43,72; 28,01; 27,81; 27,76.
MS (ESI, pos.) m/z 232 [M+H]+, 270 [M+K]+, 308 [M+2K+H]+, 314 [M+2ACN+H]+ 463 [2M+H]+.
MS (ESI, neg.) m/z 230 [M–H]-.
9.6.6 5-aza-4-N-furfurylo-6-metyloaminocytozyna (175)
Użyto 1,67 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 73 mg produktu (wydajność 79%).
Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,10
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,56 (br s, 1H, HN-1); 7,51 (d, J=1,8 Hz, 1H, CHOFur); 6,34 (dd, J=3,2; 1,8 Hz, 1H, CHFur); 6,18 (d, J=3,1 Hz, 1H, CHFur); 4,35 (s, 2H, CH2); 2,63 (s, 3H, CH3).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 170,90; 167,01; 165,70; 154,67; 141,23; 110,23; 105,74; 36,79; 27,02.
163 MS (ESI, pos.) m/z 260 [M+K]+.
MS (ESI, neg.) m/z 220 [M–H]-, 441 [2M–H]-.
9.6.7 5-aza-4-N-dimetylo-6-metyloaminocytozyna (176)
Użyto 2,14 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 72 mg produktu (wydajność 80%). Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,24 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,79 (br s, 1H, HN-1); 7,57 (br s, 1H, NH); 3,02 (br s, 6H, 2xCH3N); 2,76 (br s, 3H, CH3NH). 13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 155,51; 154,29; 153,54; 35,99; 28,96. MS (ESI, pos.) m/z 170 [M+H]+, 208 [M+K]+, 246 [M+2K+H]+, 377 [2M+K]+. MS (ESI, neg.) m/z 168 [M–H]-, 337 [2M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 170,1036 170,1034 [2M+H]+ 339,2000 339,1994
9.6.8 5-aza-4-N-benzylo-6-furfuryloaminocytozyna (177)
Użyto 1,27 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 79 mg produktu (wydajność 80%).
Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,10
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,56 (s, 1H, HN-1); 7,52 (s, 1H, CHOFur); 7,31 – 7,16 (m, 5H, 5xHAr); 6,34 (br s, 1H, CHFur); 6,20 (br s, 1H, CHFur); 4,42 (br s, 2H, CH2); 4,38 (br s, 2H, CH2).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 181,74; 173,51; 165,77; 144,00; 141,48; 128,00; 127,10; 126,30; 110,29; 106,19; 62,85; 60,34.
MS (ESI, pos.) m/z 336 [M+K]+, 380 [M+2ACN+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 296 [M–H]-.
164 HRMS (ESI, pos.) m/z
obliczone obserwowane
[M+K]+ 336,0857 336,0850
9.6.9 5-aza-4-N-furfurylo-6-dimetyloaminocytozyna (178)
Użyto 1,58 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 76 mg produktu (wydajność 82%).
Rf(DCM:MeOH(9:1))=0,26
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,39 (br s, 1H, HN-1); 7,58 (s, 1H, CHOFur); 7,54 (br s, 1H, NH); 6,40 (s, 1H, CHFur); 6,29 (s, 1H, CHFur); 4,46 (s, 2H, CH2); 3,03 (s, 6H, 2xCH3).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 158,35; 156,55; 156,49; 151,94; 142,13; 110,42; 107,08; 62,75; 36,59.
MS (ESI, pos.) m/z 236 [M+H]+, 274 [M+K]+, 312 [M+2K+Na]+, 318 [M+2ACN+H]+, 509 [2M+K]+. MS (ESI, neg.) m/z 234 [M–H]-, 469 [2M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 236,1142 236,1138 [M+Na]+ 258,0961 258,0957 [2M+H]+ 471,2211 471,2205 [2M+Na]+ 493,2031 493,2024
9.6.10 5-aza-4-N-benzylo-6-dimetyloaminocytozyna (179)
Użyto 1,52 mL 2 M roztworu wodorotlenku potasu (8 eq) uzyskując 79 mg produktu (wydajność 85%).
165
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10,34 (br s, 1H, HN-1); 7,66 (br s, 1H, NH); 7,39 – 7,20 (m, 5H, 5xHAr); 4,46 (d, J=5,9 Hz, 2H, CH2); 3,01 (s, 6H, 2xCH3).
13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 160,16; 155,09; 154,29; 137,80; 128,24; 127,35; 126,86; 43,22; 36,04.
MS (ESI, pos.) m/z 246 [M+H]+, 284 [M+K]+, 322 [M+2K+H]+, 328 [M+2ACN+H]+. MS (ESI, neg.) m/z 244 [M–H]-, 489 [2M–H]-. HRMS (ESI, pos.) m/z obliczone obserwowane [M+H]+ 246,1349 246,1347 [M+Na]+ 268,1169 268,1165 [M+K]+ 284,0908 284,0904 [2M+H]+ 491,2626 491,2623 [2M+Na]+ 513,2445 513,2443 [2M+K]+ 529,2185 529,2182
166
VI STRESZCZENIE W JĘZYKU ANGIELSKIM
Abstract
Compounds inhibiting methylation of cytosine in DNA may play an important role in cancer therapy. Lack of the effective anti-cancer drugs causes the development of new DNMT1 methyltransferase inhibitors. Several have been identified so far. These mainly include cytidine derivatives, such as 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine. These compounds are characterized by high toxicity towards the cancer cells and, unfortunately, also to healthy ones. In addition, they are chemically unstable.
Earlier studies of research groups of Prof. Markiewicz and Prof. Barciszewski at the Institute of Bioorganic Chemistry of the Polish Academy of Sciences were focused on synthesis and recognition of the biological properties of numerous cytosine derivatives. In terms of biological properties, the most promising compounds were 4-N-furfurylcytosine and 4-N-furfuryl-5,6-dihydro-5-azacytosine. This fact became the inspiration for the attempt to obtain derivatives combining the features of these compounds (i.e. a nitrogen atom in the 5-position of the ring and a double bond between N-5 nitrogen and C-6 carbon atoms).
The main goal of this dissertation was the development and optimization of the new synthetic route for N-substituted 5-azacytosine derivatives. Four such derivatives were obtained using a four-step synthesis. In addition, tests were performed to determine the stability of the obtained products towards hydrous and alkaline environment, including physiological conditions. Moreover the effect of the substituent at the N-1 position of the triazine ring on this feature was determined. Tests have also been carried out for analogous derivatives of 5-azacytosine (not bearing substituents at the N-4 position).
During the research, a possibility of application of chlorotrimethylsilane (TMSCl) (instead of previously used iodotrimethylsilane, generated in situ) in the demethylation reactions of compounds with different numbers of nitrogen atoms in the ring, i.e. the methoxy derivatives of s-triazine (3), pyrimidine (2), pyridine (1) and benzene (0) has been checked.
In order to broaden the spectrum of compounds, mono- and diamino-substituted 5-azacytosine derivatives were obtained up to a total of thirty-two such substances.
167 The structures of all obtained products were confirmed using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and mass spectrometry (MS, HRMS). The obtained compounds were transferred for the biological studies to determine their inhibition of DNMT1 constant values. These studies are still ongoing.
168
VII BIBLIOGRAFIA
[1] Daura-Oller, E., Cabre, M., Montero, M. A., Paternain, J. L., Romeu, A. (2009). Specific gene hypomethylation and cancer: new insights into coding region feature trends. Bioinformation, 3(8), 340-343.
[2] Evans, J. H., Evans, T. E. (1970). Methylation of the deoxyribonucleic acid of Physarum polycephalum at various periods during the mitotic cycle. Journal of
Biological Chemistry, 245(23), 6436-6441.
[3] Steenwyk, J. L., Denis, J. St., Dresch, J. M., Larochelle, D. A., Drewell, R. A. (2017). Whole genome bisulfite sequencing reveals a sparse, but robust pattern of DNA methylation in the Dictyostelium discoideum genome. bioRxiv, 166033.
[4] Ratel, D., Ravanat, J. L., Berger, F., Wion, D. (2006). N6-methyladenine: the other methylated base of DNA. Bioessays, 28(3), 309-315.
[5] Wu, T. P., Wang, T., Seetin, M. G., Lai, Y., Zhu, S., Lin, K., Liu, Y., Byrum, S. D., Mackintosh, S. G., Zhong, M., Tackett, A., Wang, G., Hon, L. S., Fang, G., Swenberg, J. A., Xiao, A. Z. (2016). DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature, 532(7599), 329-333.
[6] Békési, A., Vértessy, B. G. (2011). Uracil in DNA: error or signal? Science in
School, 18, 27-31.
[7] Rana, A. K., Ankri, S. (2016). Reviving the RNA world: an insight into the appearance of RNA methyltransferases. Frontiers genetics, 7, 99.
[8] Walsh, C. P., Xu, G. L. (2006). Cytosine methylation and DNA repair. DNA
Methylation: Basic Mechanisms, 301, 283-315.
[9] Dodge, J. E., Ramsahoye, B. H., Wo, Z. G., Okano, M., Li, E. (2002). De novo methylation of MMLV provirus in embryonic stem cells: CpG versus non-CpG methylation. Gene, 289(1-2), 41-48.
[10] Haines, T. R., Rodenhiser, D. I., Ainsworth, P. J. (2001). Allele-specific non-CpG methylation of the Nf1 gene during early mouse development. Developmental Biology,
240(2), 585-598.
[11] Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. M., Edsall, L., Antosiewicz-Bourget, J., Stewart, R., Ruotti, V., Harvey Millar, A., Thomson, J. A., Ren, B., Ecker, J. R. (2009). Human
169 DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences. Nature,
462(7271), 315-22.
[12] Łukasik, M., Karmalska, J., Szutowski, M. M., Łukaszkiewicz, J. (2009). Wpływ metylacji DNA na funkcjonowanie genomu. Biuletyn Wydziału Farmaceutycznego
Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego, 2, 13-18.
[13] Hermann, A., Gowher, H., Jeltsch, A. (2004). Biochemistry and biology of mammalian DNA methyltransferases. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS,
61(19-20), 2571-2587.
[14] Pradhan, S., Esteve, P. O. (2003). Mammalian DNA (cytosine-5) methyltransferases and their expression. Clinical Immunology, 109(1), 6-16.
[15] Jeltsch, A (2006) Molecular enzymology of mammalian DNA methyltransferases.
DNA Methylation: Basic Mechanisms, 301, 203-225
[16] Goll, M. G., Bestor, T. H. (2005). Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual
Review of Biochemistry, 74, 481-514
[17] Cheng, X. (1995) Structure and function of DNA methyltransferases. Annual
review of biophysics and biomolecular structure, 24(1), 293-318
[18] Lauster, R., Trautner, T. A., Noyer-Weidner, M. (1989). Cytosine-specific type II DNA methyltransferases: a conserved enzyme core with variable target-recognizing domains. Journal of molecular biology, 206(2), 305-312.
[19] Wu, J. C., Santi, D. V. (1987). Kinetic and catalytic mechanism of HhaI methyltransferase. Journal of Biological Chemistry, 262(10), 4778-4786.
[20] Buryanov, Y. I., Shevchuk, T. V. (2005). DNA methyltransferases and structural-functional specificity of eukaryotic DNA modification. Biochemistry (Moscow), 70(7), 730-742.
[21] Crider, K. S., Yang, T. P., Berry, R. J., Bailey, L. B. (2012). Folate and DNA methylation: a review of molecular mechanisms and the evidence for folate's role.
Advances in nutrition, 3(1), 21-38.
[22] Stimson, K. M., Vertino, P. M. (2002). Methylation-mediated silencing of TMS1/ASC is accompanied by histone hypoacetylation and CpG island-localized changes in chromatin architecture. Journal of Biological Chemistry, 277(7), 4951-4958. [23] Feinberg, A. P., Vogelstein, B. (1983). Hypomethylation distinguishes genes of some human cancers from their normal counterparts. Nature, 301(5895), 89-92.
170 [24] Jackson, K., Yu, M. C., Arakawa, K., Fiala, E., Youn, B., Fiegl, H., Müller-Holzner, E., Widschwendter, M., Ehrlich, M. (2004). DNA hypomethylation is prevalent even in low-grade breast cancers. Cancer biology & therapy, 3(12), 1225-1231.
[25] Narayan, A., Ji, W., Zhang, X. Y., Marrogi, A., Graff, J. R., Baylin, S. B., Ehrlich, M. (1998). Hypomethylation of pericentromeric DNA in breast adenocarcinomas.
International journal of cancer, 77(6), 833-838.
[26] Frigola, J., Solé, X., Paz, M. F., Moreno, V., Esteller, M., Capellà, G., Peinado, M. A. (2005). Differential DNA hypermethylation and hypomethylation signatures in colorectal cancer. Human molecular genetics, 14(2), 319-326.
[27] Kim, Y. H., Lee, H. C., Kim, S. Y., Yeom, Y. I., Ryu, K. J., Min, B. H., Kim. D. H., Son, H. J., Rhee, P. L., Kim, J. J., Rhee, J. C., Kim, H. C., Chun, H. K., Grady, W. M., Kim, Y. S. (2011). Epigenomic analysis of aberrantly methylated genes in colorectal cancer identifies genes commonly affected by epigenetic alterations. Annals
of surgical oncology, 18(8), 2338-2347.
[28] Toyota, M., Ahuja, N., Ohe-Toyota, M., Herman, J. G., Baylin, S. B., Issa, J. P. J. (1999). CpG island methylator phenotype in colorectal cancer. Proceedings of the
National Academy of Sciences, 96(15), 8681-8686.
[29] Waterland, R. A., Jirtle, R. L. (2003). Transposable elements: targets for early nutritional effects on epigenetic gene regulation. Molecular and cellular biology,
23(15), 5293-5300.
[30] Waterland, R. A. (2003). Do maternal methyl supplements in mice affect DNA methylation of offspring? The Journal of nutrition, 133(1), 238-238.
[31] Dolinoy, D. C., Weidman, J. R., Waterland, R. A., Jirtle, R. L. (2006). Maternal genistein alters coat color and protects Avy mouse offspring from obesity by modifying the fetal epigenome. Environmental health perspectives, 114(4), 567-572.
[32] Riggs, A. D. (1975). X inactivation, differentiation, and DNA methylation.
Cytogenetic and Genome Research, 14(1), 9-25.
[33] Holliday, R., Pugh, J. E. (1975). DNA modification mechanisms and gene activity during development. Science, 187(4173), 226-232.
[34] Bestor, T. H., Ingram, V. M. (1983). Two DNA methyltransferases from murine erythroleukemia cells: purification, sequence specificity, and mode of interaction with DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences, 80(18), 5559-5563.
171 [35] Bestor, T., Laudano, A., Mattaliano, R., Ingram, V. (1988). Cloning and sequencing of a cDNA encoding DNA methyltransferase of mouse cells: the carboxyl-terminal domain of the mammalian enzymes is related to bacterial restriction methyltransferases. Journal of molecular biology, 203(4), 971-983.
[36] Jones, P. A., Liang, G. (2009). Rethinking how DNA methylation patterns are maintained. Nature Reviews Genetics, 10(11), 805-811.
[37] Cravo, M., Fidalgo, P., Pereira, A. D., Gouveia-Oliveira, A., Chaves, P., Selhub, J., Mason, J. B., Mira, F. C., Leitao, C. N. (1994). DNA methylation as an intermediate biomarker in colorectal cancer: modulation by folic acid supplementation. European
journal of cancer prevention: the official journal of the European Cancer Prevention Organisation (ECP), 3(6), 473-479.
[38] Smith, A. D., Kim, Y. I., Refsum, H. (2008). Is folic acid good for everyone?. The
American journal of clinical nutrition, 87(3), 517-533.
[39] Okano, M., Bell, D. W., Haber, D. A., Li, E. (1999). DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell, 99(3), 247-257.
[40] Robertson, K. D. (2002). DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web. Oncogene, 21(35), 5361-5379.
[41] Chen, T., Li, E. (2006). Establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mammals. DNA Methylation: Basic Mechanisms, 301, 179-201.
[42] Abreu, P. A., Dellamora-Ortiz, G., Leão-Ferreira, L. R., Gouveia, M., Braggio, E., Zalcberg, I., Santos, D. O., Bourguinhon, S., Cabral, L. M., Rodrigues, C. R., Castro, H. C. (2008). DNA methylation: a promising target for the twenty-first century. Expert
opinion on therapeutic targets, 12(8), 1035-1047.
[43] Kim, G. D., Ni, J., Kelesoglu, N., Roberts, R. J., Pradhan, S. (2002). Co-operation and communication between the human maintenance and de novo DNA (cytosine-5) methyltransferases. The EMBO journal, 21(15), 4183-4195.
[44] Hsieh, C. L. (2005). The de novo methylation activity of Dnmt3a is distinctly different than that of Dnmt1. BMC biochemistry, 6(1), 6.
[45] Brenner, C., Fuks, F. (2006). DNA methyltransferases: facts, clues, mysteries.
172 [46] Dong, A., Yoder, J. A., Zhang, X., Zhou, L., Bestor, T. H., Cheng, X. (2001). Structure of human DNMT2, an enigmatic DNA methyltransferase homolog that displays denaturant-resistant binding to DNA. Nucleic acids research, 29(2), 439-448. [47] Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. (2003). The human Dnmt2 has residual DNA-(cytosine-C5) methyltransferase activity. Journal of Biological Chemistry,
278(34), 31717-31721.
[48] Liu, K., Wang, Y. F., Cantemir, C., Muller, M. T. (2003). Endogenous assays of DNA methyltransferases: Evidence for differential activities of DNMT1, DNMT2, and DNMT3 in mammalian cells in vivo. Molecular and cellular biology, 23(8), 2709-2719. [49] Ge, Y. Z., Pu, M. T., Gowher, H., Wu, H. P., Ding, J. P., Jeltsch, A., Xu, G. L. (2004). Chromatin targeting of de novo DNA methyltransferases by the PWWP domain.
Journal of Biological Chemistry, 279(24), 25447-25454.
[50] Gowher, H., Jeltsch, A. (2002). Molecular enzymology of the catalytic domains of the Dnmt3a and Dnmt3b DNA methyltransferases. Journal of Biological Chemistry,
277(23), 20409-20414.
[51] Turek-Plewa, J., Jagodzinski, P. P. (2005). The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression. Cellular and Molecular Biology
Letters, 10(4), 631.
[52] Robertson, K. D. (2005). DNA methylation and human disease. Nature Reviews
Genetics, 6(8), 597-610.
[53] Ramsahoye, B. H., Biniszkiewicz, D., Lyko, F., Clark, V., Bird, A. P., Jaenisch, R. (2000). Non-CpG methylation is prevalent in embryonic stem cells and may be mediated by DNA methyltransferase 3a. Proceedings of the National Academy of
Sciences, 97(10), 5237-5242.
[54] Lin, I. G., Han, L., Taghva, A., O’Brien, L. E., Hsieh, C. L. (2002). Murine de novo methyltransferase Dnmt3a demonstrates strand asymmetry and site preference in the methylation of DNA in vitro. Molecular and cellular biology, 22(3), 704-723. [55] Suetake, I., Shinozaki, F., Miyagawa, J., Takeshima, H., Tajima, S. (2004). DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. Journal of Biological Chemistry, 279(26), 27816-27823.
[56] Gowher, H., Liebert, K., Hermann, A., Xu, G., Jeltsch, A. (2005). Mechanism of stimulation of catalytic activity of Dnmt3A and Dnmt3B
DNA-(cytosine-C5)-173 methyltransferases by Dnmt3L. Journal of Biological Chemistry, 280(14), 13341-13348.
[57] Kareta, M. S., Botello, Z. M., Ennis, J. J., Chou, C., Chédin, F. (2006). Reconstitution and mechanism of the stimulation of de novo methylation by human DNMT3L. Journal of Biological Chemistry, 281(36), 25893-25902.
[58] Aapola, U., Liiv, I., Peterson, P. (2002). Imprinting regulator DNMT3L is a transcriptional repressor associated with histone deacetylase activity. Nucleic acids
research, 30(16), 3602-3608.
[59] Costello, J. F. (2001). Plass C. Methylation matters. J Med Genet, 38, 285-303. [60] McCabe, D. C., Caudill, M. A. (2005). DNA methylation, genomic silencing, and links to nutrition and cancer. Nutrition reviews, 63(6), 183-195.
[61] Belinsky, S. A. (2004). Gene-promoter hypermethylation as a biomarker in lung cancer. Nature Reviews Cancer, 4(9), 707-717.
[62] Jones, P. A., Baylin, S. B. (2002). The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nature reviews genetics, 3(6), 415-428.
[63] Allison, L. A. (2019). Podstawy Biologii Molekularnej. Warszawa: Wydawnictwo Uniwersytetu Warszawskiego
[64] Glozak, M. A., Seto, E. (2007). Histone deacetylases and cancer. Oncogene,
26(37), 5420-5432.
[65] Brueckner, B., Kuck, D., Lyko, F. (2007). DNA methyltransferase inhibitors for cancer therapy. The Cancer Journal, 13(1), 17-22.
[66] Stresemann, C., Lyko, F. (2008). Modes of action of the DNA methyltransferase