Układ recA-ddLMS PCR do typowania szczepów Acinetobacter sp

Układ recA-ddLMS PCR wykorzystuje polimorfizm sekwencji poprzedzającej gen recA do genomogatunkowego różnicowania szczepów Acinetobacter sp. Spodziewanym produktem analizy jest produkt PCR o długości charakterystycznej dla danego genomogatunku Acinetobacter.

6.2.6.2.1. Sekwencja markerowa i starter specyficzny

Gen recA A. baumannii ATCC 17978 ma długość 975 pz (Gene ID: 4918360), a jego sekwencja wykazuje polimorfizm genetyczny w obrębie Acinetobacter sp. Sekwencją markerową jest fragment genu recA o długości 425 pz ograniczony starterami rA1 i rA2 (rys. 42). Fragment ten jest zsekwencjonowany dla 43 szczepów należących do 23 różnych gatunków Acinetobacter. Sekwencja startera specyficznego (stRecAAc) jest komplementarna do końca 5’ sekwencji markerowej.

Rys. 42. Schemat przedstawiający położenie sekwencji markerowej oraz miejsce hybrydyzacji startera specyficznego w obrębie sekwencji genu recA w układzie recA-ddLMS PCR

Aby sprawdzić czy starter specyficzny lub/i starter uniwersalny nie tworzą niespecyficznych produktów PCR, przeprowadziłam reakcję PCR na genomowym DNA referencyjnego szczepu A. baumannii

94

ATCC 17978 (nr1, tab. 1), wykorzystując różne kombinacje starterów (tab. 39). Wyniki przedstawiłam na rysunku 43.

Startery Cel Długość produktu PCR

[pz]

1 rA1 – rA2 Amplifikacja sekwencji markerowej fragmentu genu recA 425 2 stRecAAc Amplifikacja z wykorzystaniem startera specyficznego brak produktów 3 stADP8 Amplifikacja z wykorzystaniem startera uniwersalnego brak produktów 4 stRecAAc – stADP8 Amplifkacja z wykorzystaniem startera uniwersalnego i

specyficznego brak produktów

K- stRecAAc – stADP8 kontrola ujemna reakcji PCR (bez DNA) brak produktów

Tabela 39. Startery stosowane w kolejnych mieszaninach reakcyjnych w reakcji PCR na matrycy genomowego DNA A. baumannii ATCC 17978 oraz teoretyczna długość spodziewanych produktów.

Rys. 43. Elektroforetyczny rozdział w 2% żeli agarozowym produktów amplifikacji w reakcji PCR fragmentu genu recA na matrycy genomowego DNA A. baumannii ATCC 17978; M1 - marker wielkości DNA 100- 1000,

K- kontrola ujemna reakcji PCR, 1-4 kolejne próby wg tabeli 39.

Starter specyficzny oraz starter uniwersalny nie tworzą niespecyficznych produktów pomiędzy sobą oraz na matrycy genomowego DNA A. baumannii, zatem mogą być wykorzystane w układzie recA-ddLMS PCR.

6.2.6.2.2. Wybór enzymów restrykcyjnych

Układ restrykcyjny MaeII/RsaI został dobrany na postawie porównania sekwencji fragmentu genu recA dla 22 różnych gatunków Acinetobacter oraz na podstawie genomowego DNA dla 6 różnych szczepów A. baumannii oraz 1 szczepu A. calcoaceticus. Enzym wewnętrzny (RsaI) dokonuje cięcia DNA w stałym miejscu w obrębie sekwencji markerowej (w odległości 66 pz od końca 5’ sekwencji markerowej) dla wszystkich szczepów Acinetobacter, co zostało potwierdzone metodą PCR/RFLP (rys. 44 – wynik dla wybranych szczepów należących do kompleksu ACB).

Rys. 44. Elektroforetyczny rozdział w 2% żelu agarozowym produktów trawienia restrykcyjnego amplifikowanego fragmenu genu recA enzymem RsaI (PCR/RFLP); (a) amplifikowany fragment genu recA o długości 425pz (sekwencja markerowa), (b) fragment DNA o długości 359 pz powstały po

trawieniu fragmentu 425 pz enzymem RsaI (drugi fragment o długości 66 pz ze względu na niewielki rozmiar jest niewidoczy na żelu); M1-marker wielkości DNA 100-1000, 1-10 szczepy kliniczne Acinetobacter spp., Ab1, Ab2, Ac2, Ac2, Ap, An, 1/3, c-to13TU – szczepy referencyjne i wzorcowe

(wg tab. 1,2).

95 Aby wybrać enzym zewnętrzny (MaeII) przeprowadziłam teoretyczną analizę porównawczą sekwencji 7 szczepów Acinetobacter, dla których dostępna jest sekwencja genomowego DNA. Pod uwagę wzięłam sekwencję fragmentów restrykcyjnych powstałych po trawieniu genomowego DNA enzymem RsaI, zawierających wewnątrz sekwencję markerową (fragmenty RsaI - RsaI). Podobieństwo sekwencji poprzedzającej gen recA dla szczepów tego samego gatunku wynosi 99% (analiza porównawcza wykonana w programie VNTI, pkt.5.2.12) . Wybrałam enzym MaeII, który trawi DNA w różnej odległości od końca 5’

sekwencji markerowej dla szczepów A. baumannii i A. calcoaceticus (tab. 40).

Lp Gatunek szczep GenBank

7 A. calcoaceticus PHEA-2 NC_016603.1 729 (761)

Tabela 40. Teoretyczna długość fragmentów specyficznych oraz produktów PCR dla referencyjnych szczepów Acinetobacter sp.

Przeprowadziłam pełną analizę metodą recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/RsaI dla dwóch szczepów referencyjnych: (1) A. baumannii i (2) A. calcoaceticus. Reakcję PCR przeprowadziłam w dwóch układach: (a) specyficznym, z zastosowaniem startera specyficznego i uniwersalnego oraz (b) niespecyficznym, z zastosowaniem jedynie startera uniwersalnego. Wyniki zostały przedstawione na

rysunku 45.

Rys. 45. Elektroforetyczny rozdział w 2% żelu agarozowym produktów PCR metodą recA-ddLMS PCR dla dwóch referencyjnych szczepów (1) A. baumannii i (2) A. calcoaceticus, w dwóch układach: (a) specyficznym z udziałem startera specyficznego i uniwersalnego, (b) niespecyficznym, z udziałem startera uniwersalnego; M1 – marker wielkości DNA

100-1000, K- kontrola ujemna reakcji PCR.

Otrzymałam produkty specyficzne o długości zgodnej z wartością teoretyczną (tab. 40). Długość produktu dla A. baumannii znacząco różni się od produktu otrzymanego dla A. calcoaceticus, co ułatwia prawidłową identyfikację gatunkową. Wybrany układ enzymów MaeII/RsaI nie generuje fragmentów niespecyficznych, o czym świadczy negatywny wynik reakcji PCR z wykorzystaniem wyłącznie startera uniwersalnego (próba b).

Układ MaeII/RsaI do typowania genomogatunków Acinetobacter przedstawiłam na rysunku 46.

96

Rys. 46. Schemat przedstawiający położenie miejsc restrykcyjnych oraz miejsc hybrydyzacji starterów względem sekwencji markerowej w układzie recA-ddLMS PCR MaeII/RsaI; długość specyficznego produktu PCR uwzględnia długość adaptora (zaznaczono linią przerywaną).

6.2.6.2.3. Specyficzność układu recA-ddLMS PCR

Badanie specyficzności metody recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/RsaI przeprowadziłam doświadczalnie na 40 szczepach należących do gatunków: E. coli, E. faecium, E. faecalis, S. aureus, S. agalactiae, S. marcescens, K. oxytoca i K. pneumoniae (po 5 szczepów z każdego gatunku). Dla wszystkich wymienionych szczepów nie uzyskałam produktu PCR (wynik negatywny, rys. 47).

Rys. 47. Elektroforetyczny rozdział w 1,5% żelu agarozowym produktów PCR uzyskanych metodą recA-ddLMS PCR dla szczepów Acinetobacter ACB oraz szczepów bakteryjnych nie należących do rodzaju Acinetobacter ; M2 – marker wielkości DNA 100-3000,

K- kontrola ujemna reakcji PCR.

Mieszaninę genomowego DNA różnych szczepów bakteryjnych nie należących do rodzaju Acinetobacter, zmieszałam z genomowym DNA referencyjnego szczepu A. baumannii ATCC 17978 (nr 1, tab. 4) w proporcji 1:1 i przeprowadziłam typowanie metodą recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/RsaI, sprawdzając wrażliwość metody na kontaminację (tab. 41). Wyniki przedstawiłam na rysunku 48.

próba

Genomowe DNA dodane do etapu trawienia w metodzie

recA-ddLMS PCR Spodziewany wynik

analizy DNA A. baumannii

ATCC 17978

mieszanina DNA bakterii innych gatunków

1 + - produkt 276 pz

2 + + produkt 276 pz

3 - + brak produktu PCR

Tabela 41. Genomowe DNA dodawane do kolejnych prób analizowanych metodą recA-ddLMS PCR.

97

Rys. 48. Elektroforetyczny rozdział w 2% żelu agarozowym produktów PCR uzyskanych metodą recA-ddLMS PCR dla prób zawierających genomowe DNA A. baumannii ATCC 17978 oraz DNA innych bakterii; M1-

marker wielkości DNA 100-1000, 1-3 kolejne próby wg tab. 41.

Wprowadzenie na etapie trawienia restrykcyjnego DNA innego gatunku bakterii nie wpływa na wynik analizy. Produkt specyficzny otrzymałam tylko dla próby 1 i 2, gdzie DNA A. baumannii było obecne. Wprowadzenie na etapie trawienia restrykcyjnego DNA innego gatunku bakterii (nie należącego do rodzaju Acinetobacter) nie wpływa na wynik analizy. Negatywny wynik w próbie 3 potwierdza specyficzność układu względem Acinetobacter.

6.1.6.2.4. Typowanie Acinetobacter spp.

W celu sprawdzenia potencjału różnicującego metody recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/RsaI przebadałam 25 szczepów Acinetobacter należących do kompleksu ACB. Wyniki przedstawiłam na rysunku 49.

Rys. 49. Elektroforetyczny rozdział w 1% żelu agarozowym wyników typowania metodą recA-ddLMS PCR MaeII/RsaI referencyjnych i klinicznych szczepów Acinetobacter z komplekcu ACB; M2 - marker wielkości DNA 100-3000, 1 -10 szczepy kliniczne i środowiskowe, Ab1, Ab2, Ac1, Ac2, Ap, An,

1/3, C-to-13TU – szczepy referencyjne i wzorcowe (wg tab. 1,2), K- kontrola ujemna reakcji PCR.

Wstępne badania wykazały, że metoda recA-ddLMS PCR z w układzie enzymów MaeII/RsaI pozwala specyficznie typować szczepy Acinetobacter należące do kompleksu ACB. Dla wszystkich badanych szczepów otrzymałam jeden produkt PCR, którego długość (obliczona za pomocą programu Quantity One 4.3.1, pkt. 5.2.15) jest stała dla danego genomogatunku. (tab. 42).

Lp Gatunek (symbol)

Wielkość produktów amplifikacji otrzymanych w wyniku typowania metodą recA-ddLMS PCR w układzie MaeII-RsaI

[pz]

1 Acinetobacter baumannii (Ab) 276

2 Acinetobacter calcoaceticus (Ac) 761

3 Acinetobacter pittii (Ap) 382

4 Acinetobacter nosocomialis (An) 444

5 Acinetobacter „between 1 and 3” (1/3) 553

6 Acinetobacter „close to 13TU” (c-to-13TU) 337

Tabela 42. Przybliżone długości produktów PCR otrzymanych w wyniku analizy szczepów Acinetobacter spp. metodą recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/RsaI.

98

Aby sprawdzić czy układ recA-ddLMS PCR jest użyteczny w typowaniu innych genomogatunków Acinetobacter spp. przeprowadziłam doświadczenie, w którym pełnej analizie poddałam 23 referencyjne szczepy Acinetobacter należące do 21 genomogatunków (tab. 1). Wyniki przedstawiłam na rysunku 50.

Rys. 50. Elektroforetyczny rozdział w 1% żelu agarozowym wyników typowania metodą recA-ddLMS PCR w układzie MaeII/RsaI referencyjnych szczepów Acinetobacter sp.(wg tab. 1); M2- marker wielkości DNA 100-3000, K- kontrola ujemna reakcji PCR.

Wynik pozytywny (produkt PCR) otrzymałam tylko dla 9 różnych genomogatunków Acinetobacter, w tym 6 należących do kompleksu ACB. Dla pozostałych genomogatunków wynik typowania jest negatywny (brak produktu PCR). Prawdopodobnie u tych genomogatunków miejsce trawienia enzymem RsaI znajduje się bliżej końca 5’ sekwencji markerowej, niż miejsce trawienia enzymem MaeII (w wyniku trawienia fragment restrykcyjny zawierający sekwencję markerową jest obustronnie trawiony enzymem RsaI i nie łączy się z adaptorem, w skutek czego nie może być amplifikowany w reakcji PCR).

Metoda recA-ddLMS PCR daje czytelny wynik, dużo łatwiejszy w interpretacji, niż metoda recA-PCR/RFLP-Tsp509I. Zakres typowalności obejmuje szczepy ważne pod względem klinicznym, których identyfikacja fenotypowa nastręcza wiele trudności. Brak produktu PCR nie wyklucza przynależności badanego szczepu do Acinetobacter, wyklucza natomiast szczep nie należący do kompleksu ACB.