Ustalanie konfiguracji E i Z tiosemikarbazonów za pomocą spektroskopii NMR

Problem precyzyjnego określenia konfiguracji substancji biologicznie aktyw nej ma szczególne znaczenie w chemii m edycznej, zwłaszcza od czasu tragicznych eksperym entów z Talidom idem 195. Dzięki dobrze rozw iniętym m etodom spektroskopii N M R, takich jak 2D-NOESY m ożem y pokonać trudności związane z identyfikacją izom erów E i Z tiosem ikarbazonów . W przypadku prostych ste re o izom erów (układ C=C) m ożem y je odróżnić na podstaw ie porównania w artości stałej sprzężenia 3Jh-h, która dla każdego z nich jest inna. Dla izom eru Z stała sprzężenia mieści się w zakresie 6-12 Hz, zaś dla izom eru E w ynosi od 12 do 18 Hz196.

W artości stałych sprzężenia l/H.H dla prostych izom erów E i Z

IZOMER Z IZOMER E

A B A H

\ /

H H H

J= 6-12 Hz J= 12-18 Hz

W przypadku pochodnych imin (-H C = N -) sytuacja jest jednak bardziej skom plikowana, gdyż brak jest sprzęgającego się drugiego pro to nu H -C = C -H . Stąd nie m ożem y p orów nyw ać stałych sprzężenia, gdyż nie są one rejestrow ane. Z pomocą przychodzi nam tutaj dw uw ym iarow a spektroskopia N M R , a zwłaszcza takie m etody jak spektroskopia korelacyjna NMR 2D-NOESY (ang. Two Dimensional Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy). Efekt Overhausera m ożem y tutaj w skrócie w ytłum aczyć, jako efekt wzm ocnienia lub też osłabienia sygnału rezonansowego p ro to n u , któ ry znajduje się blisko przestrzennie do p rotonu naśw ietlanego197. Zjawisko to , jest obserw ow alne dla p ro to n ó w oddalonych od siebie o maksymalną odległość 4-5 A. W idm a NOESY wizualnie przypom inają widm a COSY z tym , że rejestrow ane są tutaj oddziaływ ania d ipol-d ip ol p ro to n ó w przez przestrzeń. Intensyw ność pików pow stałych w czasie pom iaru zależy od tzw . czasu mieszania xm (ang. mixing timie). Im większy czas mieszania, tym większy efekt O verhausera jest obse rw o w a ny przy jednoczesnym zm niejszeniu różnicy w intensyw ności sygnałów . Ponadto odpow iednie dobranie czasu mieszania Tm dla eksperym entu 2D-NOESY, jest pow iązane masą m ierzonej cząsteczki. Dla zw iązków o masie poniżej 400 Da czas mieszania mieści się zazw yczaj w granicach 300- 500 ms198. Podsum owując, m etoda 2D-NOESY jest w ygo d nym narzędziem badawczym w ykorzystyw an ym w :

• analizie konform acyjnej p roduktów pochodzenia naturalnego m .in. steroidów , glikokoniugatów a naw et w analizie białek,

• określaniu konfiguracji w zględnej, a w niektórych przypadkach konfiguracji absolutnej cząsteczek chiralnych.

Jako cel analizy spektroskopowej postanow iono obrać proste tiosem ikarbazony z g ru p y fenylotiosem ikarbazonów 10-12. Analiza danych litera tu ro w ych wskazuje, że p ro to n y g ru p y NH są obserw ow alne przy różnym przesunięciu chem icznym (ppm ), w zależności od konfiguracji E i Z danego heteroarom atycznego tiosem ikarbazonu199.

Najczęstszym efektem obserw ow anym w polarnych rozpuszczalnikach jest proces rów now agi, w którym pozostają obydwa izom ery, w zależności od pH ro z tw o ru 200 Zaobserw ow ano rów nież, iż izom er E dają sygnał grupy NH w zakresie 10-11 ppm, zaś izom er Z - 14-15 ppm. Ten ostatni izom er jest preferow a ny, g d y jest m ożliwe u tw orzen ie wiązania w o d o ro w e g o pom iędzy pierścieniem heteroarom atycznym a grupą N H 201.

W idm o 1H -N M R dla związku l i c

16 15 14 13 12 U 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

fl (ppm )

W idm a COSY oraz 2D-NOESY dla związku l i c COSY

12 U 10 9 8 7 6

R (ppm)

S 4 3 2 1 0

fl (ppm)

f2(ppm)

2D-N0ESY

m s96.4.*r

M«* U

•• -i— 4 — 4 — !— j— (— [-— j- - 1- - j- - f — f — f — j-— IU

d M f

\ hi

13.2 13.1 13.0 12.9 12.8 12.7 12.6 12.5 12.4 12.3 12.2 12.1 12.0 U .9 11.8 11.7 11.6 11.5 11.4 11.3 11.2 11.1 11.0 10.9 10.8 10.7 10.6 10.5 10.4

*2 (ppm)

Analizując w idm o 1H -N M R jed now ym iarow e tiosem ikarbazonu 11c, można z łatwością przypisać charakterystyczne wartości przesunięcia chem icznego (ppm ) odpow iadające pow yższym fragm entom związku:

• 11,57 p pm - poszerzony singlet grupy NH znajdującej się p rzy wiązaniu im inow ym . Zgodnie z danymi literaturow ym i przesunięcie to odpow iada izom erow i E,

• 8,74 ppm - p oszerzony singlet term inalna grupa NH podstaw iona etylem ,

• 8,00 (7,99) ppm - singlet grupy m etinow ej.

Powyższe przypisania sygnałów z widm a je d n o w ym ia ro w e go p ow inny być p o tw ie rd zo ne przez eksperym ent COSY, na którym w idać sprzęgające się sąsiadujące p ro to n y. I tak poza pikami autokorelacyjnym i m ożem y zaobserw ow ać na w idm ie punkt o koordynatach (8,73; 3,61). Pik ten potw ierdza wcześniej postulow aną tezę, że proton o wartości przesunięcia 8,73 ppm, należy do term inalnej g ru p y N H, sprzęgającej się z sąsiednimi protonam i m etylenowym i (m ultiplet p rzy 3,61 ppm, -C H 2). Kluczowych inform acji dostarcza jednak widm o 2D-NOESY. M ożna na nim zaobserw ow ać pik, który je st bezpośrednim dow odem na odziaływ anie przestrzenne pom iędzy grupą NH oraz protonem m etinow ym CH. Obecność piku (11,57; 7,99) jest bezpośrednim dow odem na to , że badany związek w ystępuje w postaci izom eru E. W przypadku izom eru Z, nie jest m ożliw e takie odziaływanie, gdyż p ro to n NH jest w zbyt dużej odległości od gru p y

m etinow ej (Rys 27)

Różnice w budow ie przestrzennej pom iędzy izom eram i E i Z tiosem ikarbazonu l i c Rys 27

IZOMER E IZOMER Z

Część syntetyczna pracy doktorskiej była realizowana z zamiarem otrzym ania heteroarom atycznych tiosem ikarbazonów, a zwłaszcza pochodnych azanaftalenów.

Przeprow adzone eksperym enty d otyczyły zarów no syntezy tiosem ikarbazydów , jak rów nież p ró b y syntezy prekursorów heteroarom atycznych z grupą karbonylow ą.

G łó w n y etap reakcji otrzym yw ania tiosem ikarbazonów był p rze p row a d za n y w polu m ikrofalow ym , zaś tytu ło w e tiosem ikarbazony były oczyszczane za pom ocą w ielokrotnej krystalizacji lub też chrom atografii kolum nowej z użyciem polarnych rozpuszczalników .

3.6.3.1 Synteza w reaktorze mikrofalowym

Od początku lat 90 XX w obserw uje się gw a łtow ny rozw ój technik prowadzenia reakcji chem icznych w polu m ikrofalow ym 202. Od tej chwili opublikow ano w iele doniesień litera turow ych opisujących syntezy związków heterocyklicznych w fazie ciekłej jak rów nież na nośnikach takich jak A l20 3 oraz żel krzem ionkow y203. Tak duże zainteresow anie badaczy tą techniką eksperym entalną jest zrozum iałe. O trzym u je się w ten sposób m i.in szereg substancji biologicznie aktyw nych204. Ponadto, reakcje p row adzon e w polu m ikrofalow ym charakteryzują się w ielom a udogodnieniam i w stosunku do klasycznej syntezy:

• następuje w yraźne skrócenie czasu reakcji

• w przypadku syntezy na nośniku stałym, nie trzeba stosow ać drogich rozpuszczalników (zielona chemia)

• w większości przypadków zwiększa się wydajność reakcji

• w niektórych przypadkach następuje ułatwienie oczyszczania finalnego produktu

Należy jednak podkreślić, że nie ma d o w o d ó w naukowych na obecność specyficznego

„efektu m ikrofalow ego"205. Poprawa wydajności reakcji oraz skrócenie jej czasu, nie są związane z obniżeniem energii aktywacji dla danej reakcji. M o że m y m ówić tutaj

je d ynie o efektach związanych m iejscowym i efektami przegrzania próbki (efekty term iczne) oraz ogrzewaniem w całej jej masie206. Przykładem takich term alnych efektów jest w oda, która podgrzewana w reaktorze m ikrofalowym do tem p era tu ry 200 - 300 °C zmienia wartość stałej dielektrycznej (e), zachowując się jak rozpuszczalnik organiczny207

W Zakładzie Chemii Organicznej U niw ersytetu Śląskiego prow adzon e są badania dotyczące syntezy związków organicznych wspom agane reaktorem m ikrofalow ym 208. Przeprow adzone eksperym enty p ozw oliły na opracow anie m etodyki badawczej w syntezie związków heterocyklicznych, a zwłaszcza azanaftalenów 209.

Postanowiłem zatem zoptym alizow ać wcześniej opracow ane protokoły eksperym entalne i przystosować je do syntezy heteroarom atycznych tiosem ikarbazonów .

Kluczow y etap syntezy tiosem ikarbazonów - addycję /V-nukleofili do grupy karbonylow ej (Schem at 4), przeprow adzano w reaktorze m ikrofalow ym C EM - DISCOVERY. Do reakcji używano polarnych rozpuszczalników takich jak etanol, 2 -propanol, acetonitryl oraz DMF. Jako katalizatora reakcji używ ano lodow atego kwasu octo w e g o . W yjątek stanowiła seria zw iązków 10-11, dla której reakcja niekatalizowana miała taką samą wydajność, jak ta z dodatkiem CH 3C O O H . P rzeprow adzono rów nież p ró b y syn te zy tiosem ikarbazonów na żelu krzem ionkowym jako nośniku. N iestety, z p ow odu praw dopodobnego rozkładu tiosem ikarbazydu w tem peraturze topnienia, reakcja nie zachodziła (analiza TLC ekstraktu). Zaobserw ow ano brak istotnej różnicy w w ydajności reakcji w funkcji m ocy reaktora (standardow o stosow ano moc 50 W ).

O ptym alizację czasu reakcji p row adzono eksperym entalnie dla każdej podgrupy zw iązków ; jako przykład podano związek 2a (Rys 28).

G łó w n y etap syntezy tiosem ikarbazonów

R i R H,N

H H

MW

R 1r R 2( R3= H, alkil, a ry l

T

NH

3 \

A

_H

Rys 28

W ydajności reakcji tw orzenia tiosem ikarbazonu 2a w funkcji czasu

100 90 80

& 70 IT 60(OQ)

'ł/ł 50 O .= 40

■ore 30 20 10 0

10 15 20 25 30 35 40 45 50

Czas reakcji [m in]

Zaprojektow ane tiosem ikarbazydy o trzym yw an o w g zm odyfikow anych przeze mnie d w óch p ro ce d u r210,211 (Schem at 5). W pierwszej z przedstaw ionych reakcji używ ano disiarczku węgla jako donora grupy tiokarbonylow ej oraz kwasu chlorooctow ego.

Pow stały półprodukt, pochodną kwasu (tiokarbam oilo)tiooctow ego ogrzew ano w obecności w odzianu hydrazyny, otrzym ując fina lny tiosem ikarbazyd. Procedura ta posiada jednak liczne utrudnienia. U żyw a n y do reakcji disiarczek węgla jest silnie toksyczny dla układu nerw ow ego, a cała procedura jest efektyw na dla amin z relatyw nie małą zawadą steryczną.

Schem at 5

S

O

N— R S

Jedna z nowocześniejszych metod otrzym yw ania pochodnych tiom ocznika została opisana przez grupę Katritzky'ego212. U żyw a ł on pochodnych bis(benzotriazolilo)tiom ocznika jako ekw iw alentów izotiocyjanianów , otrzym ując w rezultacie A/-podstawione tiosem ikarbazydy. Związki pow yższego typ u oraz ich sole, są w yjątk ow o reaktyw ne względem A/-nukleofili213. Modyfikacja pierw otn ej m etody Katritzky'iego poprzez zastąpienie pochodnej benzotriazolilow ej układem zawierającym fragm ent bis(im idazoilowy) lub jego sół, została zoptym alizow ana dla pochodnych mocznika oraz tiom ocznika214. W pow yższej reakcji pochodna bis(im idazoilo)tiom ocznika ogrzewana z /V-podstawioną piperazyną tw o rz y półprodukt, który reaguje dalej z wodzianem hydrazyny tw orząc ostatecznie tiosem ikarbazyd (Schemat 5). O trzym ane tiosem ikarbazydy zaprezentow ano w Tabeli 10.

Tabela 10

Przykłady otrzym anych tiosem ikarbazydów

Nr Struktura Wydajność [%] Temp. topnienia [°]

15a H 1

15d

3.6.3.3 Synteza benzoilowych pochodnych kwasu pirazynowego

Podczas projektow ania prekursorów karbonylow ych niezbędnych do syntezy tiosem ikarbazonów , zaobserw ow ano w ysokie p od o b ień stw o strukturalne b e n zo ilo p iryd yn y do pochodnych benzoilow ych kwasu pirazynow ego (Rys 29).

Pochodne te , charakteryzują się wysoką aktyw ność biologiczną, zarów no p rze ciw n o w o tw o ro w ą jak i przeciw grzybiczną191,215. Ponadto wcześniejsze prace sugerują184, że pirazynotiosem ikarbazony mogą być związkam i m odelow ym i do otrzym yw an ia nowej generacji chelatorów żelaza.

W ybrane prekursory karbonylow e do syntezy tiosem ikarbazonów

i ^ S

N' ' ' N ' ^ ' 'N '

keton dipirydylow y benzoilopirydyna kwas 2-benzoilopirazynowy

Reakcje otrzym yw ania pochodnych kwasu pirazynow ego b yły prow adzone w warunkach silnie utlenianiających. Do przeprow adzenia reakcji zastosow ano następujący układ oksydacyjny: w odoronadtlenek te rt-b u tylu , FeS04, kwas siarkowy, lo d o w a ty kwas o cto w y. G eneruje on w reakcji typu Fentona, ogrom ne ilości niezwykle reaktyw nego rodnika hydroksylow ego. Dokładny mechanizm tej reakcji, polega na w ytw o rze n iu odpow iedniego rodnika acylow ego, który zachow ując się jak nukleofili, ulega addycji do pochodnej kwasu pirazynow ego, a następnie procesow i rearom atyzacji216. G łów nym produktem utleniania rodnikow ego są tutaj pochodne aldehydu stosow anego do reakcji- w tym przypadku o trzym yw a n o głów nie kwasy hydroksysalicylow e (Schemat 6), stąd wydajności o trzym yw ania pochodnych benzoilopirazyny nie przekraczają 30%. Dodatek kwasu o cto w ego poprawia rozpuszczalność substratu podczas wkraplania m ieszaniny utleniającej, w obniżonej tem peraturze. Zachowanie obniżonej tem peratury w pierw szych 30 m inutach reakcji ma kluczowe znaczenie w otrzym yw aniu produktu, gdyż lim ituje tw o rzen ie interesującego nas produktu ubocznego216'217.

.O H tert-BuOOH FeS04, H2S04> CH3C02H

.O H

t V >

OH O

X= OH, NH2

Tabela 11

O trzym ane pochodne kwasu pirazynow ego, w ydajności ich tw orzen ia oraz te m p e ra tu ry topnienia.

W celu sprawdzenia właściwości kompleksujących dla układu benzoilopirazynow ego, przeprow adzono reakcje jego kompleksowania przy użyciu h ydryd o w e g o kompleksu ru te n u - RuHCI(CO)(PPh3⁾3^{192. Kompleks ten, wykazuje} niezw ykle interesujące właściwości fizykochem iczne, pozwalające na dogodne koordynow anie ligandów N- d on o ro w ych , co zostało potw ierdzone badaniami zespołu d r hab. Jana M ałeckiego218'219. U gandy h ydryd o w e posiadają bardzo silne właściwości a -d o n o ro w e , pozwalające na kompensację deficytu elektronow ego metalu w kompleksie. Pochodne p irazyny wykazują ciekawe właściwości fizykochem iczne, sp ow od ow a n e nisko położonym nieobsadzonym orbitalem ti oraz ich zdolnością do tw orzenia układów m ostkow ych219.

Rys 30

Struktura krystalograficzna kompleksu rutenu z kwasem benzoilopirazynow ym

Po uzyskaniu prekursorów karbonylow ych kw asów (am idów ) kwasu pirazynow ego p rze prow ad zo no próby syntezy odpow iednich tiosem ikarbazydów . Niestety, bazując na wynikach spektroskopii NM R oraz IR a także spektrom etrii mass, nie udało się otrzym ać zaprojektowanych tiosem ikarbazonów. Niesatysfakcjonujący w ynik syntezy m oże być sp ow od o w an y następującym i przyczynam i:

• obecnością intram olekularnego wiązania w o d o ro w e g o pom iędzy grupą -O H w pozycji a do grupy karbonylow ej. Obecność takiego wiązania potw ierdza w ykonane w idm o spektroskopii w podczerw ieni (3200 - 3000 cm '1). Tak silne w iązanie w o d o ro w e w pływ a na obniżenie ujem nego ładunku cząstkowego na atom ie tlenu i utrudnia addycję A/-nukleofila do g ru p y ka rbonylow ej. Podobne efekty związane z obecnością silnego wiązania w o d o ro w e g o w cząsteczce heterocyklicznej można zaobserw ow ać na przykładzie genisteiny220(Rys 31).

• konkurencyjną reakcją tiosem ikarbazydu z grupą karboksylową pochodzącą od kwasu pirazynow ego. Grupa ta, wykazuje większą reaktyw ność w porów naniu do g ru p y karbonylow ej. Potw ierdziły to analizy widm a 13C -N M R , na którym praktycznie brak charakterystycznych sygnałów pochodzących od węgla im inow ego (C=N) p rzy około 155-145 ppm. Podczas oczyszczania produktu reakcji nie udało się jednak w yo d rę b n ić m ożliw ego produktu reakcji pochodnej 1,3,4-tiadiazolu (Schemat 7)221. W idm o 13C -N M R m ieszaniny reakcyjnej wskazuje na brak węgla karboksylowego (pik przy około 170 ppm ) oraz węgla C=S (pik przy 180 ppm ) w układzie reakcyjnym , co m oże św iadczyć o proponow anym m echanizm ie. Praw dopodobnie otrzym any produkt jest n ie trw a ły i rozkłada się na żelu krzem ionkowym podczas oczyszczania chrom atograficznego.

Porów nanie struktur genisteiny oraz kwasu 2 -[5 -(2 -h yd ro k sy-b e n zo ilo )]- pirazynokarboksylow ego

kwas 2-[5-(2-hydroksy-benzoflo)]pirazynokarboksylowy genlstelna

Schemat 7

P roponow any schemat otrzym yw ania pochodnych 1,3,4-tiadiazolu

H+

H,N '

,ISL H .NH2

N— N

Brak aktyw ności p rze ciw no w o tw o ro w e j dla prekursorów benzoilopirazynow ych oraz kłopoty z uzyskaniem ich pochodnych tiosem ikarbazonow ych, w p łyn ę ły na zawieszenie tego wątku syntetycznego.

3.6.3.4 Synteza prekursorów karbonylowych z układem acetylenowym . Reakcja Sonogashiry

Prekursory karbonylowe zawierające wiązanie potrójne połączone z do pierścieniem fenylow ym zostały zsyntezow ane w g zm odyfikow anej procedury reakcji Sonogashiry222. Reakcja ta, należy do szerokiej g ru p y reakcji sprzęgania, w której halogenek arylo w y reaguje z odpow iednim term inalnym alkinem w obecności katalizatora palladowego i soli m iedzi(l). W poniższej reakcji (Schemat 8) kompleks palladu(ll) ulega oksydatywnej addycji do halogenku alkilowego, tw o rzą c w rezultacie kompleks w kształcie płaskiego kwadratu. Kolejnym etapem reakcji jest transmetalacja n o w o pow stałego kompleksu acetylenkiem m iedzi, po czym ligandy w tym że kom pleksie, ulegają reakcji izom eryzacji. Kompleks posiadający już właściwą orientację przestrzenną (form a c/s) uwalnia cząsteczkę produktu, w wyniku reduktywnej elim inacji, zaś kompleks palladu się odtw arza.

W zastosowanym układzie reakcyjnym jako katalizatorów reakcji używano chlorku palladu(ll) oraz chlorku bis(trifenylofosfino)palladu(ll), w obecności trife n ylo fo sfin y, trietyloam iny oraz jodku m iedzi(l) (Schemat 8). Reakcję prow adzono w warunkach beztlenow ych przepuszczając przez układ azot w ciągu 15 minut. Po reakcji produkt g łó w ny oczyszczano na kolum nie chrom atograficznej w układzie octan e tylu : heksan. W przypadku otrzym yw ania pochodnej alkinowej zabezpieczonej grupą trim etylo sililow ą , przeprow adzano reakcję usuwania g ru p y zabezpieczającej w obecności K2^{C O}3 w m etanolu. Powyższa reakcja przebiega w sposób ilościowy.

Reakcje tw o rzen ia odpow iedniego tiosem ikarbazonu przeprow adzano w reaktorze m ikrofalow ym w edług wcześniej opracow anych p ro ce d ur (Rozdział 5.4). Badania aktyw ności p rze ciw no w o tw o ro w e j dla otrzym anych tiosem ikarbazonów wykazały, że otrzym ane związki nie wykazują aktyw ności p rze ciw n o w o tw o ro w e j dlatego zaw ieszono dalsze syntezy związków serii 13

Struktury otrzym anych fenyloacetylenow ych tiosem ikarbazonów oraz wydajności ich

Schemat reakcji Sonogashiry wraz z proponow anym mechanizm em

P ostanow iono sprawdzić hipotezę, zakładającą iż tiosem ikarbazonow e kom pleksy żelaza generują reaktywne fo rm y tlenu w reakcji Fentona. Badania p rze prow a d zo n o w zespole prof, dr hab. Tadeusza Sarny (Zakład Biofizyki UJ, W ydział Biochem ii Biofizyki i Biotechnologii UJ) w e w sp ółp racy z doktorem Andrzejem Żądło.

P rzeprow adzone eksperym enty pułapkowania spinow ego, pozwalają na obserwację param agnetycznych adduktów rodnika hydroksylow ego z D M PO . Eksperym enty

tiosem ikarbazonow ym , zastosowano dodatkow y reduktor (kwas askorbinow y) do reakcji Fentona.

Rys 32

W idm a spektroskopii EPR z pułapkowania spinowego kompleksu żelaza(ll) z /V-etylo-2- [(8-hydroksychinolin-2-ylo)m etyleno]hydrazynotiokarboam idem

50%CH3OH Os 0,2%TX-100 Os 1%TX-100 Os

Indukcja magnetyczna [mT] Indukcja magnetyczna [mT] Indukcja magnetyczna [mT]

50%CH3OH 112s 0,2%TX-100 112s 1%TX-100 112s

Indukcja magnetyczna [mT] Indukcja magnetyczna [mT] Indukcja magnetyczna [mT]

50% CH3OH 449s

J. 1^

i - i

c

T - r - r T*

336 336 340 342 Indukcja magnetyczna [mT]

0,2%TX-100 449s

Indukcja magnetyczna [mT]

1%TX-100 449s

Indukcja magnetyczna [mT]

R ysunek 32 można podzielić na kilka fragm entów , w zależności od użytego rozpuszczalnika oraz czasu pułapkowania. W kolum nie po lewej stronie znajdują się widm a z w yraźnym sygnałem pochodzącym od rodnika karbocentrycznego (a właściwie jego adduktu z DM PO). Rodnik ten pow stał zapew ne w skutek reakcji bardzo reaktyw nego rodnika hydroksylow ego z rozpuszczalnikiem organicznym jakim był m etanol. Co ciekawe, zaobserw ow ać można rów nież fakt, że sygnał rodnika karbocentrycznego słabnie w funkcji czasu. W celu w yelim inow ania sygnału rodnika karbocentrycznego przeprow adzano p ró b y zm iany rozpuszczalnika organicznego.

O statecznie, ze względu na niską rozpuszczalność kompleksu w roztw orach w odnych zastosow ano w o d n y ro ztw ór środka p ow ierzchn io w o czynnego tw orzącego m icele- T rito n u X. Centralna oraz prawa kolumna obrazują sygnały rodnika hydroksylow ego, którego sygnał nie słabnie w funkcji czasu. W yniki eksperym entu jednoznacznie potw ierdzają tezę, iż tiosem ikarbazonowe kompleksy żelaza generują ROSy w reakcji Fentona. przeprow adzone badania zgadzają się z najnow szym i doniesieniam i lite ra tu ro w ym i223.

1. O trzym ano 8 tiosem ikarbazydów oraz odpowiadające im prekursory. Związki zsyntezow ano w edług dw óch ogólnych procedur z użyciem disiarczku węgla oraz bis(im idazolilo)tioketonu. Dla jednego tiosem ikarbazydu w yzn aczon o strukturę krystalograficzną.

2. Przeprow adzono syntezy prekursorów karbonylow ych, pochodnych kwasu pirazynow ego oraz acetylenow ych pochodnych benzaldehydu. N iestety nie udało się otrzym ać tiosem ikarbazonów z o dpow iednich kwasów b enzoilopirazynow ych. Pochodne fenyloacetylenow e okazały się nieaktywne biologicznie.

3. O pracow ano m etodykę syntezy tiosem ikarbazonów w polu m ikrofalow ym , co za ow ocow ało otrzym aniem 67 (hetero)arom atycznych tiosem ikarbazonów . Dla wszystkich tiosem ikarbazonów oznaczono ich działanie p rze ciw n o w o tw o ro w e , zaś dla tiosem ikarbazonów serii 1, 2, 10-12 oznaczono aktywność przeciw grzybiczą oraz właściwości hamujące fo to syn te tyczn y transfer elektronów .

3. Dwa spośród otrzym anych związków (4b, 5c) wykazują bardzo dużą aktywność prze ciw n o w o tw o ro w ą . Związek 5c charakteryzuje się bardzo wysokim indeksem terapeutycznym , zaś związek 4b wykazuje największą z dotychczas opisanych, w tej klasie zw iązków , aktywność p rze ciw n o w o tw o ro w ą (ICso= 0,3 nM ). Badania w ykonane przy w spółpracy z Instytutem Fizyki UŚ p o zw o liły na wykazanie wysokiej synergii związku 4b w skojarzonej terapii TSC-PD T

4. Konfigurację E i Z dla poszczególnych tiosem ikarbazonów określano za pom ocą spektroskopii ^ -N M R oraz eksperym entu 2D-NOESY. Badania spektroskopow e zostały uzupełnione poprzez m etody rentgenografii strukturalnej.

5. Dla poszczególnych klas zw iązków w ykonano pom iary krzyw ych izozbestycznych, potw ierdzających kom pleksowanie ligandów tiosem ikarbazonow ych poprzez kationy Fe3+.

6. M e to d y pułapkowania spinowego EPR, p ozw oliły na udow odnienie generowania rodnika hydroksylow ego w reakcji Fentona, przez kompleks TSC -Fe(ll).

5. CZEŚĆ EKSPERYMENTALNA

Te m pe ra tu ry topnienia substancji krystalicznych oznaczano w dedykow anych, szklanych kapilarach za pom ocą aparatu firm y O ptim elt MPA100 instrum ent (SRS, zam kniętych, szklanych probówkach (system zamykania probów ek firm y Sigma- A ldrich). Chrom atografie kolum nowe w ykonyw ano w kolum nach w ype łnio nych żelem krzem ionkowym (silicagel 60, 70-230 mesh, M erck). Do chrom atografii cienkow arstw ow ych stosow ano alum iniowe płytki chrom atograficzne firm y M erck pokryte żelem krzem ionkowym 60 F254 (grubość w a rstw y 0,2 mm). Plamki na płytkach chrom atograficznych o bserw ow ano w świetle lampy U V p rzy długości fali 254 lub 365 nm, bądź w yw o ływ a n o w komorze nasyconej parami jo du . Chrom atografię preparatyw ną w yko n yw a n o na aparacie BUCHI Sepacore® zaopatrzonym w kolektor frakcji oraz detektor U V -V IS (pom iar długości fali przy 359 nm). Dodatkow e analizy czystości zsyntezow anych prod uk tów w ykonyw ano przy użyciu aparatu

N iskorozdzielcze widm a m asowe LRMS (ESI) były w yko n yw a n e za pom ocą aparatuVarian LC-920. Badanie w ysokorozdzielczej spektrom etrii masowej w yko nyw ano używając aparatów : Finnigan MAT95 spectrom eter (Therm oFinnigan, San Jose, CA, USA) oraz M arin er ESI-TOF (Applied Biosystem s), używ ając soli sodow ej glikolu polietylenow ego 400 jako wzorca.

Eksperym enty pułapkowania spinowego w yko nyw a no używając aparatu BRUKER EM X

Eksperym enty pułapkowania spinowego w yko nyw a no używając aparatu BRUKER EM X

W dokumencie Synteza i aktywność biologiczna nowych analogów tiosemikarbazonowych chelatorów żelaza (Stron 76-200)