W PŁYW STĘŻENIA I RODZAJU SUBSTRATU NA STYMULACJĘ PROCESU

% ]

Rys. 32. Wpływ stężenia ramnolipidu na ubytek substratu.

6.7.2. W

Postęp procesu biodegradacji zależy od składu chemicznego produktów naftowych. Na podstawie analizy GC-MS okazało się, że ropa naftowa GROBLA zawierała węglowodory o liczbie atomów węgla C7-C30. Wśród indywidualnych związków, zarejestrowanych na chromatogramie, największy udział miały n-alkany oraz izoparafiny, wśród których najwięcej było węglowodorów izoprenoidowych: pristanu (2,6,10,14-tetrametylopentadekan) i fitanu (2,6,10,14-tetrametyloheksadekan). W grupie węglowodorów cykloparafinowych w największych ilościach występowały n-alkilocykloheksany zawierające łańcuchy alifatyczne od C2 do C22. W grupie jednopierścieniowych węglowodorów aromatycznych występował toluen i alkilowe pochodne benzenu zawierające podstawniki C2-C4. Alkilobenzeny o dłuższych łańcuchach (zawierające do C15) występowały w znacznie mniejszych ilościach. Spośród WWA najwięcej było dwu- i trójpierścieniowych aromatów: naftalenu oraz C1 i C₂ naftalenów, a także fenantrenu. Znacznie mniej było antracenu i czteropierścieniowych WWA. Nie było natomiast 5-ciopierścieniowych WWA, w tym benzo[a]pirenu. W badanej ropie naftowej zidentyfikowano związki heteroaromatyczne zawierające siarkę: dibenzotiofen oraz C1, C₂ i C₃ dibenzotiofeny.

Produkty naftowe są zróżnicowane pod względem składu chemicznego. Do badań nad wpływem rodzaju i stężenia substratu na proces biodegradacji zanieczyszczeń naftowych wybrano frakcję destylacyjną ropy naftowej o temperaturze wrzenia 180-350 °C (frakcja olejowa) oraz frakcję o temperaturze wrzenia powyżej 350 °C stanowiącą pozostałość po destylacji ropy naftowej (frakcja ciężka). Badane frakcje różniły się składem chemicznym oraz podatnością na biodegradację. Frakcja olejowa zawierała więcej składników bardziej podatnych na rozkład mikrobiologiczny niż frakcja ciężka. Natomiast biodegradacja frakcji ciężkiej była utrudniona ze względu na zawartość składników trudnobiodegradowalnych. Dokładną analizę składu chemicznego obu frakcji zawierają poniższe rozdziały.

6.7.2.1. BIODEGRADACJA FRAKCJI CIĘŻKIEJ

Analiza GC-MS wykazała, że frakcja ciężka była mieszaniną węglowodorów C17-C30, w której głównymi indywiduami były n-alkany (Rys. 33). Wśród węglowodorów izoparafinowych najwięcej było fitanu, a w grupie cykloparafin - alkilocykloheksanów z podstawnikami o łańcuchach zawierających od 10 do 23 atomów węgla. Zidentyfikowano również obecność węglowodorów aromatycznych takich jak: alkilobenzeny z podstawnikami o długości łańcuchów od 10 do 21 atomów węgla, fenantren, antracen oraz czteropierścieniowe węglowodory aromatyczne. Głównym reprezentantem związków heteroaromatycznych był dibenzotiofen oraz jego alkilowe pochodne o łańcuchach od 1 do 3 atomów węgla.

Rys. 33. Chromatogram GC-FID frakcji ciężkiej ropy naftowej GROBLA.

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 5000000 5500000 6000000 6500000 7000000 Time--> Abundance TIC: G3-2.D

Wpływ ramnolipidu na skuteczność procesu biodegradacji ciężkiej frakcji ropy naftowej GROBLA oceniono w oparciu o analizę ubytku węglowodorów w hodowlach prowadzonych w obecności ramnolipidu w stężeniu 80 mg/l oraz bez ramnolipidu. Zbadano również wpływ stężenia substratu na skuteczność biodegradacji, ponieważ wiadomo, że węglowodory w odpowiednim stężeniu działają toksycznie na mikroorganizmy. Przeprowadzone badania potwierdziły pozytywny wpływ ramnolipidu wyizolowanego ze szczepu Pseudomonas aeruginosa BI na biodegradację ciężkiej frakcji ropy naftowej. Analiza wykazała, że skuteczność biodegradacji zależy od stężenia substratu. Zaobserwowano, że wraz ze wzrostem stężenia substratu stopień usunięcia węglowodorów zawartych we frakcji ciężkiej malał liniowo zarówno w hodowlach z ramnolipidem, jak i w tych bez ramnolipidu (Rys. 34). Wytłumaczeniem tego zjawiska mogło być zbyt duże stężenie węglowodorów w stosunku do możliwości metabolicznych bakterii przeprowadzających biodegradację. Zwiększenie procentowego ubytku substratu podczas biodegradacji w obecności ramnolipidu widoczne było we wszystkich badanych stężeniach frakcji ciężkiej. Największy procentowy ubytek substratu zaobserwowano w hodowlach zawierających 0,1% substratu. Efekt ten był widoczny zarówno podczas biodegradacji frakcji ciężkiej w obecności ramnolipidu, jak i bez ramnolipidu. Największą stymulację biodegradacji zaobserwowano dla stężenia substratu 0,1 i 0,5%, która wyniosła odpowiednio 14 i 13%.

0,1 0,5 1 1,5 2 stężenie substratu [%] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 u b yt e k su b st ra tu [ % ] bez ramnolipidu z ramnolipidem

6.7.2.2. BIODEGRADACJA FRAKCJI OLEJOWEJ

Analiza GC-MS wykazała, że frakcja olejowa była mieszaniną węglowodorów C₈-C₂₆, w której jako główne indywidua występowały przede wszystkim n-alkany i izoparafiny: pristan i fitan (Rys. 35). Obecne były również n-alkilocykloheksany zawierające podstawniki o łańcuchach od 2 do 18 atomów węgla. W grupie węglowodorów aromatycznych występowały alkilobenzeny z podstawnikami o długości łańcuchów C2-C15, głównie C2-C5 oraz naftalen i jego alkilowe pochodne o łańcuchach zawierających 1-2 atomów węgla. We frakcji olejowej zidentyfikowano fenantren i czteropierścieniowe węglowodory aromatyczne oraz dibenzotiofen i jego pochodne zawierające łańcuchy od 1 do 3 atomów węgla.

Rys. 35. Chromatogram GC-FID frakcji olejowej ropy naftowej GROBLA.

Wpływ ramnolipidu na skuteczność procesu biodegradacji frakcji olejowej ropy naftowej GROBLA oceniono w oparciu o analizę ubytku węglowodorów w hodowlach prowadzonych bez ramnolipidu oraz w obecności ramnolipidu w stężeniu 80 mg/l. Zbadano również wpływ stężenia substratu na skuteczność biodegradacji. Przeprowadzone badania potwierdziły pozytywny wpływ ramnolipidu wyizolowanego ze szczepu Pseudomonas aeruginosa BI na biodegradację frakcji olejowej ropy naftowej. Tak jak w przypadku ciężkiej frakcji ropy naftowej badania wykazały, że skuteczność biodegradacji zależy od stężenia substratu. Stopień usunięcia węglowodorów zawartych we frakcji olejowej malał liniowo wraz ze wzrostem stężenia substratu zarówno w hodowlach z ramnolipidem, jak i w tych bez ramnolipidu (Rys. 36). Zwiększenie procentowego ubytku substratu podczas biodegradacji w obecności

10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 4000000 4500000 5000000 5500000 6000000 6500000 7000000 7500000 8000000 8500000 9000000 9500000 1e+07 1.05e+07 1.1e+07 1.15e+07 1.2e+07 1.25e+07 1.3e+07 1.35e+07 Time--> Abundance TIC: GFO25.D

ramnolipidu widoczne było we wszystkich badanych stężeniach frakcji olejowej. Największy procentowy ubytek substratu zaobserwowano w hodowlach zawierających 0,1% substratu. Wynosił on 52% w hodowli bez ramnolipidu i 65% w hodowli z ramnolipidem. Otrzymane wyniki potwierdzają, że frakcja olejowa jest bardziej podatna na rozkład mikrobiologiczny niż frakcja ciężka. Ubytek frakcji olejowej podczas biodegradacji bez biosurfaktantu był dwa razy większy niż ubytek frakcji ciężkiej. W hodowli z ramnolipidem ubytek frakcji ciężkiej wynosił 39%, podczas gdy ubytek frakcji olejowej 65%. W dalszych badaniach skupiono się na biodegradacji ciężkiej frakcji ropy naftowej, ze względu na fakt, że jest to substrat trudnobiodegradowalny i w wyniku procesu biodegradacji uzyskuje się stosunkowo niewielki ubytek tego substratu.

0,1 0,5 1 stężenie substratu [%] 0 10 20 30 40 50