8. Wyniki
8.3 Wpływ simwastatyny na poziom badanych białek u pacjentów z nowotworem jelita
W dalszych badaniach analizowano wpływ simwastatyny na ekspresję białek odczynu zapalnego w nowotworze jelita grubego. Simwastatyna posiada właściwości przeciwzapalne. Wiele badań wskazuje na simwastatynę jako na lek obniżający ryzyko wystąpienia nowotworu jelita grubego, m.in. Poynter i wsp. [130] dowiedli, że simwastatyna obniża prawdopodobieństwo wystąpienia nowotworu u osób, które przyjmowały simwastatynę przez ostatnie 5 lat. Ponadto Siddiqui i wsp.[109] porównując rozwój choroby w dwóch grupach pacjentów ze zdiagnozowanym nowotworem jelita grubego stwierdzili, iż w grupie osób przyjmujących statyny przez ostatnie trzy lata podatność do tworzenia przerzutów była obniżona, a także przeżywalność 5 letnia była większa niż w grupie osób nie przyjmujących statyn. Istnieją również dane wskazujące, iż przyjmowanie statyn zwiększa antynowotworowe działanie aspiryny [131]. W tego rodzaju badaniach klinicznych problemem jest wpływ dodatkowych czynników środowiskowych, mogących zaburzać ostateczny wynik (osoby zażywające simwastatynę zazwyczaj cierpią na choroby układu krążenia). Nie analizowano do tej pory wpływu simwastatyny na już istniejący nowotwór.
W pilotażowych badaniach klinicznych określono wpływ relatywnie krótkiego okresu podawania simwastatyny na ekspresję tych białek u pacjentów ze zdiagnozowanym nowotworem jelita grubego. Ponadto określono wpływ simwastatyny na na ekspresję IL-8, IL-6 oraz MnSOD w komórkach Caco-2 i HT-29.
8.3.1 Wpływ simwastatyny na poziom uwalniania IL-8 przez komórki HT-29
Eksperymenty in vitro opisane wcześniej w rozdziale 5.1 dowiodły, że komórki HT-29 uwalniają znaczne ilości IL-8 i dlatego użyto tej linii komórkowej jako modelu do badań nad wpływem simwastatyny na poziom uwalnianego białka IL-8.
Rysunek 19. Wpływ simwastatyny (0,5-10 µM) na uwalnianie białka IL-8 przez komórki HT-29.
Komórki hodowano 48 godz. w pożywce z dodatkiem surowicy, następnie 24 godz. w pożywce bez surowicy.
Po tym czasie pożywkę ponownie zmieniano na bezsurowiczą z dodatkiem simwastatyny. Po kolejnych 24 lub 48 godz. oznaczano w pożywkach poziom IL-8 metodą ELISA. Analiza statystyczna przy użyciu testu par wiązanych wykazała istotną statystycznie różnicę pomiędzy poziomem uwalniania IL-8 przez komórki nie poddane działaniu simwastatyny i komórki hodowane ze simwastatyną w stężeniach większych niż 5 µM.
Wyniki przedstawiono jako względny poziom uwalniania IL-8, przyjmując uwalnianie IL-8 przez komórki nie poddane działaniu simwasatyny jako 100% (średnia z trzech eksperymentów ± odchylenie standardowe).
Użyte stężenia nie były toksyczne dla komórek, co potwierdzono przy użyciu testu LDH (wyników nie zamieszczono).
Jak przedstawiono na Rysunku 19, w komórkach HT-29 dochodziło do zahamowania uwalniania IL-8 w wyniku działania simwastatyny w stężeniach większych niż 5 µM.
Wynik był statystycznie znamienny (p<0,05).
0%
60%
120%
180%
kontrola 0,5 µM 1µM 5µM 10µM
24h
* *
48h* *
simwastatyna
8.3.2 Wpływ simwastatyny na poziom IL-8 w surowicy pacjentów z nowotworem jelita grubego
Tabela 1. Wpływ terapii simwastatyną na poziom IL-8 w surowicy pacjentów z zaawansowanym nowotworem jelita grubego. W opisie uwzględniono płeć, wiek i stopień rozwoju nowotworu wg. Astlera-Collera. Klasyfikacji patologicznej rozwoju nowotworu dokonano w II Katedrze Chirurgii CMUJ w ramach współpracy z dr n. med. Markiem Winiarskim.
Pacjenci oczekujący na zabieg wycięcia guza przyjmowali 80 mg simwastatyny dziennie przez dwa tygodnie.
Surowicę pobierano od pacjentów przed zastosowaniem terapii oraz po jej zakończeniu a przed operacją wycięcia guza. Białko IL-8 oznaczono metodą ELISA. Wyniki przedstawiono oddzielnie dla każdego przypadku.
W pilotażowych badaniach wzięła udział niewielka grupa 9 pacjentów. Wyniki przedstawione w Tabeli 1 wskazują, że u 5 spośród 9 pacjentów poddanych terapii nastąpiło obniżenia stężenia IL-8 w surowicy.
8.3.3 Wpływ simwastatyny na uwalnianie IL-6 przez komórki Caco-2
Komórki linii HT-29 i Caco-2, w warunkach prowadzonych eksperymentów, nie były zdolne do spontanicznej (nie indukowanej) ekspresji IL-6. Jedynie komórki linii Caco-2 produkowały niewielkie ilości IL-6 w odpowiedzi na działanie TNFα (Rysunek 9), dlatego przeprowadzono analizę wpływu simwastatyny na uwalnianie IL-6 przez komórkach Caco-2 indukowane TNFα (Rysunek 20).
Analiza statystyczna przy użyciu testu par wiązanych wykazała istotną statystycznie różnicę pomiędzy poziomem uwalniania IL-6 przez komórki stymulowane tylko TNFα i przez komórki hodowane z mieszaniną simwastatyny (w stężeniach większych niż 5 µM) i TNFα. Wyniki przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe. Ilość uwalnianej IL-8 przez komórki kontrolne przyjęto jako 100%. Średnia z trzech niezależnych eksperymentów (P<0,05). Użyte stężenia nie były toksyczne dla komórek, co potwierdzono przy użyciu testu LDH (wyników nie zamieszczono).
Podobnie jak w przypadku IL-8 zahamowanie uwalniania IL-6 obserwowano w komórkach hodowanych w obecności simwastatyny o stężeniach przekraczających 5 µM.
0%
8.3.4 Wpływ simwastatyny na poziom IL-6 w surowicy pacjentów z nowotworem jelita grubego
Tabela 2. Wpływ podawania simwastatyny na poziom IL-6 w surowicy pacjentów z zaawansowanym nowotworem jelita grubego. W opisie uwzględniono płeć, wiek i stopień rozwoju nowotworu wg. Astlera-Collera.
Pacjenci oczekujący na zabieg wycięcia guza przyjmowali 80 mg simwastatyny dziennie przez dwa tygodnie.
Surowicę pobierano od pacjentów przed zastosowaniem terapii oraz po jej zakończeniu a przed operacją wycięcia guza. Poziom IL-6 oznaczono metodą ELISA.
Wyniki przedstawione w Tabeli 2 wskazują, że w niewielkiej grupie pacjentów (badania pilotażowe) zaobserwowano silną tendencję do obniżenia poziomu IL-6 w surowicy pacjentów, którym podawano simwastatynę, taki kierunek zmian stwierdzono u 8 z grupy 9 pacjentów poddanych terapii.
8.3.5 Wpływ simwastatyny na ekspresję mRNA MnSOD w komórkach HT-29
Rysunek 21. Przykładowy wynik hamowania ekspresji mRNA MnSOD przez simwastatynę w komórkach HT –29.
Komórki hodowano 48 godz. w pożywce zawierającej surowicę, następnie 24 godz. w pożywce bezsurowiczej. Po tym czasie pożywkę zmieniano na bezsurowiczą z dodatkiem simwastatyny. Po kolejnych 24 godz. izolowano całkowite RNA. Analizę ekspresji mRNA MnSOD przeprowadzono przy użyciu metody Nothern blot używając 10 µg całkowitego RNA. Przykładowy wynik spośród 5 niezależnych doświadczeń.
Podobnie jak w przypadku uwalniania IL-8 w komórkach HT-29 simwastatyna obniżała zawartość mRNA MnSOD w stężeniach przekraczających 5 µM.
rRNA
mRNA MnSOD
0 0,5 1 5 10 µM simwastatyny
rRNA
mRNA MnSOD
8.3.6 Wpływ simwastatyny na poziom białka MnSOD w guzie u pacjentów z nowotworem jelita grubego
Rysunek 22. Wpływ dwutygodniowej terapii simwastatyną na poziom białka MnSOD w lizatach guza oraz zdrowej sluzówki.
Fragmenty zdrowej śluzówki i guza pobierano od pacjentów w trakcie kolonoskopii przed zastosowaniem terapii simwastatyną oraz po jej zakończeniu w trakcie operacji wycięcia guza. Tkanki mrożono w ciekłym azocie, a następnie izolowano białka. Analizę ekspresji MnSOD przeprowadzono metodą Western blot (tubulina jako białko referencyjne).
A. Przykładowy wynik hamowania ekspresji MnSOD na poziomie białka (wynik dotyczy mężczyzny w wieku 67 lat, ze stopniem rozwoju nowotworu D wg. Astlera-Collera – informacja ustna Dr n. med. M Winiarski).
B. Obniżenie poziomu białka MnSOD w guzie. Poziom białka w guzie przed terapią przyjęto jako 100 %. W opisie uwzględniono płeć, wiek i stopień rozwoju nowotworu wg. Astlera-Collera). Określenie klasyfikacji patologicznej rozwoju nowotworu wykonano w II Katedrze Chirurgi UJ w ramach współpracy z Dr n.med. M Winiarskim.
Dwutygodniowa terapia simwastatyną w większości przypadków prowadziła do MnSOD
zaobserwowano wzrost zawartości białka MnSOD w guzie, przed terapią nie był dramatycznie podniesiony w stosunku do tkanki zdrowej.
8.4 Wpływ chemioterapii wzbogaconej inhibitorami waskulogenezy na zawartość IL-6