Wykorzystanie narzędzi proteomicznych do identyfikacji białek biorących

Na skutek działania czynników stresowych, takich jak susza dochodzi do zaburzenia procesów komórkowych, będących efektem zmian w regulacji ekspresji wielu genów. Zmiany te prowadzą do syntezy, akumulowania oraz zwiększonej aktywności specyficznych białek, mogących stanowić biomarkery, będące wskaźnikiem procesów

34

biologicznych, zachodzących w komórce pod wpływem stresu środowiskowego. Dzięki wykorzystaniu narzędzi proteomicznych i technik spektrometrii mas możliwe jest sporządzenie profili białkowych badanych roślin, pozwalających określić zróżnicowanie poziomu akumulacji określonych białek. Poznanie białek zaangażowanych w kluczowe procesy odpowiedzi rośliny na stres pozwoli na identyfikację markerów związanych z odpornością na deficyt wody, które wykorzystane mogą być do hodowli nowych odmian, jako narzędzie do selekcji odpornych genotypów.

Analizy proteomiczne zmierzające do wyselekcjonowania białek odpowiadających na stres środowiskowy powinny być prowadzone na roślinach posiadających kontrastujące fenotypy, np. genotyp wykazujący zwiększoną odporność na suszę i wrażliwy. Ponadto często wybierane są odmiany pochodzące z różnych rejonów świata, w celu zidentyfikowania nie tylko białek różnicujących rośliny poddawane stresowi i kontrolne, ale także takie, które różnicują genotypy. Przeprowadzone do tej pory doświadczenia pozwoliły na identyfikację wielu klas białek zaangażowanych w odpowiedz roślin na stres suszy, m.in.: biała zaangażowane w mechanizmy obronne, ekspresję genów, czy metabolizm pierwotny i wtórny. Różnego rodzaju podejścia proteomiczne wykorzystane zostały do poznania reakcji białek na stres suszy u różnych gatunków roślin (Rodziewicz i in. 2014). Przykład mogą stanowić badania przeprowadzone na 15 różnych odmianach jęczmienia, gdzie wykorzystując podejście typu „bottom-up” wyodrębniono grupy białek różnicujących genotypy wrażliwe od odpornych. I tak białka pełniące funkcje obronne, związane z fotosyntezą i metabolizmem pierwotnym wykazywały zwiększony poziom akumulacji u odmian bardziej tolerancyjnych (Kausar i in., 2013). W analizie typu „shotgun” przeprowadzonej na dwóch skrajnie różnych odmianach grochu zwyczajnego wykazano, że zwiększony poziom akumulacji białek zaangażowanych w proces fotosyntezy, enzymów antyoksydacyjnych i białek związanych z procesami syntezy i fałdowania wykazywały rośliny o genotypie bardziej tolerancyjnym na deficyt wody (Zadražnik i in., 2013). Badania przeprowadzone na pszenicy także wykazały znaczące zmiany w poziomie akumulacji białek pomiędzy odmiennymi genotypami. Odmiana tolerancyjna charakteryzowała się większą liczbą białek odpowiadających na deficyt wody w porównaniu do odmiany wrażliwej, ponad 4 razy więcej białek wykazywało wzrost poziomu akumulacji. Stosując znaczniki izobaryczne w połączeniu z dwuwymiarową chromatografią cieczową sprzężoną ze spektrometrem mas zidentyfikowano klasy białek szoku cieplnego, białek związanych z przekazywaniem sygnałów i białek zaangażowanych w metabolizm wtórny flawonoidów, które w odpowiedzi na stres wykazywały zwiększony

35

poziom akumulacji. Znaczące różnice obserwowane były także w profilu akumulacji białek zaangażowanych w syntezę ściany komórkowej, co świadczyć może o różnicach w jej budowie u zróżnicowanych genotypów roślin i jej znaczeniu w tolerowaniu suszy (Alvarez i in., 2014). W innych badaniach dotyczących pszenicy, wykorzystując podejście „shotgun” wykazano, że odmiany tolerancyjne charakteryzowały się największą liczbą białek odpowiadających na stres suszy, przy czym wzrost poziomu akumulacji wykazywały białka obronne i enzymy antyoksydacyjne, natomiast spadek poziomu akumulacji - białka zaangażowane w proces fotosyntezy i cykl Calvina (Ford i in., 2011). Charakterystyczne białka, wykazujące duże zróżnicowanie akumulacji pomiędzy genotypami tolerancyjnymi i wrażliwymi są często obiektem dalszych badań, zwykle na poziomie inżynierii genetycznej. W tym wypadku kodujące je geny poddawane są nadekspresji lub wprowadzane są do innych gatunków, a uzyskane rośliny transgeniczne są testowane pod katem odporności na określony stres środowiskowy. W ten sposób testowane były funkcje białek obronnych, takich jak białka szoku cieplnego (HSP, ang.

Heat Shock Proteins), białka późnej embriogenezy, zmiatacze wolnych rodników, czy

enzymy uczestniczące w syntezie związków osmotycznie czynnych. Na przykład, poziom akumulacji białka HSP70 w siewkach jęczmienia uległ wzrostowi tylko u roślin o genotypie tolerancyjnym na deficyt wody (Ashoub i in., 2013). Co więcej, u roślin tytoniu z nadekspresją genu kodującego HSP70 zauważono zwiększoną witalność w warunkach suszy (Cho i Hong, 2006). Badania przeprowadzone na transgenicznym ryżu z nadekspresją genu HVA1 kodującego białko z rodziny LEA, wykazały zwiększoną tolerancję na deficyt wody w porównaniu do roślin kontrolnych, co związane było z szybszym wzrostem roślin oraz znacznie niższym poziomem uszkodzeń wynikających z działania suszy (Xu i in., 1996). W doświadczeniu prowadzonym na siewkach jak i dojrzałych roślinach jęczmienia o różnym stopniu odporności na suszę zauważono zwiększoną akumulację transkryptów dwóch genów kodujących dehydryny Dhn3 i Dhn4 tylko u odmian tolerancyjnych, co korelowało także z parametrami takimi jak względna zawartość wody oraz indeks pogodowy plonu (Park i in. 2006).

W warunkach stresu w roślinach następuje zmożona synteza związków osmotycznie czynnych, takich jak prolina czy betaina glicynowa, które pełnią kluczową rolę w tolerowaniu niekorzystnych warunków środowiskowych. W przypadku transgenicznego tytoniu z nadekspresją genu syntetazy delta-1-pirolylo-5-karboksylanu, zauważono 18-krotnie wzmożoną syntezę proliny w stosunku do roślin kontrolnych. Rośliny charakteryzowały się zwiększonym potencjałem osmotycznym liści oraz wzrostem

36

biomasy korzeni, co może wskazywać na wyższą odporność na stres osmotyczny, wywołany deficytem wody (Kishor i in., 1995). Na skutek działania stresu suszy, skutkującego stresem osmotycznym, dochodzi do generowania dużych ilości wolnych rodników. Badania na transgenicznych roślinach wykazują, że nadekspresja genów kodujących enzymy antyoksydacyjne, związana jest z poprawą wydajności działania mechanizmów usuwania reaktywnych form tlenu, co może przekładać się na uzyskiwanie roślin o wyższym plonie, a tym samym bardziej odpornych na stres suszy (Badawi i in., 2004; Wang i in., 2006; Prashanth i in., 2008; Melchiorre i in., 2009). I tak w przypadku tytoniu z nadekspresją genu kodującego peroksydazę askorbinianową, zauważono poprawę wydajności układu fotosyntetyzującego, charakteryzującego się większą szybkością

asymilacji CO2, czy przewodnością szparkową. W konsekwencji transgeniczne rośliny

charakteryzowały się wyższą masą nasion w stosunku do roślin kontrolnych (Yan i in., 2003).

Stosując różnorodne połączenia metod separacji białek i technik spektrometrii mas możliwe jest przeprowadzenia analizy porównawczej proteomu roślinnego, ujawniającej zmiany w poziomie ekspresji białek, odpowiadających na określony czynnik środowiskowy. Jednakże ze względu na dużą zmienność i dynamizm proteomu, uzyskiwane wyniki badań nie zawsze są jednoznaczne. Na przykład, problemem może być jednoznaczne stwierdzenie, które z odpowiadających białek są związane z odpornością na suszę, a które są tylko wskaźnikiem niedoboru wody. Często dodatkową przyczyną problemów w interpretacji wyników jest zbyt mała ilość genotypów, na której prowadzone są badania. Ponadto w wielu przypadkach eksperymenty wykonywane są w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Takie podejście nie odzwierciedla w pełni procesów jakie zachodzą w roślinie w warunkach polowych, a genotypy uznane za tolerancyjne mogą nie wykazywać takich cech w naturalnym środowisku. Innym rodzajem ograniczenia jest niewielka liczba zsekwencjonowanych genomów roślinnych. Najwięcej badań prowadzonych jest na roślinach, których genomy zostały poznane, m.in., rzodkiewnik pospolity (The International Genome Initiative, 2000), kukurydza (Schnable i in., 2009), sorgo (Bedell i in., 2005), soja (Schmutz i in., 2010), pomidor (International Tomato Genome Sequencing Project, 2012), ryż (Goff i in., 2002), topola (Tuskan i in., 2006), ziemniak (The Potato Genome Sequencing Consortium, 2011), czy jęczmień (The International Barley Genome Sequencing Consortium, 2012). Wzrost ilości dostępnych sekwencji genomowych, zwłaszcza roślin o znaczeniu gospodarczym, ma kluczowe

37

znaczenie dla poszerzenia obszaru prowadzonych badań i z pewnością przyczyni się do przyspieszenia postępu dokonującego się w zakresie badań proteomów roślinnych.