Wyznaczanie wydajności kwantowej fluorescencji [ɸ F ]

Wydajność kwantowa fluorescencji (ɸF) jest niezwykle istotnym parametrem określającym z jaką efektywnością przebiega proces emisji fluorescencji przez badany fluorofor. Z rzadkimi wyjątkami, które w wypadku tych związków są pomijalne, maksymalna jej wartość wynosi 1 (czyli 100%) - co oznacza, że ilość zaabsorbowanych przez cząsteczkę kwantów promieniowania elektromagnetycznego, równa się ilości kwantów wyemitowanych w postaci fluorescencji. W tym miejscu warto nadmienić, iż wydajność kwantowa jest parametrem niezależnym od długości fali wzbudzenia, dlatego że emisja kwantu promieniowania następuje z najniższego stanu wzbudzonego S1 (Reguła Kashy). W celu określenia wartości ɸF dla każdego z otrzymanych przeze mnie związków, wykonałam pomiar metodą porównawczą wobec N-metyloakrydyny, która posiada pasmo absorpcji oraz emisji fluorescencji w tym samym zakresie spektralnym co badane barwniki (dokładniejszy opis metodyki zamieściłam w części eksperymentalnej). Istnieją dwa podejścia wyznaczania relatywnej wydajności kwantowej z zastosowaniem metody

116

kwantowa jest obliczona na podstawie jednej wartości emisji dla próbki badanej oraz wzorca. Jej zaletą jest szybkość w uzyskaniu wyników, co jednak jest obarczone większym błędem pomiarowym (Tabela 9).

Tabela 9. aWartości wyznaczonych wydajności kwantowych (ɸF) metodą porównawczą (wzorzec:

N-metyloakrydyna; ɸF = 0,88) dla otrzymanych związków, w metanolu; Cm = 10-5 M. Absorbancja dla każdego z pomiarów wynosiła poniżej 0,1 w celu uniknięcia efektu filtra wewnętrznego. bJasność fluorescencji została określona na podstawie iloczynu wydajności kwantowej i molowego współczynnika ekstynkcji danego związku (ɸF x ε).

Związek aɸF bɸF x ε [M-1 cm-1] 8 0,21 2877 10 0,11 1848 12 0,25 7400 30 0,19 2964 31 0,18 2952 32 0,15 3690 33 0,12 2460 34 0,11 2288 35 0,20 2840

Na podstawie danych przedstawionych w tabeli widoczne jest, że wszystkie wartości wydajności kwantowych wynoszą poniżej 0,3. Do ogólnych przyczyn obniżania wartości wydajności kwantowej (< 1) należą wszystkie procesy wytracania energii zanim cząsteczka wyemituje kwant promieniowania. Najwyższą wydajność kwantową zaobserwowałam dla związku 8 i 12, i ponieważ wartości ɸF związków różniących się podstawnikiem na egzocyklicznym atomie azotu są bardzo zbliżone, można wysnuć wniosek, że zmiany w tym obrębie struktury mają niewielki, lecz zauważalny wpływ na efektywność emisji promieniowania. Powiązanie ze strukturą chemiczną ma być może zastosowany przeze mnie rozpuszczalnik: wzrost stałej dielektrycznej i H-donorowości rozpuszczalnika może spowodować wzrost (8, 12) lub spadek (34, 33) wydajności kwantowej, w zależności od struktury związku. Im więcej sprzężonych wiązań π oraz grup donujących elektrony - auksochromów (NH2, -OH), tym wyższa jej wartość91. W moim przypadku liczba atomów azotu i tlenu jest zawsze taka sama, toteż parametrten nie powinien mieć znaczenia w wyjaśnianiu różnic we fluorescencji. Wydaje się, że dominujący wpływ na wartość wydajności kwantowej mają dwa czynniki: i) gęstość elektronowa na egzocyklicznym

117

atomie azotu oraz ii) ruchy rotacyjne. Niemal dwukrotnie wyższą wydajność kwantową zaobserwowałam dla związku 8, w porównaniu ze związkiem 10. Można wyjaśnić to potencjalnie tworzeniem wiązań wodorowych pomiędzy związkiem 8 (odgrywającym rolę H-donorową), a rozpuszczalnikiem i tym samym zwiększeniem gęstości elektronowej na atomie azotu, co nie jest możliwe w przypadku związku 10. Z kolei, wyższa wydajność kwantowa związku 12 w porównaniu z 10 sugeruje, że istotną rolę w tym procesie odgrywać może efektywność nieradiacyjnej relaksacji poprzez rotację grupy metylowej (związek 10), podczas gdy rotacja sztywniejszej grupy benzylowej w związku 12 może być ograniczona. Podobną hipotezą o relaksacji poprzez rotację grup metylowych można także wyjaśnić różnicę pomiędzy związkiem 12 oraz 32 i 34, ale również 10 i 8. Obecność podstawników halogenowych w pierścieniu benzenowym także wpływa na obniżenie wydajności kwantowej odpowiednich fluoroforów (31, 33 i 35 w porównaniu z 12), choć brak różnic pomiędzy mono i difluorowanym podstawnikiem benzylowym sugeruje, iż efekt ten nie jest powiązany z gęstością elektronową na egzocyklicznym atomie azotu. Wpływ ten może zatem wynikać z dość często obserwowalnego efektu halogenowego, który dla cięższych atomów (w szczególności bromu i jodu, ale potencjalnie także dla chloru) nazywany jest czasem „efektem atomu ciężkiego” i ma związek z wygaszaniem procesu fluorescencji przez wolne pary elektronowe halogenu.

Kolejną istotną rzeczą w procesie fluorescencji tej grupy związków jest brak sztywności rdzenia strukturalnego, ze względu na obecność grupy winylowej. Dzięki temu, w stanie wzbudzonym możliwa jest zmiana konfiguracji z trans na cis, tak jak w przypadku stilbenu, na skutek fotoizomeryzacji, co przyczyniałoby się do obniżenia wydajności kwantowej (Schemat 44)141.

Schemat 44. Prawdopodobna fotoizomeryzacja w stanie wzbudzonym analogów stilbenu.

Co więcej, obecność heteroatomów w związkach zbliżonych strukturalnie do stilbenu, zmniejsza przejściową barierę izomeryzacji, ze względu na obecność przejść n-π*. W konsekwencji, dla pirydylowych analogów stilbenów, mała odległość pomiędzy

118

prawdopodobieństwa wzbronionego przejścia międzysystemowego (ISC), pomiędzy S1 i T1, obniżającego fluorescencję. Efekt ten jest jednak prawdopodobnie porównywalny dla wszystkich analizowanych związków. W związku z tym, podczas gdy może on odpowiadać za generalne obniżenie wydajności kwantowej, nie jest on kluczowy dla wyjaśnienia różnic pomiędzy związkami z tej samej serii. Niemniej, w celu dokładniejszego zbadania wpływu procesu izomeryzacji na wydajność kwantową fluorescencji,

w przyszłych badaniach można dokonać pomiaru wydajności kwantowej

w rozpuszczalnikach o większej lepkości niż metanol, np. DMSO, lub/i w niższej temperaturze pomiaru. Dodatkowo wyznaczonym przeze mnie parametrem jest „jasność” fluorescencji (ang. molar brighteness), czyli iloczyn wydajności kwantowej oraz molowego współczynnika ekstynkcji, na podstawie którego możemy określić efektywność „świecenia” fluoroforu (Tabela 8). Dla większości otrzymanych związków wartość tego parametru nie przekracza 3x 103 M-1 cm-1 (wyjątek stanowi pochodna 12). Porównując uzyskane wyniki z częścią handlowo dostępnych fluoroforów, wartości te są dużo niższe, (Rysunek 49) co może obniżać ich potencjał w zastosowaniu praktycznym jako barwnika, szczególnie w bardziej złożonych systemach biologicznych, lecz nie wyklucza ich wykorzystania w badaniach in vitro.

119

2.3. Badanie zmian absorpcji i emisji fluorescencji w wyniku zmian polarności i pH