Założenia projektu badawczego

W uprzemysłowionych społeczeństwach problem zdrowotny związany z występowaniem i leczeniem ran występuje u około 1-2% populacji przynajmniej jednokrotnie, a koszty związane z leczeniem ran pochłaniają 2-4% budżetu państw. Szacuje się, że problem ran przewlekłych dotyka w Polsce 500 tys. osób rocznie, z których większość nie wymaga hospitalizacji. To pół miliona osób, które miesiącami cierpią nie tylko z powodu bólu, ale także społecznej dysfunkcji. Niepokojącym jest jednak fakt, że spośród tej grupy, około 10 tys. umiera, najczęściej na skutek zakażeń wielolekoopornymi drobnoustrojami [Fiedotow i in. 2006]. W ostatnich dwóch dekadach obserwuje się bardzo niepokojące zjawisko szybkiego uodparniana się drobnoustrojów na powszechnie stosowane antybiotyki, m.in. pojawiły się wielolekooporne szczepy Staphylococcus aureus, wankomycynooporne szczepy Enterococcus faecalis i Pseudomonas aeruginosa, czy wielolekooporne szczepy Candida albicans [White i in. 2001]. Ze względu na szybkie uodparnianie się na leki, drobnoustroje te są także częstą przyczyną zakażeń szpitalnych. Jedną z grup mikroorganizmów, które najszybciej uodparniają się na stosowane związki terapeutyczne, są bakterie z rodzaju Staphylococcus, czynnik etiologiczny wielu schorzeń człowieka i zwierząt, w tym przede wszystkim patogeny wywołujące infekcje skórne, a przy tym odpowiadające za większość zgonów pacjentów borykających się z zakażonymi ranami. Zdaniem wielu specjalistów sytuacja jest na tyle poważna, że w niezbyt odległej przyszłości stosowane obecnie leki mogą okazać się zupełnie nieprzydatne w terapiach chorób infekcyjnych.

Pojawienie się szczepów opornych na wankomycynę, antybiotyk glikopeptydowy stanowiący do tej pory jedyny lek zawsze skuteczny, a także pierwsze doniesienia oporności na terapie wykorzystujące różne formy srebra [Percivala i in. 2005] oraz wysoki koszt stosowanych terapii fagowych, wymusza poszukiwania metod alternatywnych. Istnieje, więc pilna potrzeba poszukiwania nowych substancji, które mogłyby być stosowane jako leki przeciwdrobnoustrojowe. Obiecującą alternatywą do walki z patogennymi mikroorganizmami jest wykorzystanie rybosomalnie syntetyzowanych peptydów i białek o aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Występują one u wszystkich żyjących gatunków jako ważny składnik odporności wrodzonej gospodarza [Yeaman i in. 2003] bądź leżą u podstaw antagonistycznego oddziaływania mikroorganizmów (bakteriocyny) [Gwiazdowska i in.

2005, Schroder i in. 2006]. Jedną z najbardziej obiecujących bakteriocyn jest lizostafyna - zewnątrzkomórkowa, cynkowa metaloproteinaza wytwarzana przez bakterie Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. Należy ona do białek o działaniu przeciwdrobnoustrojowym, przy czym główne jej działanie polega na specyficznym niszczeniu peptydoglikanu ściany komórkowej u niemal wszystkich znanych mikroorganizmów z rodzaju Staphylococcus.

Obecnie trwają badania kliniczne mające na celu dopuszczenie jej stosowania w terapiach skierowanych przeciwko zakażeniom gronkowcowym. Pomimo wielu korzyści i obiecujących

75 wyników, lizostafyna, a także inne peptydy/białka o aktywności przeciwdrobnoustrojowej, nadal nie są powszechnie wykorzystywane w zastosowaniach typowo komercyjnych np.

materiałach opatrunkowych. Wśród czynników odpowiadających za to ograniczenie znajdują się m.in. niewielka dostępność systemów przydatnych do ich inkorporacji, a także wysokie koszty produkcji. Systemy, o jakich mowa powyżej, nie tylko powinny zapewniać długotrwałe uwalnianie i utrzymanie stałego stężenia uwalnianej substancji w środowisku gojącej się rany, lecz także powinny chronić peptyd/białko przed przedwczesną utratą aktywności, a ponadto powinny zapewniać optymalne warunki dla procesu gojenia się rany.

W ostatnich latach wiele uwagi poświęcono projektowaniu i konstrukcji systemów o tych właściwościach, wykorzystując przy tym polimery naturalne. Ich wykorzystanie w konstrukcji nowoczesnych materiałów opatrunkowych stało się możliwe dzięki intensywnym badaniom, które potwierdziły ich biokompatybilność oraz umożliwiły opanowanie technologii ich masowego wytwarzania. Atrakcyjność polimerów naturalnych uwarunkowana jest przede wszystkim ich biokompatybilnością (dotyczy to także produktów ich degradacji), możliwością wielu modyfikacji, co umożliwia tworzenie kompozytów, czy też systemów do kontrolowanego dostarczania czynników aktywnych (dzięki obecności co najmniej jednej grupy funkcyjnej), dodatkową rolą w procesie odbudowy tkanek skóry m.in. stanowiąc dogodne miejsce do adhezji komórek, stosunkowo niską ceną, umożliwiającą ich wykorzystanie do produkcji wyrobów na masową skalę. Wśród wielu wykorzystywanych w konstrukcji materiałów opatrunkowych polimerów naturalnych, chitozan, kolagen i żelatyna są polimerami wykorzystywanymi najczęściej, a uzyskiwane na ich bazie biomateriały spełniają najważniejsze kryteria stawiane nowoczesnym zaawansowanym materiałom opatrunkowym [Jayakumar i in. 2011, Hoyer i in. 2012, Tucci i in. 2001, Sai i in. 2000, Muzzarelli 2009]. Wielokrotnie wykazywano, że biomateriały uzyskiwane na bazie tych polimerów posiadają właściwości zbliżone do matrycy pozakomórkowej – miękkiej, mocnej i elastycznej sieci zbudowanej z białek, zapewniającej stabilność mechaniczną i integralność strukturalną tkanek i narządów ciała, a także posiadają szereg dodatkowych właściwości funkcyjnych wpływających pozytywnie na proces regeneracji rany, co zostało szczegółowo opisane wyżej w części teoretycznej.

Chitozan jest polimerem nierozpuszczalnym w wodzie - rozpuszcza się w wodnych roztworach kwasów organicznych lub nieorganicznych, z których roztwory kwasu octowego są najczęściej wykorzystywane. Przy zastosowaniu takich roztworów otrzymywane są różnego typu biomateriały, w tym: membrany, gąbki, włókna, mikrosfery oraz hydrożele.

Zawartość kwasu w tak przygotowanym materiale uniemożliwia jego bezpośrednie wykorzystanie w zastosowaniach medycznych (ze względu na drażniące działanie kwasów - spadek biokompatybilności) i zmusza wytwórcę do prowadzenia dodatkowych procesów mających na celu jego usunięcie. Zwykle dzieje się to poprzez wypłukiwanie za pomocą wodnych bądź etanolowych roztworów, a następnie powtórne suszenie. Takie postępowanie

76 jest procesem czaso- i kosztochłonnym, a ponadto uniemożliwia inkorporację związków aktywnych na etapie wytwarzania takich materiałów, bowiem wypłukiwanie powoduje pełne bądź częściowe usunięcie inkorporowanego związku aktywnego, a obecność kwasów może spowodować utratę aktywności takiego czynnika zwłaszcza, jeśli jest nim preparat białkowy.

Aby pominąć ten etap, prowadzonych jest wiele badań mających na celu wytworzenie rozpuszczalnych w wodzie cząsteczek chitozanu, a wśród nich różnego typu chemiczne bądź enzymatyczne modyfikacje oraz fragmentowanie łańcucha. Oba podejścia prowadzą do otrzymania rozpuszczalnych cząsteczek chitozanu, niemniej jednak sposoby te również posiadają szereg ograniczeń i wad. Otrzymywanie rozpuszczalnych w wodzie pochodnych chitozanu związane jest z koniecznością wprowadzania dodatkowych, często wieloetapowych procesów, które niejednokrotnie wykorzystują szkodliwe dla zdrowia i środowiska rozpuszczalniki, co także zmusza wytwórcę do prowadzenia procesów związanych z usuwaniem ich pozostałości, a w konsekwencji otrzymywane są rozpuszczalne w wodzie pochodne chitozanu o zmniejszonej biokompatybilności, względem wyjściowego polimeru.

Z kolei fragmentacja łańcuchów chitozanu prowadzi do otrzymania chitozanu o najmniejszych masach cząsteczkowych, a często wręcz do jego oligomerów, co znacznie ogranicza możliwe zastosowania takiego preparatu (Wprowadzenie 2.2.1). Rozwiązaniem tego problemu mogłoby być zatem zaproponowanie procesu pozwalającego na rozpuszczenie w wodzie, co nie tylko wyeliminowałoby proces usuwania resztowych kwasów organicznych, lecz także umożliwiłoby dodawanie peptydów/białek już na etapie formułowania materiałów z niego wytworzonych.

Mając na uwadze wszystkie wskazane powyżej potrzeby, a zwłaszcza potrzebę konstrukcji skutecznego materiału mogącego znaleźć zastosowanie w terapiach leczenia ran zakażonych szczepami gronkowca złocistego, postanowiłem, że swoją pracę poświęcę próbie opracowania materiału zbudowanego z chitozanu, kolagenu i żelatyny, który poza właściwościami wymaganymi od nowoczesnego materiału opatrunkowego byłby dogodną matrycą do inkorporacji lizostafyny. Wstępne założenia projektowe skupiłem wokół obserwacji powszechnie znanego procesu produkcyjnego, jakim jest przygotowywanie napojów gazowanych, co pozwoliło mi na sformułowanie hipotezy, która stwierdza, że możliwe jest rozpuszczenie chitozanu w wodzie uprzednio nasyconej gazowym ditlenkiem węgla i wykorzystanie tak przygotowanego roztworu do konstrukcji chitozanowo-białkowego materiału o strukturze gąbki. Zanim jednak doszło do sformułowania powyższej hipotezy swoje prace poświęciłem analizie wpływu rodzaju preparatu biopolimerowego (chitozanu, żelatyny i kolagenu) na wybrane właściwości wytworzonych z nich materiałów przy wykorzystaniu standardowych procedur przetwarzania chitozanu, mając na celu obiektywne wykazanie relacji pomiędzy tymi czynnikami. Podczas swojej pracy podjąłem także próbę zwiększenia skali wytwarzania lizostafyny, poprzez optymalizację jej ekspresji w bioreaktorze o objętości roboczej 5 l, w układzie ekspresyjnym przygotowanym

77 i wcześniej opisanym przez pracowników Katedry Technologii Leków i Biochemii, Wydziału Chemicznego Politechniki Gdańskiej, w celu pozyskania wydajnego, szybkiego i taniego źródła jej pozyskiwania (prace związane z tym wątkiem badań o charakterze optymalizacyjnym przedstawiłem w załączonym do rozprawy suplemencie).