Zdolność WST11 do generowania tlenu singletowego

Wydajność generowania tlenu singletowego zależy od energii wzbudzonego stanu trypletowego [154], potencjału redoks fotosensybilizatora [155], oraz od polarności rozpuszczalnika [156], [157]. Dodatkowo, szczególnie gdy czas życia trypletu jest stosunkowo krótki (rzędu mikrosekund), można się spodziewać silnej zależności wydajności generowania tej reaktywnej formy tlenu od lokalnego stężenia tlenu.

Generowanie tlenu singletowego przez badany sensybilizator wykazaliśmy zarówno metodą bezpośrednią, rejestrując charakterystyczną fosforescencję 1O₂(1

∆g) przy 1270nm, jak i pośrednią, na drodze pomiarów fotokonsumpcji tlenu w obecności akceptorów i wygaszaczy tlenu singletowego. Przedstawione wyniki badań sugerują, że tlen singletowy jest generowany wydajnie w roztworach z relatywnie polarnymi rozpuszczalnikami organicznymi takimi jak MeOH i aceton (Tab.2). Za wysoką wydajność kwantową generowania tlenu singletowego − 0,83 i 1 w MeOH i acetonie, odpowiednio, odpowiedzialna jest polarność rozpuszczalnika oraz wysokie stężenie tlenu w takich roztworach (2,19mM w MeOH, [115]), co z kolei zwiększa prawdopodobieństwo przekazu energii ze wzbudzonego WST11 na cząsteczkę tlenu. Warto podkreślić, że w micelach wydajność kwantowa generowania tlenu singletowego jest znacznie niższa niż w rozpuszczalnikach organicznych, co może być częściowo związane z gorszym dostępem cząsteczki fotosensybilizatora do tlenu, jak postulowano w poprzednim paragrafie. Pośrednim dowodem na generowanie tlenu singletowego w tym układzie był gwałtowny wzrost fotokonsumpcji tlenu po dodaniu silnego chemicznego wygaszacza tlenu singletowego, histydyny (Rys.51), przy czym proces ten ulegał zahamowaniu po wprowadzeniu fizycznego wygaszacza 1O₂(1

∆g), azydku sodu.

Otrzymane wyniki rozdzielczo-czasowej detekcji tlenu singletowego przy 1270nm wykazały, że tlen singletowy generowany jest przez WST11 również w wodzie (Rys.42, 43). Jest to ważna obserwacja, gdyż dotychczas uważano [37], iż fotosensybilizowane utlenianie przy udziale WST11 zachodzi wyłącznie poprzez mechanizm Typu I, czyli na drodze przekazu elektronu i produkcji wolnych rodników. Należy jednak podkreślić, że pomiary fosforescencji tlenu singletowego przy 1270nm zostały przeprowadzone w powyższej pracy przy użyciu układu pomiarowego opartego na detektorze germanowym oraz laserze wzbudzającym, generującym

125

milidżulowe błyski z małą częstotliwością. Taki układ charakteryzuje się znacznie mniejszą rozdzielczością czasową oraz niższą czułością detekcji tlenu singletowego i dlatego nie była możliwa rejestracja słabego sygnału luminescencji tlenu singletowego, który dodatkowo maskowany był przez intensywną fosforescencję samego fotosensybilizatora. Ponadto, układ pomiarowy wykorzystany w tamtej pracy nie był przystosowany do badania mało stabilnych fotosensybilizatorów takich jak WST11, czego wynikiem była znaczna degradacja fotosensybilizatora w trakcie pomiaru. System do pomiaru rozdzielczej czasowo fosforescencji tlenu singletowego użyty obecnie, jest znacznie lepiej przystosowany do badania tego typu fotosensybilizatorów (podrozdział 3.2.5). Stosując ten bardziej zaawansowany układ pomiarowy dokonano separacji słabej komponenty tlenu singletowego, co umożliwiło wyznaczenie wydajności kwantowej generowania 1O2(1Δg) przez 20µM WST11, zarówno w buforze PBS jak i w wodzie destylowanej, która wynosi około 0,028 i 0,043 (Rys.43(B), Tab.2). Wyznaczona w ten sposób wartość wydajności kwantowej jest jednak zaniżona, między innymi dlatego, że – jak wyżej wykazano - badana próbka ulega agregacji w roztworach wodnych. Ponadto, obecne wyniki wyraźnie wskazują, że zwiększenie siły jonowej roztworu powoduje spadek wydajności kwantowej generowania tlenu singletowego. I tak, dla 20µM WST11 wydajność kwantowa generowania 1O₂(1Δ_g) spada z 0,043 w WD do 0,016 w 50mM PBS (Rys.44). Wpływ siły jonowej buforu na wydajność kwantową fotogenerowania tlenu singletowego można tłumaczyć wzmożoną agregacją fotosensybilizatora w środowisku o zwiększonym stężeniu jonów. Dodatkowym czynnikiem, który może obniżać mierzoną efektywność generowania 1O₂(1Δ_g) jest oddziaływanie tlenu singletowego z samym sensybilizatorem oraz jego agregatami (Rys.45).

Wyniki badania procesu fotodegradacji WST11, sekcja 4.1.4.4, prowadzą do wniosku, iż głównym produktem naświetlania jest Pd-Chloryna. Wydaje się jednak, że związek ten nie jest wynikiem oddziaływania fotosensybilizatora z tlenem singletowym, gdyż zamiana środowiska na D₂O a także dodanie azydku sodu nie przyniosło spodziewanych zmian w przebiegu fotodegradacji sensybilizatora (Rys.25). Można więc przypuszczać, iż oddziaływanie tlenu singletowego z agregatami ma głównie charakter fizyczny. Stała szybkości oddziaływania WST11 z 1O2(1

126

singletowy generowany był przez samo WST11, oraz (6,2 ± 0,4)·108 M-1s-1, przy generacji przez zewnętrzny fotosensybilizator, jakim był róż bengalski (Rys.45).

Dodatkowym, pośrednim, dowodem na generowanie tlenu singletowego w układzie wodnym są wyniki pomiarów oksymetrii EPR (Rys.49). Zaobserwowano, między innymi, dwukrotny wzrost fotokonsumpcji po zamienieniu środowiska na ciężkowodne, znaczne przyspieszenie procesu w obecności histydyny, a także gaszący efekt azydku sodu.

Stwierdzono dwukrotnie wyższą wydajność generowania tlenu singletowego w środowisku deuterowanym niż w zwykłej wodzie (Rys.42-43, Tab.2), co można tłumaczyć mniejszą efektywnością oddziaływań wzbudzonego WST11 z poziomami oscylacyjno-rotacyjnymi rozpuszczalnika, przez co wydłuża się czas życia wzbudzonego stanu trypletowego fotosensybilizatora, jak również nieco niższą polarnością i wyższą rozpuszczalnością tlenu. Część pomiarów przeprowadzono w środowisku PBS(D2O), ze względu na dłuższy czas życia fosforescencji tlenu singletowego, który pozwala na jego swobodną separację od szybciej zanikającej fosforescencji samego fotosensybilizatora (Rys.42). Fakt ten wykorzystano przy badaniu wpływu BSA na fosforescencję 1O₂(1

∆g). Wyniki sugerują, iż nawet w obecności wysokich stężeń BSA, generowany jest tlen singletowy, który zanika w wyniku efektywnego oddziaływania z cząsteczką albuminy (Rys.46). Wyznaczona stała gaszenia tlenu singletowego przez białko wynosi (4,3 ± 0,2)·108M-1s-1 (Rys. 47) i jest zbliżona do wartości literaturowej, 5·108 M-1s-1 [139]. Oddziaływanie ma charakter chemiczny, co pokazano w pomiarach oksymetrii EPR w sekcji 4.1.5.3 (Rys.53).

Ponadto, otrzymane wyniki pokazały szybki ubytek tlenu w obecności białka. Wzrost szybkości tego procesu po wprowadzeniu histydyny lub zamianie środowiska buforu PBS na PBS(D₂O) sugeruje obecność tlenu singletowego w badanym układzie. Co więcej, zaobserwowano znaczne zahamowanie konsumpcji po wprowadzeniu azydku sodu. Sugeruje to, iż przynajmniej część obserwowanej fotokonsumpcji ma związek z oddziaływaniem BSA z 1O2 (1

∆g). Wynik jest niezwykle istotny, gdyż dotychczas fotokonsumpcję tlenu w obecności albuminy traktowano jako proces wyłącznie wolnorodnikowy [37]. Jednocześnie fakt, iż nawet w obecności azydku sodu obserwuje się większy ubytek tlenu niż dla samego WST11 w PBS, wskazuje na prawdopodobny udział innych form tlenu w procesie (utleniania białka) (Rys.53).

127

Nie znaleziono literatury, ani odnośników do niej, opisującej utlenianie albumin przez pochodne bakteriochlorofili. Z drugiej strony, zjawisko utleniania białka na drodze mechanizmu I i II typu fotosensybilizowanego utleniania indukowanego porfiryną DDP(V)TPP (z ang.: di (3,6-dioxadecyloxo) Tetraphenyl PorphyrinatoPhosphorus(V) Chloride) opisano w niedawnej pracy [158]. Autorzy ci postulują ponadto, iż w obu mechanizmach celem reaktywnych form tlenu jest głównie tryptofan.