Zygotyczność bliźniąt tej samej płci określana jest często poprzez wykorzystanie kwestionariusza i dla uwiarygodnienia tej metody sprawdza się uzyskane dane na poziomie DNA. Tego typu badania przeprowadzono na dwóch dużych grupach bliźniąt tej samej płci w Chinach, wskazując na dużą zgodność ankiet z badaniami genetycznymi (Chen i wsp., 2010). Badaniom poddano 471 par bliźniąt ze średnią wieku ok. 14 lat (345 jednozygotycznych, 126 dwuzygotycznych) oraz 382 par w wieku ok. 12 lat (261 jednozygotycznych, 121 dwuzygotycznych). Kwestionariusz obejmował 12 pytań związanych z podobieństwem oraz częstością pomyłek. Zgodność wyników z danymi genetycznymi zwiększono poprzez dodanie uwag rodziców i zastosowanie dwupunktowego formatu odpowiedzi. Badania DNA obejmowały 9 loci typu STR. Porównanie wszystkich danych wskazało na zgodność przewidywania z zastosowaniem trzypunktowego kwestionariusza wynoszącą 83,8%, dane od rodziców zwiększały dokładność o 3,9%, a zastosowanie dwupunktowej skali pozwalały na 4,6% wzrost skuteczności. Jednoczesne zastosowanie raportów od dzieci i rodziców pozwalało na wzrost czułości do 90,6%. Uzyskane wyniki sugerują, że nieznacznie zmienione kwestionariusze z dwupunktową skalą oraz uzyskanie wyników z kilku źródeł pozwoli na
154 skuteczne wykorzystanie tego typu badań w ocenie zygotyczności dorosłych bliźniąt. Podobne badania prowadzono również wcześniej w Chinach, wskazując na dosyć dużą wydajność danych uzyskanych z kwestionariusza w stosunku do badania DNA w pięciu loci (Chen i wsp., 1999).
Jednozygotyczność bliźniąt może wiązać się ze zgodnością występowania chorób uwarunkowanych genetycznie. Np. w przypadku choroby Leśniowskiego-Crohn’a, zgodność w tej grupie bliźniąt jest istotnie większa niż w przypadku bliźniąt dwuzygotycznych. Występowanie mutacji w genie NOD2/CARD15 nie jest związane z koniecznością wystąpienia choroby Leśniowskiego-Crohna u obydwu bliźniąt. Badania duńskie przeprowadzone dla 103 par bliźniąt z chorobami zapalnymi jelita związane były ze śledzeniem losów par bliźniąt przez 13 lat. Zygotyczność bliźniąt określona początkowo w oparciu o kwestionariusz została potwierdzona z wykorzystaniem metod molekularnych. Badaniom molekularnym poddano 123 bliźnięta, wykazując 63,6% zgodność pod względem występowania choroby wśród jednozygotycznych par bliźniąt i 3,6% spośród dwuzygotycznych. Więcej niż jedną mutację w genie NOD2/CARD15 obserwowano u 44% pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna, 2% pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego i 19% zdrowych bliźniąt (Jess i wsp., 2005). Późniejsze badania potwierdziły mniejszy od przewidywanego wpływ tła genetycznego na występowanie choroby Leśniowskiego-Crohna u par bliźniąt (Halfvarson, 2011).
Jednozygotyczne bliźnięta rzadko są całkowicie identyczne, wpływają na to mechanizmy genetyczne, epigenetyczne, jak również postzygotyczne mechanizmy środowiska płodowego (Machin, 2009). Heterokariotypia czy zaburzona inaktywacja chromosomu X mogą prowadzić do wystąpienia znaczących różnic wśród bliźniąt jednozygotycznych i nieprawidłowego określenia ich jako dwuzygotyczne. Określenie zygotyczności jest istotne dla typowania tkanek dla potrzeb transplantacji, możliwości zapobiegania wystąpienia chorób nie ujawniających się u bliźniąt jednocześnie i odpowiedniej opieki nad bliźniętami. Bardziej dokładne określenie zygotyczności jest niezbędne w przypadku par bliźniąt o nietypowym, złożonym pochodzeniu biologicznym, np. trigametyczne i tetragametyczne chimerowe bliźnięta dwuzygotyczne mogą być też jednokosmówkowe. Występowanie międzypłodowych anastomoz naczyniowych u bliźniąt jednokosmówkowych może przyczynić się do występowania zgodności na poziomie krwi, przy braku zgodności tkankowej innych organów (Machin, 2009). Ponieważ w niniejszej rozprawie do badań wykorzystywano krew pępowinową lub krew obwodową, zresztą jako
155 najczęstsze i bardzo wydajne źródło do izolacji materiału genetycznego, nie można było zaobserwować podobnych odchyleń.
Określenie zygotyczności bliźniąt prowadzone jest często w oparciu o DNA uzyskany z nabłonka jamy ustnej czy krwi oraz analizę sekwencji mikrosatelitarnych, STR czy zmiennej liczby powtórzeń tandemowych (ang. variable number tandem repeats, VNTRs). Jednozygotyczne bliźnięta mogą być odmienne ze względu na różne procesy genetyczne, epigenetyczne czy środowisko płodowe, należy również rozważyć możność wystąpienia chimer jednokosmówkowych bliźniąt dwuzygotycznych. Postzygotyczne mutacje w badanych loci mogą prowadzić do wskazania bliźniąt jednozygotycznych jako dwuzygotycznych. Określenie kosmówkowości nie odzwierciedla w pełni potencjalnej zygotyczności bliźniąt, jedna trzecia bliźniąt jednozygotycznych jest dwukosmówkowa, stąd dwukosmówkowe bliźnięta tej samej płci nie mogą być odgórnie uznane za dwuzygotyczne (Machin, 2009).
Genotypowanie ośmiu markerów mikrosatelitarnych powinno wystarczyć do wskazania bliźniąt dwuzygotycznych, jednak występowanie postzygotycznych mutacji w liczbie powtórzeń może komplikować uzyskanie wyników. Obecnie nie wiadomo jaka liczba niezgodnych sekwencji VNTR występuje u bliźniąt jednozygotycznych, stąd nie można wystandaryzować metody diagnostyki zygotyczności. Warto przeprowadzić badania większej liczby polimorficznych loci. Ponadto nieprawidłowe wyniki można uzyskać z próbek DNA uzyskanych z krwi bliźniąt jednokosmówkowych. W diagnostyce prenatalnej zaleca się podwójną amniocentezę zamiast biopsji kosmówki, podobnie mylące wyniki można uzyskać w wyniku kordocentezy u bliźniąt jednokosmówkowych. Ponieważ podczas realizacji rozprawy nie zakładano wykorzystania próbek pobranych w trakcie trwania ciąż mnogich, nie można jednoznacznie potwierdzić skuteczności proponowanej powyżej metodyki. Badanie bliźniąt jednozygotycznych niezgodnych pod względem podejrzewanych chorób genetycznych i rozwojowych może być podważone przez występowanie mozaicyzmu krwi, chyba że występuje pewność co do dwukosmówkowości bliźniąt (Machin, 2009).
Za jedną z przyczyn występowania niezgodności w manifestacji cech i chorób u bliźniąt przyjmuje się występowanie heteroplazmii mitochondrialnego DNA (Avital i wsp., 2012). Badania prowadzono na jednozygotycznych bliźniętach zgodnych i niezgodnych pod względem występowania zależnej od wieku cukrzycy typu 2 (ang. age-related type 2 diabetes mellitus, T2DM). Występowanie dysfunkcji mitochondriów, pomimo występowania heteroplazmii nie było związane z rozwojem cukrzycy. Zaobserwowano jednak większy
156 udział mutacji związanych z heteroplazmią w mięśniach niż we krwi oraz wskazano na wpływ dziedziczenia na akumulację zmian i selekcję mutacji. Wiele mutacji mitochondrialnego DNA było unikalnych, jednak inne występowały w parach bliźniąt lub w różnych tkankach tej samej osoby. Zaobserwowano również większą częstość występowania zmian w sekwencjach niekodujących. Zjawisko heteroplazmii analizowano z wykorzystaniem najnowocześniejszych technik masowego sekwencjonowania i nie zaobserwowano różnic w poziomie heteroplazmii u bliźniąt z cukrzycą oraz u bliźniąt z grupy kontrolnej (Avital i wsp., 2012).
Badania własne pętli D mitochondrialnego DNA potwierdzają niewielki udział heteroplazmii u dzieci z ciąż mnogich. U bliźniąt jednozygotycznych nie wskazano zmienności, niewielki udział zmian był natomiast obserwowany u bliźniąt dwuzygotycznych.