Artyku³ przegl¹dowy Review
Warunkiem prawid³owego zap³odnienia, rozwoju zarodka jest dojrza³oæ oocytów, która dzieli siê na dojrza³oæ: j¹drow¹, cytoplazmatyczn¹ oraz genomo-w¹ (19, 23, 33, 38). Dojrza³oæ j¹drowa oocytu deter-minuje prawid³owy przebieg podzia³u mejotycznego, który koñczy siê osi¹gniêciem metafazy II (MII). Na dojrza³oæ cytoplazmatyczn¹ sk³adaj¹ siê zmiany w cytoplazmie oocytu dotycz¹ce gromadzenia substan-cji, takich jak: mRNA oraz bia³ka, konieczne do za-p³odnienia i kontynuowania podzia³ów mitotycznych zarodka. Dojrza³oæ genomowa dotyczy procesów epigenetycznych, w tym prawid³owego znakowania (imprintingu) genomu matczynego. Modyfikacje epi-genetyczne zachodz¹ w okresie wzrostu oocytu i pro-wadz¹ do zmian w ekspresji genów, bez równoczes-nej zmiany w sekwencji DNA (23, 33). Nale¿¹ do nich: metylacja DNA i modyfikacje bia³ek histonowych (acetylacja, fosforylacja, metylacja, ubikwitynizacja). Wykazano, ¿e genom ojcowski warunkuje wczesny rozwój ³o¿yska, natomiast matczyny odpowiedzialny jest za rozwój zarodka, co sugeruje ró¿ny udzia³ geno-mów matczynego i ojcowskiego. Zjawisko
imprintin-gu (piêtnowania) jest podstaw¹ zró¿nicowania ekspre-sji dla pewnej puli genów rodzicielskich w powstaj¹-cym organizmie (33).
U wiêkszoci ssaków mejoza oocytów inicjowana jest w trakcie rozwoju p³odowego, a nastêpnie wstrzy-mywana w diplotenie profazy pierwszego podzia³u mejotycznego, co okrelane jest jako pierwotne zaha-mowanie mejozy (primary meiotic arrest). W tym sta-dium oocyty utrzymywane s¹ przez kilka tygodni, a czasem kilka lat, w zale¿noci od gatunku. W okre-sie dojrzewania p³ciowego oocyty, które osi¹gnê³y swoje pe³ne rozmiary, nabywaj¹ kompetencjê umo¿-liwiaj¹c¹ kontynuowanie podzia³u mejotycznego do stadium metafazy II (25). Podczas trwania tego sta-dium dochodzi do kolejnego zahamowania mejozy (secondary meiotic arrest). Zakoñczenie mejozy II za-chodzi jedynie w momencie zap³odnienia dojrza³ej komórki jajowej (35). In vivo podtrzymywanie bloku mejotycznego w pe³ni dojrza³ych oocytach zwi¹zane jest z receptorami sprzê¿onymi z bia³kami G (G pro-tein-coupled receptors, GPRs), g³ównie GPR3, które zlokalizowane s¹ w oocytach, oraz z czynnikami hamuj¹cymi mejozê MIF (MIF meiotic inhibitory factors), które produkowane s¹ przez somatyczne
ko-Bia³ka reguluj¹ce proces dojrzewania oocytów
u ssaków*
)
MONIKA WIERCZEWSKA*, KATARZYNA ZAORSKA*, BARTOSZ KEMPISTY*,**, MICHA£ NOWICKI*
*Katedra i Zak³ad Histologii i Embriologii, **Katedra i Zak³ad Anatomii Prawid³owej Wydzia³u Lekarskiego II UM im. K. Marcinkowskiego, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ
wierczewska M., Zaorska K., Kempisty B., Nowicki M.
Proteins regulating the maturation of oocytes in mammals
Summary
In this review, the molecular aspects of meiotic division and characteristics of proteins involved in mammalian oocytes maturation have been presented. Moreover, the role of competition has also been shown. The mammalian oocytes maturation is divided into: (i) nuclear maturation; (ii) cytoplasmic maturation; and (iii) genomic maturation. The maturation processes involves the stages associated with stored proteins and mRNA as well as the inherited changes in genomic DNA methylation. The proper procedure of all stages of maturation influences the achievement by oocytes of full developmental competence and fertilization ability. Both of these processes are associated with attaining by the embryos the ability of growth and develop-ment following embryonic genome activation (EGA). The stages of oocytes maturation are regulated by the expression of specific genes encoding proteins that are expressed during early folliculo-, and oogenesis, and is species dependent. The most important proteins regulating the process of oocytes maturation involves the following: transforming growth factor of the large super family group (TGF), connexins (Cx), mitogen activated protein kinase (MAPK), protein kinase A (PKA) and epidermal growth factor (EGF).
Keywords: maturation of oocytes, gap junctions, connexins, ligand kit, transforming growth factor beta
*) Praca finansowana z projektu Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa
mórki pêcherzykowe w pêcherzykach antralnych (25, 28, 29). Przedowulacyjny wzrost LH prowadzi do indukcji mejozy. In vitro oocyty podejmuj¹ mejozê spontanicznie w momencie uwolnienia ich z pêche-rzyków antralnych, je¿eli s¹ one utrzymywane w ho-dowli w odpowiednich warunkach (3, 25, 27). Inhibi-tory mejozy, takie jak: hipoksantyna (HX), analogi cAMP, inhibitory fosfodiesterazy (PDE), mog¹ bloko-waæ spontaniczne dojrzewanie, przy czym ich hamu-j¹cy efekt mo¿e byæ przezwyciê¿ony przez dostarcza-nie do po¿ywki hodowlanej gonadotropin. Aktywacja mejozy mo¿e byæ równie¿ osi¹gniêta poprzez wzbo-gacanie po¿ywki hodowlanej o hormony i czynniki wzrostu, takie jak: lutropina (luteinizing hormone, LH), gonadoliberyna (gonadotropin-releasing hormone, GnRH), nab³onkowy czynnik wzrostu (epidermal growth factor, EGF), insulinopodobny czynnik 3 (in-sulin-like peptide 3, INSL3) (25, 27).
Bia³ka uczestnicz¹ce w podziale mejotycznym W procesie indukcji podzia³u mejotycznego wa¿n¹ rolê odgrywa równowaga pomiêdzy kinazami a fosfa-tazami. Sugeruje siê, ¿e spadek poziomu cyklicznego adenozynomonofosforanu (cyclic adenosine mono-phosphate, cAMP) w oocytach jest istotnym etapem w indukcji dojrzewania mejotycznego (6, 7, 25, 27). Wykazano, ¿e wywo³uje on zmniejszenie aktywnoci kinazy bia³kowej A (protein kinase A, PKA) i pro-wadzi do defosforylacji ufosforylowanego bia³ka ha-muj¹cego dojrzewanie (cyclin dependent kinase 1, CDK1) (25, 28). Kolejn¹ funkcj¹ deaktywacji PKA w oocytach jest sprzyjanie syntezie ma³ej liczby bia³ek koniecznych do dojrzewania mejotycznego, takich jak serynowo-treoninowa kinaza MOS (serine/threonine kinase, MOS) oraz cyklina B (25). Jedn¹ z kinaz bia³-kowych bior¹cych udzia³ w procesie indukowania doj-rzewania oocytów jest aktywowana mitogenem kina-za bia³kowa (mitogen-acivated protein kinase, MAPK),
g³ównie MAPK3/1, okrelana równie¿ jako ERK1/2. Aktywacja oraz funkcja MAPK zwi¹zana jest z ka-skad¹ fosforylacji bia³ek. Regulatorem MAPK jest kinaza MAPK, nazywana tak¿e MAP2K lub MEK, która fosforyluje serynowe i treoninowe reszty ERK1/2 (25, 35). Bia³ko MEK tak¿e jest aktywowane przez fosforylacjê. U krêgowców odpowiedzialna jest za to serynowo-treoninowa kinaza MOS (serine/threonine kinase, MOS), która jest produktem protoonkogenu c-mos. Wykazano, ¿e zahamowanie transkrypcji genu c-mos w komórkach rozrodczych myszy u osobników ¿eñskich prowadzi do obni¿onej p³odnoci oraz wy-sokiego odsetka wystêpowania potworniaków jajnika (12, 16). Ca³y szlak Mos/MAPK podczas dojrzewa-nia oocytów dzia³a poprzez aktywacjê i stabilizacjê czynnika inicjuj¹cego dojrzewanie (maturation promo-ting factor, MPF), który zbudowany jest z dwóch pod-jednostek: regulatorowej cykliny B1 oraz katalitycz-nej kinazy p34 (nazywakatalitycz-nej tak¿e CDK1 lub Cdc2 (25). W warunkach in vitro wykazano, ¿e szlak MOS/ MAPK bierze udzia³ w znoszeniu zahamowania me-jozy w wyniku hormonalnej aktywacji z udzia³em progesteronu w oocytach ¿aby szponiastej (Xenopus laevis) (ryc. 1). Badania in vitro u ssaków wskazuj¹ równie¿, ¿e aktywacja MAPK w komórkach warstwy ziarnistej otaczaj¹cych oocyt, przez gonadotropiny jest wymagana przy wznowie mejozy, co udowodniono w badaniach przeprowadzonych na oocytach mysich i wiñskich otoczonych komórkami wzgórka jajono-nego (cumulus enclosed oocytes, CEOs). Potwierdzo-no tak¿e, ¿e aktywacja MAPK odgrywa wa¿n¹ rolê, porednicz¹c w funkcji LH. W przypadku wini w ko-mórkach warstwy ziarnistej MAPK jest aktywowane natychmiast po dodaniu LH i FSH (24). Obserwowa-no równie¿ efekt kinazy bia³kowej AMP (adeObserwowa-nosine 5-monophosphate kinase-activated protein kinase, PRKA), okrelanej tak¿e jako AMPK (9, 27). Mayes i wsp. (27) wykazali istotn¹ rolê tej kinazy w regulacji dojrzewania oocytów wiñ. Zaob-serwowano ekspresjê podjednost-ki PRKAA1 w komórkach warstwy ziarnistej kompleksu COC (cumu-lus-oocyte complex, COC) i w po-zbawionych tych komórek oocytach (denuded oocyte, DO). Podjednost-ka PRKAA2 zosta³a wykryta w ko-mórkach ziarnistych i COC, pod-czas gdy produkt genu PRKAA3 nie by³ obecny w komórkach ziar-nistych, COC, DO i os³once przej-rzystej (zona pellucida, ZP). Ba-dania te wskazuj¹ na now¹ rolê PRKA w regulacji indukcji mejo-zy w COC i sugeruj¹, ¿e komórki wzgórka jajononego odgrywaj¹ znacz¹c¹ rolê w kontroli dojrzewa-nia oocytów wiñskich, gdzie prze-kanikiem jest PRKA (20, 21, 27).
Ryc. 1. Rola progesteronu w szlaku aktywa-cji oocytów u ¿ab szponiastych (Xenopus la-evis) z udzia³em MPF przez progesteron. Obni¿ony poziom cAMP/PKA aktywuje MOS oraz MEK, co skutkuje aktywacj¹ MAPK i zniesieniem zahamowania mejozy
Rola po³¹czeñ typu gap junction w dojrzewaniu oocytów
Dojrza³oæ cytoplazmatyczna zwi¹zana jest ze wzro-stem oocytu, zmianami w strukturze, dystrybucj¹ orga-nelli oraz gromadzeniem substancji biologicznie aktyw-nych konieczaktyw-nych do dalszego rozwoju. W przypadku organelli zmiany dotycz¹ po³o¿enia oraz struktury mitochondriów, rybosomów, retikulum endoplazma-tycznego, aparatu Golgiego podczas przechodzenia od stadium pêcherzyka zarodkowego (GV germinal vesicle) do stadium metafazy II (3, 26, 35). Rybosomy produkuj¹ bia³ka niezbêdne w dojrzewaniu oocytów oraz pocz¹tkowych stadiach rozwoju zarodka. Poza tym dojrza³oæ cytoplazmatyczna zwi¹zana jest z gro-madzeniem ATP, mRNA, bia³ek i czynników krypcyjnych. Niektóre z tych bia³ek mog¹ byæ trans-portuj¹cymi kinazami bia³kowymi, których liczba oraz lokalizacja zmienia siê podczas j¹drowego dojrzewa-nia oocytu. Inn¹ grupê stanowi¹ bia³ka wi¹¿¹ce RNA, tzw. bia³ka Staufen, które rozpoznaj¹ i wi¹¿¹ RNA przeznaczone do degradacji (3). Gromadzony mate-ria³ umo¿liwia prawid³owe dojrzewanie i zap³odnie-nie oraz inicjuje podzia³ komórkowy zygoty ze sta-dium 8- do 16-komórkowego (2).
Synchronizacja j¹drowego oraz cytoplazmatyczne-go dojrzewania jest istotna ze wzglêdu na uzyskanie przez oocyt kompetencji do dalszego rozwoju, co jest wa¿nym czynnikiem uczestnicz¹cym w dojrzewaniu oocytów in vitro oraz rozwoju zarodków (30).
Stopniowy wzrost i dojrzewanie oocytu w pêche-rzyku jajnikowym zale¿¹ od otaczaj¹cych pêcherzy-kowych komórek somatycznych, które tworz¹ warstwê ziarnist¹ wokó³ oocytu. Interakcje komórki somatycz-ne/oocyt poprzez po³¹czenia gap junctions s¹ dla oocy-tów ród³em energii oraz substraoocy-tów do metabolizmu oraz podzia³ów, zap³odnienia i wczesnych etapów embriogenezy (10, 30, 36).
Po³¹czenia typu gap junction s¹ to miêdzykomór-kowe kana³y zbudowane z bia³ek z rodziny koneksyn (connexin, Cx). Wród tych bia³ek g³ówn¹ rolê w pro-cesie folikulogenezy pe³ni¹ Cx43 i Cx37, co zademon-strowano w dowiadczeniach, w których uzyskano defekty w rozwoju oocytu i komórek ziarnistych u myszy, u których zidentyfikowano mutacje w genach koduj¹cych te bia³ka. Brak bia³ka Cx43 wp³ywa na folikulogenezê poprzez wstrzymywanie wzrostu pê-cherzykowego we wczesnych etapach rozwoju. Defekt ten w rozwoju komórek warstwy ziarnistej prowadzi do wielu powa¿nych konsekwencji w rozwoju oocy-tów, które blokuj¹ prawid³owe podzia³y mejotyczne (1, 5, 6). Ponadto brak lub obni¿ona ekspresja genu Cx37 powoduje zak³ócenia w póniejszych etapach folikulogenezy, wstrzymuj¹c formowanie dojrza³ych pêcherzyków. Znaczenie po³¹czeñ gap junctions po-miêdzy oocytem a komórkami warstwy ziarnistej ob-razuj¹ dowiadczenia na mysich oocytach z defektem w genie Cx37, które nie osi¹gaj¹ pe³nego wzrostu i nie nabywaj¹ kompetencji mejotycznej (6, 25, 33).
Wy-kazano, ¿e komórki warstwy ziarnistej dziêki po³¹cze-niom gap junctions pozwalaj¹ transportowaæ oko³o 85% substratów metabolicznych do oocytów, modu-luj¹ aktywnoæ transkrypcyjn¹ oocytów oraz indukuj¹ potranslacyjne modyfikacje bia³ek. Po³¹czenia gap junctions porednicz¹ równie¿ w dialogu pomiêdzy oocytem a komórkami ziarnistymi poprzez zapobie-ganie formowaniu cia³ka ¿ó³tego. U owiec brak ko-mórek wzgórka jajononego wp³ywa w znacz¹cy spo-sób na spadek aktywnoci biosyntetycznej (6).
Charakterystyka wybranych bia³ek uczestnicz¹cych w dojrzewaniu oocytów Wykazano, ¿e inicjacja wzrostu pêcherzyków anga-¿uje ligand kit (Kit Ligand, KL) i jego receptor c-kit. Bia³ko KL produkowane jest przez komórki ziarniste, natomiast receptor c-kit zlokalizowany jest w b³onie komórkowej oocytu. Wykazano, ¿e myszy z mutacj¹ w genie koduj¹cym receptor c-kit charakteryzuj¹ siê bezp³odnoci¹, a mutacje te ujawniaj¹ swój efekt po-przez b³êdy w gametogenezie (6, 14, 33).
Obecne badania skupiaj¹ siê na szlakach sygna³o-wych przebiegaj¹cych miêdzy oocytem a komórkami b³ony ziarnistej (4). Istotne jest, ¿e interakcja pomiê-dzy oocytem a komórkami pêcherzykowymi jest dwu-kierunkowa. Oocyty wydzielaj¹ specyficzne cz¹stecz-ki sygna³owe (g³ównie czynnicz¹stecz-ki wzrostu), które mog¹ wp³ywaæ na zasiêg procesów jajnikowych obejmuj¹-cych folikulogenezê, wydzielanie hormonów steroido-wych przez komórki wzgórka jajononego i prolifera-cjê, ró¿nicowanie oraz aktywnoæ wydzielnicz¹ i lu-teinizacyjn¹ komórek ziarnistych (15, 28, 32, 39). Szczególn¹ uwagê zwraca siê na grupê wchodz¹c¹ w sk³ad transformuj¹cych czynników wzrostu B (transforming growth factor B, TGFB) i ich potencjal-n¹ rolê w regulowaniu funkcji jajnika oraz osi¹gniê-cia stadium zygoty. Wiele sporód badañ wskazuje, ¿e ró¿nicuj¹cy czynnik wzrostu (growth and differentia-tion factor 9, GDF9) oraz bia³ko morfogenetyczne koci 15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15), znane tak¿e jako GDF9B, s¹ niezbêdne dla prawid³o-wego rozwoju pêcherzykoprawid³o-wego u szczurów, owiec i lu-dzi. W sk³ad rodziny TGFB wchodzi ponad 35 bia³ek. Wród nich wymienia siê: grupê TGFB, aktywiny/in-hibiny, GDF, BMP, a tak¿e hormon antymillerowski (anty-müllerian hormon AMH) (4, 6, 13, 18, 32, 34).
Rodzina bia³ek TGFB przekazuje sygna³ za pored-nictwem kompleksu receptorów zbudowanych z dwóch typów transb³onowych kinaz serynowo-treoninowych. Dotychczas zidentyfikowano siedem receptorów typu I (activin receptor-like kinases, ALK 1-7) oraz piêæ receptorów typu II (ActRII, ActRIIB, BMPRII, TGFâRII i AMHRII). Wi¹zanie bia³ek z rodziny TGFB z kompleksem receptorowym prowadzi do fosforyla-cji bia³ek Smad, bêd¹cych cz¹steczkami sygna³owy-mi, które dzia³aj¹c na ró¿ne czynniki transkrypcyjne w j¹drze komórkowym, indukuj¹ ekspresjê wybranych
genów. Wyró¿nia siê osiem rodzajów bia³ek Smad: Smad 1-8. Smad 2 i 3 aktywowane s¹ przez bia³ka z pod-rodziny TGFB/aktywina, natomiast Smad 1, 5 i 8 s¹ aktywowane przez bia³ka z podrodziny BMP. Jedno z tych bialek ulega fosforylacji i na-stêpnie oddzia³uje z bia³kiem Smad 4, które przemieszcza siê do j¹dra, gdzie reguluje transkrypcjê poprzez interak-cje z elementami regulacyjnymi trans-krypcji. Smad 6 i 7 s¹ bia³kami inhi-bitorowymi, które zapobiegaj¹ akty-wacji szlaków sygna³owych, takich jak szlak kinazy bia³kowej aktywowanej mitogenem (MAPK) (18, 22) (ryc. 2). U ssaków wród TGFB wyró¿nia siê trzy izoformy: TGFB1, TGFB2, TGFB3. mRNA/bia³ka zaobserwo-wano w komórkach ziarnistych oraz os³onkach oocytów niektórych ga-tunków, aczkolwiek wzór ekspresji TGFB wykazuje du¿¹ ró¿norodnoæ
miêdzy gatunkami. U ludzi TGFB1 zaobserwowano w oocytach pêcherzyków pierwszorzêdowych oraz w ko-mórkach os³onki i warstwy ziarnistej pêcherzyków antralnych. Intensywnoæ ekspresji wzrasta w komór-kach os³onki i ziarnistych w momencie dojrzewania pêcherzyków. TGFB2 ogranicza siê jedynie do komó-rek os³onki du¿ych preantralnych/antralnych pêche-rzyków i maleje w wiêkszych pêcherzykach. U nie-których gatunków ssaków, np. szczurów i cz³owieka, bioaktywnoæ TGFB mo¿e ujawniaæ siê zarówno w komórkach os³onki, jak i ziarnistych, w których ekspresja pojawia siê podczas wzrostu pêcherzyków preantralnych i ronie wraz z dojrzewaniem pêche-rzyka. U innych gatunków, jak: owce, krowy i winie, pêcherzykowa aktywnoæ TGFB ujawnia siê g³ównie w komórkach os³onki oocytu. W pêcherzykach owiec ekspresja TGFB mRNA ogranicza³a siê do komórek os³onki oocytów pêcherzyków preantralnych oraz antralnych. U wini os³onka wewnêtrzna jest pier-wotnym ród³em TGFB, podczas gdy w komórkach ziarnistych zachodzi ekspresja mRNA TGFB1, ale nie bia³ka. Hodowane komórki ziarniste izolowane od byd³a i wini ujawniaj¹ nisk¹ bioaktywnoæ TGFB (13, 18).
Ekspresjê BMP15 zaobserwowano w oocytach pê-cherzyków pierwszorzêdowych owiec, ludzi, szczu-rów, myszy oraz w pierwotnych pêcherzykach u opo-sów, aczkolwiek nie zaobserwowano ekspresji mRNA BMP15 w oocytach przed uformowaniem dojrza³ych pêcherzyków, co sugeruje, ¿e ten czynnik nie odgry-wa znacz¹cej roli w tym procesie. Ponieodgry-wa¿ GDF9 i BMP15 zlokalizowano w oocytach rosn¹cych pêche-rzyków u wszystkich gatunków ssaków, wskazuje siê, ¿e czynniki te odgrywaj¹ g³ówn¹ rolê w regulacji roz-woju pêcherzykowego (11, 18, 31).
U myszy GDF9 jest istotny dla prawid³owego roz-woju pêcherzykowego i jest zaanga¿owany w rozwój prawid³owego fenotypu komórek kumulusa. Bia³ko BMP15 nie jest konieczne dla prawid³owego rozwoju pêcherzykowego, ale odgrywa wa¿n¹ rolê w koñco-wym dojrzewaniu pêcherzyka i prawid³okoñco-wym rozwo-ju oocytu. W przypadku owiec zarówno GDF9, jak i BMP15 s¹ istotne dla normalnego wzrostu pêche-rzykowego, dodatkowo GDF9 mo¿e byæ zaanga¿owa-ne w luteinizacjê pêcherzyków w trakcie owulacji. GDF9 oraz BMP15 reguluj¹ liczbê owuluj¹cych pê-cherzyków u owiec, gatunku, który charakteryzuje siê niskim poziomem owulacji. Takiej roli GDF9 i BMP15 nie wyznaczono u myszy, gatunku, który ce-chuje siê wysokim poziomem owulacji. Co wiêcej, GDF9 i BMP15 sta³y siê celem dla nowych metod kontroli p³odnoci, które skupiaj¹ siê na regulowaniu liczby dojrzewaj¹cych pêcherzyków (17, 18).
GDF9 i BMP15 aktywuj¹ drogi sygna³owe w ko-mórkach wzgórka jajononego, reguluj¹c ekspresjê kluczowych genów i procesów komórkowych, nie-zbêdnych dla prawid³owego ró¿nicowania komórek CC. Wykazano, ¿e podczas dojrzewania oocytów in vitro (in vitro maturation, IVM) wzbogacenie po¿yw-ki czynnikami wydzielanymi przez oocyt (oocyte secreted factors, OSFs) znacznie wspomaga ich roz-wój. Oocyt jest g³ównym regulatorem funkcji ko-mórek warstwy ziarnistej i dlatego pe³ni wa¿n¹ rolê w regulacji oogenezy, poziomie owulacji oraz p³od-noci. Wykazano, ¿e samice myszy i owiec z defek-tem w genie GDF9 oraz owce z defekdefek-tem w genie BMP15 by³y sterylne z powodu kompletnej blokady folikulogenezy w stadium pêcherzyka I rzêdowego. Dowiadczenie in vitro, w którym traktowano komór-ki jajnikowe rekombinowanymi OSF, takomór-kimi jak:
GDF9 i BMP15, wykaza³o, ¿e produkcja progestero-nu przez komórki ziarniste u owiec jest hamowana przez rekombinowane owcze GDF9, ale wzmacniana przez mysie GDF9 (11).
Wp³yw TGFB na funkcjê komórek warstwy ziar-nistej jest ró¿ny u poszczególnych gatunków ssaków. U szczurów TGFB potencjalnie stymuluje ró¿nicowa-nie komórek ziarnistych, aczkolwiek u innych gatunków, takich jak: byd³o (TGFB2), owce (TGFB1 i TGFB2), winie (TGFB1 i TGFB2), te czynniki wzrostu wyka-zuj¹ znikom¹ aktywnoæ stymulacyjn¹, a nawet hamu-j¹cy efekt na proliferacje komórek ziarnistych. W wa-runkach in vitro bia³ka TGFB stymuluj¹ syntezê pro-gesteronu komórek ziarnistych u gryzoni, podczas gdy hamuj¹cy efekt obserwuje siê w komórkach ziarnistych pobranych od byd³a, owiec i wini. W przeciwieñstwie do efektu TGFB na komórki ziarniste, w przypadku wp³ywu na komórki os³onki w odniesieniu do ste-roidogenezy efekt jest podobny u ró¿nych gatunków (18). Badania wskazuj¹, ¿e delecja b¹d mutacja w genach GDF9 lub BMP15 mo¿e wp³ywaæ na p³od-noæ (24, 32, 34). Myszy GDF9 (-/-) by³y bezp³odne z zatrzymaniem wzrostu pêcherzykowego w stadium pêcherzyka I rzêdowego. Oocyty u tych myszy ros³y szybciej i by³y wiêksze, ale charakteryzowa³y siê wie-loma defektami strukturalnymi. Dodatkowo poziom FSH i LH wzrasta³ i obserwowano cysty jajnikowe. W przypadku BMP15 (-/-) samice myszy pozbawio-nych funkcji genu BMP15 by³y bezp³odne, wzrost pêcherzykowy by³ prawid³owy, natomiast owulacja i zap³odnienie oocytów by³y znacznie ograniczone. W przypadku GDF9 wykazano wa¿ny udzia³ tego bia³-ka w kszta³towaniu fenotypu komórek wzgórbia³-ka jajo-nonego u myszy, ale mo¿e ono pe³niæ równie¿ wa¿n¹ rolê w procesie luteinizacji. Na tej podstawie uznaje siê bia³ka GDF9 i BMP15 za nowe regulatory p³od-noci (17). Istniej¹ znacz¹ce ró¿nice miêdzy gatunka-mi, rozród myszy mo¿e przebiegaæ prawid³owo przy braku BMP15, natomiast jest to konieczny czynnik w zap³odnieniu u cz³owieka i owiec. U cz³owieka nieprawid³owa ekspresja GDF9 korelowana jest z ze-spo³em policystycznych jajników, a mutacje w GDF9 i BMP15 s¹ powi¹zane z niewydolnoci¹ jajników lub dwuzygotycznymi bliniêtami (32).
Wykazano, ¿e oocyt stymuluje proliferacjê i zwiêk-sza produkcje estradiolu (E2) przez komórki kumulu-sa. Oocyt pe³ni tak¿e istotn¹ rolê w procesie ekspansji komórek kumulusa u myszy oraz przyspiesza ten pro-ces u szczura, wini i krowy. Fenotyp komórek kumu-lusa jest odmienny od ciennych komórek ziarnistych, co jest regulowane przez du¿e stê¿enie wydzielanych przez oocyt czynników w zewn¹trzkomórkowym p³y-nie pêcherzykowym. Czynniki TGFB, GDF9 i BMP15 s¹ wykrywane w p³ynie pêcherzykowym, co wiêcej, immunoneutralizacja GDF9 czy BMP15 mo¿e mody-fikowaæ wzrost pêcherzykowy oraz stan owulacji. GDF9 wydaje siê jednym z wa¿niejszych czynników indukcji czy utrzymania fenotypu komórek wzgórka jajononego (18).
Badania przeprowadzone na szczurach wskazuj¹ na negatywne sprzê¿enie zwrotne pomiêdzy ligandem KL a BMP15, w którym to ligand KL pochodz¹cy z komó-rek ziarnistych hamuje BMP15 syntetyzowany przez oocyt, natomiast BMP15 wydzielany przez oocyt stymu-luje ekspresjê ligandu KL w komórkach ziarnistych (4). BMP15 i GDF9 s¹ bia³kami w znacz¹cy sposób wp³ywaj¹cymi na przebieg procesu dojrzewania oocy-tów in vitro. Na poziomie molekularnym zmiany we wzorze ekspresji genów i pewne nieprawid³owoci w programowaniu epigenetycznym s¹ w du¿ym stop-niu udokumentowane w zarodkach i p³odach otrzy-mywanych z oocytów hodowanych/dojrzewaj¹cych in vitro. Sugeruje siê, ¿e zmiany w zarodkach pochodz¹-cych z dojrzewaj¹pochodz¹-cych in vivo i in vitro oocytów wy-nikaj¹ z ró¿nic rodowiskowych, w których te oocyty rozwijaj¹ siê i wzrastaj¹. Ostatnie badania wykaza³y, ¿e dodanie BMP15 i GDF9, gdy oocyty poddano doj-rzewaniu in vitro, podnosi ich kompetencjê rozwojo-w¹. Natomiast Yeo i wsp. (40) wykazali, ¿e dodanie GDF9 do medium do oocytów hodowanych w warun-kach in vitro mia³o negatywny efekt na rozwijaj¹cy siê p³ód (32).
Ma³o wiadomo jest na temat wp³ywu GDF9 na roz-wój pêcherzyków jajnikowych u wini. Lee i wsp. (23) wykonali badania, których celem by³o scharakteryzo-wanie genu GDF9 u wini, jego roli w rozwoju pêche-rzykowym oocytów i dodatkowo efekt ró¿nych hor-monów na ekspresje GDF9 podczas hodowli in vitro (24). Wykazano, ¿e w wiñskich oocytach ekspresja GDF9 spada³a podczas dojrzewania, gdy dodawano po¿ywkê bez surowicy, ale z dodatkiem ro¿nych hor-monów oraz sk³adników, takich jak: hCG, PMSG czy EGF (epidermal growth factor). Taka po¿ywka jest powszechnie u¿ywana i akceptowana jako standard w hodowlach oocytów IVM (24).
W przypadku hodowli oocytów in vitro stadium me-tafazy II, tj. dojrza³oæ j¹drow¹, osi¹ga oko³o 80-90% oocytów. Problematyczne okazuje siê osi¹gniecie przez oocyty dojrza³oci cytoplazmatycznej, dlatego te¿ wzbogaca siê po¿ywki hodowlane bia³kami, amino-kwasami, hormonami (LH, GnRH), czynnikami wzro-stu (EGF, INSL3), równie¿ p³ynami ustrojowymi, jak p³ynem pêcherzykowym lub surowic¹ (24, 25, 27, 37). Czêsto dla uzyskania zarodków o wysokiej jakoci przeprowadza siê synchronizacjê cyklu mejotycznego oocytów za porednictwem dwumalanu-cyklicznego AMP (dbAMP). Stosuje siê równie¿ hodowle 2-eta-powe: etap 1 hodowla przez 20-22 godziny z dodat-kiem czynniku synchronizuj¹cego cykl mejotyczny (dbAMP), etap 2 hodowla przez 24 godziny bez tego zwi¹zku (23).
Oocyty wini wymagaj¹ nieco d³u¿szej hodowli (42--48 godzin) w porównaniu do innych gatunków zwie-rz¹t gospodarskich. Hodowlê prowadzi siê w ró¿nych po¿ywkach, do najczêciej stosowanych nale¿¹: NCSU-23 p³yn zawieraj¹cy taurynê i hipotaurynê lub sorbitol (NCSU-37), p³yn TALP (zmodyfikowany
roztwór p³ynu Krebsa-Ringera) lub TCM 199 p³yn Tissue Culture Medium 199 (23).
Podsumowanie
Na osi¹gniêcie przez oocyt pe³nej kompetencji roz-wojowej ma wp³yw wiele czynników, pocz¹wszy od równowagi miêdzy kinazami a fosfatazami, poprzez czynniki wynikaj¹ce ze struktury oocytu (po³¹czenia typu gap junctions wp³ywaj¹ce na interakcje komórek somatycznych z oocytem) i w ostatecznoci rola bia-³ek produkowanych przez sam oocyt, takich jak ró¿ni-cuj¹cy czynnik wzrostu (growth and differentiation factor 9, GDF9) czy bia³ko morfogenetyczne koci 15 (bone morphogenetic protein 15, BMP15). Szczegó-³owe poznanie mechanizmów, z³o¿onoci procesów oraz roli poszczególnych czynników bior¹cych udzia³ w procesie dojrzewania oocytów u ssaków w odnie-sieniu do dojrza³oci j¹drowej, cytoplazmatycznej i ge-nomowej oocytu pozwol¹ na optymalizacjê warunków hodowli in vitro. Ponadto, poznanie mechanizmów reguluj¹cych oogenezê umo¿liwia scharakteryzowanie kompetencji rozwojowej oocytów, jak równie¿ wyja-nienie zaburzeñ, takich jak cysty jajnikowe. Sugeru-je siê tak¿e, ¿e bia³ka wchodz¹ce w sk³ad transformu-j¹cych czynników wzrostu mog¹ pos³u¿yæ jako mar-kery prawid³owego dojrzewania oocytów.
Pimiennictwo
1.Ackert C. L., Gittens J. E., OBrien M. J., Eppig J. J., Kidder G. M.: Inter-cellular communication via connexin43 gap junctions is required for ovarian folliculogenesis in the mouse. Dev. Biol. 2001, 233, 258-270.
2.Aerts J. M., Bols P. E.: Ovarian follicular dynamics: a review with emphasis on the bovine species. Part I: Folliculogenesis and pre-antral follicle deve-lopment. Reprod. Domest. Anim. 2010, 45, 171-179.
3.Brevini T. A., Cillo F., Antonini S., Gandolfi F.: Cytoplasmic remodelling and the acquisition of developmental competence in pig oocytes. Anim. Reprod. Sci. 2007, 98, 23-38.
4.Buratini J., Price C. A.: Follicular somatic cell factors and follicle develop-ment. Reprod. Fertil. Dev. 2011, 23, 32-39.
5.Carabatsos M. J., Sellitto C., Goodenough D. A., Albertini D. F.: Oocyte--granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Dev. Biol. 2000, 226, 167-179. 6.Cecconi S., Ciccarelli C., Barberi M., Macchiarelli G., Canipari R.: Granu-losa cell-oocyte interactions. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 2004, 115S, S19-S22.
7.Dekel N.: Cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating oocyte maturation. Moll. Cell. Endocrinol. 2005, 234, 19-25.
8.Dekel N.: Protein phosphorylation/dephosphorylation in the meiotic cell cycle of mammalian oocytes. Rev. Reprod. 1996, 1, 82-88.
9.Downs S. M., Ya R., Davis C. C.: Role of AMPK throughout meiotic matura-tion in the mouse oocyte: evidence for promomatura-tion of polar body formamatura-tion and suppression of premature activation. Mol. Reprod. Dev. 2010, 77, 888--899.
10.Feng W. G., Sui H. S., Han Z. B., Chang Z. L., Zhou P., Liu D. J., Bao S., Tan J. H.: Effects of follicular atresia and size on the developmental competence of bovine oocytes: a study using the well-in-drop culture system. Therio-genology 2007, 67, 1339-1350.
11.Gilchrist R. B., Lane M., Thompson J. G.: Oocyte-secreted factors: regula-tors of cumulus cell function and oocyte quality. Hum. Reprod. Update 2008, 14, 159-177.
12.Hashimoto N., Watanabe N., Furuta Y., Tamemoto H., Sagata N., Yoko-yama M., Okazaki K., Nagayoshi M., Takeda N., Ikawa Y., Aizawa S.: Parthenogenetic activation of oocytes in c-mos-deficient mice. Nature 1994, 370, 68-71.
13.Hunter M. G., Paradis F.: Intra-follicular regulatory mechanisms in the porcine ovary. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 2009, 66, 149-164.
14.Hurk R. van den, Zhao J.: Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology 2005, 63, 1717-1751.
15.Hutt K. J., Albertini D. F.: An oocentric view of folliculogenesis and embryo-genesis. Reprod. Biomed. Online 2007, 14, 758-764.
16.Ja³ocha I., Gabry M. S., Bal J.: Rola protoonkogenu c-mos w regulacji procesu dojrzewania komórki jajowej. Postêpy Hig. Med. Dow. 2010, 64, 636-641.
17.Juengel J. L., Bodensteiner K. J., Heath D. A., Hudson N. L., Moeller C. L., Smith P., Galloway S. M., Davis G. H., Sawyer H. R., McNatty K. P.: Physio-logy of GDF9 and BMP15 signalling molecules. Anim. Reprod. Sci. 2004, 82-83, 447-460.
18.Juengel J. L., McNatty K. P.: The role of proteins of the transforming growth factor-beta superfamily in the intraovarian regulation of follicular develop-ment. Hum. Reprod. Update 2005, 11, 143-160.
19.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Analysis of selected transcript levels in porcine sper-matozoa, oocytes, zygotes and two-cell stage embryos. Reprod. Fertil. Dev. 2008, 20, 513-518.
20.Kempisty B., Antosik P., Bukowska D., Jackowska M., Lianeri M., Jakowski J. M., Jagodziñski P. P.: Assessment of zona pellucida glycoprotein and integrin transcript contents in porcine oocytes. Reprod. Biol. 2009, 9, 71-78. 21.Kempisty B., Jackowska M., Piotrowska H., Antosik P., Wona M., Bukow-ska D., Brüssow K. P., Jakowski J. M.: Zona pellucida glycoprotein 3 (pZP3) and integrin â (ITGB2) mRNA and protein expression in porcine oocytes after single and double exposure to brilliant cresyl blue test. Theriogenology 2011, 75, 1525-1535.
22.Knight P. G., Glister C.: TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development. Reproduction 2006, 132, 191-206.
23.Ka H. H., Sawai K., Wang W. H., Im K. S., Niwa K.: Amino acids in matura-tion medium and presence of cumulus cells at fertilizamatura-tion promote male pronuclear formation in porcine oocytes matured and penetrated in vitro. Biol. Reprod. 1997, 57, 1478-1483.
24.Lee G. S., Kim H. S., Hwang W. S., Hyun S. H.: Characterization of porcine growth differentiation factor-9 and its expression in oocyte maturation. Mol. Reprod. Dev. 2008, 75, 707-714.
25.Liang C. G., Su Y. Q., Fan H. Y., Schatten H., Sun Q. Y.: Mechanisms regula-ting oocyte meiotic resumption: roles of mitogen-activated protein kinase. Mol. Endocrinol. 2007, 21, 2037-2055.
26.Marteil G., Richard-Parpaillon L., Kubiak J. Z.: Role of oocyte quality in meiotic maturation and embryonic development. Reprod. Biol. 2009, 9, 203-224.
27.Mayes M. A., Laforest M. F., Guillemette C., Gilchrist R. B., Richard F. J.: Adenosine 5-monophosphate kinase-activated protein kinase (PRKA) acti-vators delay meiotic resumption in porcine oocytes. Biol. Reprod. 2007, 76, 589-597.
28.McLaughlin E. A., McIver S. C.: Awakening the oocyte: controlling primor-dial follicle development. Reproduction 2009, 137, 1-11.
29.Mehlmann L. M.: Oocyte-specific expression of Gpr3 is required for the maintenance of meiotic arrest in mouse oocytes. Dev. Biol. 2005, 288, 397--404.
30.Mermillod P., Dalbiès-Tran R., Uzbekova S., Thélie A., Traverso J. M., Perreau C., Papillier P., Monget P.: Factors affecting oocyte quality: who is driving the follicle? Reprod. Domest. Anim. 2008, 43, 293-400. 31.Moore R. K., Shimasaki S.: Molecular biology and physiological role of the
oocyte factor, BMP-15. Mol. Cell. Endocrinol. 2005, 29, 67-73.
32.Mottershead D. G., Watson A. J.: Oocyte peptides as paracrine tools for ovarian stimulation and oocyte maturation. Mol. Hum. Reprod. 2009, 15, 789-794.
33.Opiela J., K¹tska-Ksi¹¿kiewicz L.: Charakterystyka zdolnoci rozwojowej oocytów ssaków w aspekcie zap³odnienia i rozwoju zarodkowego. Cz. II. Regulacja dojrza³oci cytoplazmatycznej i genomowej. Biotechnologia 2005, 2, 151-162.
34.Otsuka F., McTavish K. J., Shimasaki S.: Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function. Mol. Reprod. Dev. 2011, 78, 9-21.
35.Sagata N.: Meiotic metaphase arrest in animal oocytes: its mechanisms and biological significance. Trends Cell. Biol. 1996, 6, 22-28.
36.Sirotkin A. V., Taradajnik T. E., Makarevich A. V., Bulla J.: Effect of folli-cular cells, IGF-I and tyrosine kinase blockers on oocyte maturation. Anim. Reprod. Sci. 1998, 51, 333-344.
37.Sun Q. Y., Nagai T.: Molecular mechanisms underlying pig oocyte matura-tion and fertilizamatura-tion. J. Reprod. Dev. 2003, 49, 347-359.
38.Trounson A., Anderiesz C., Jones G.: Maturation of human oocytes in vitro and their developmental competence. Reproduction 2001, 121, 51-75. 39.Webb R., Campbell B. K.: Development of the dominant follicle: mechanisms
of selection and maintenance of oocyte quality. Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 2007, 64, 141-163.
40.Yeo C. X., Gilchrist R. B., Thompson J. G., Lane M.: Exogenous growth differentiation factor 9 in oocyte maturation media enhances subsequent embryo development and fetal viability in mice. Hum. Reprod. 2008, 23, 67-73.
Adres autora: dr Bartosz Kempisty, ul. wiêcickiego 6, 60-781 Poznañ; e-mail: etok@op.pl
