Med. Weter. 2012, 68 (9) 562
Praca oryginalna Original paper
Dotychczas uwa¿ano, ¿e to nadmierna proliferacja dojrza³ych hepatocytów jest ród³em nowotworów w¹troby, w tym przede wszystkim raka w¹trobowo-komórkowego (hepatocellular carcinoma HCC). Nowotwór ten pojawia siê niezale¿nie od wieku u lu-dzi oraz u starych psów, rzalu-dziej kotów i koni (4, 7, 14). Wyniki ostatnich badañ przeprowadzonych na zwierzêcych modelach hepatokarcinogenezy wskazu-j¹ na uprzedni¹ aktywacjê bipotencjalnych komórek macierzystych w¹troby jako momentu zapocz¹tkowu-j¹cego HCC (11, 13). Komórki te, nazywane ze wzglê-du na kszta³t j¹dra komórkami owalnymi (KO), nie bior¹ udzia³u w fizjologicznej regeneracji narz¹du. Na-tomiast pobudzane po rozleg³ej (2/3 masy w¹troby) hepatektomii oraz po ciê¿kich i chronicznych stanach uszkodzeñ w¹troby warunkuj¹ pe³n¹ jej regeneracjê (11, 13). Wytwarzany w takich przypadkach przez komórki Kupffera czynnik martwicy nowotworów (TNFá) stymuluje KO do podzia³ów, powoduj¹c ich rozplem. Z kolei uwalniane przez aktywowane
ko-mórki gwiadziste (HSC) czynniki wzrostu (np. EGF, TGF-á, HGF) uruchamiaj¹ sygnalizacjê nasilaj¹c¹ ich wzrost i ró¿nicowanie do hepatocytów lub/i cholan-giocytów (8, 19). Okaza³o siê, ¿e po nowotworowej transformacji izolowanych KO, a nastêpnie transplan-tacji dochodzi do nadmiernej ich proliferacji, upole-dzenia ró¿nicowania i zapocz¹tkowania guzogenezy. Istotny w przebiegu transformacji nowotworowej KO jest udzia³ produktów genów, tj. c-myc, c-Ha-ras, p53 oraz koneksyn bêd¹cych specyficznymi bia³kami trans-b³onowymi, niezbêdnymi do utworzenia i dzia³ania tzw. po³¹czeñ szczelinowych (gap junctions) (7). Trans-geniczne myszy, ekspresjonuj¹ce w nadmiarze onko-gen c-myc w KO, dotkniête zostaj¹ rakiem w¹tro-bowokomórkowym, za wy³¹czenie ekspresji tego genu prowadzi do regresji nowotworu z apoptoz¹ lub ró¿nicowaniem KO.
Bior¹c pod uwagê powy¿sze cechy KO, postano-wiono okreliæ aktywnoæ proliferacyjn¹ tych komó-rek wyizolowanych od szczurów, poddanych
dzia³a-Znaczenie komórek macierzystych
w inicjacji nowotworów w¹troby u szczurów
MARTA WÓJCIK, MARIO GIORGI*, RYSZARD BOBOWIEC
Zak³ad Patofizjologii Katedry Przedklinicznych Nauk Weterynaryjnych Wydzia³u Medycyny Weterynaryjnej UP, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin
*Zak³ad Farmakologii i Toksykologii, Kliniki Weterynaryjne, Wydzia³ Medycyny Weterynaryjnej, Uniwersytet w Pizie, San Piero a Grado 56122, Piza, W³ochy
Wójcik M., Giorgi M., Bobowiec R.
Significance of stem cells in hepatocarcinogenesis in rats Summary
Hepatic oval cells (OC) are considered to be the stem cells of the liver and have been linked to the develop-ment of hepatocellular carcinoma HCC, one of the most lethal cancers. The objective of this study was to analyse the proliferative response of OC obtained from rats receiving diethylnisamine DEN. In addition, we investigated the effects of resveratrol (Res) on the proliferation and oxidative markers of OC in vitro. OC isolated by in situ collagenase liver perfusion methods were treated with different concentrations of Res for 24, 48 and 72 hours. At the end of these periods the proliferative activity of OC, the release of superoxide anion by OC and the medium concentration of malonylodialdehyd were analyzed .
The proliferation of OC cultured without Res increased from IP = 0.945 ± 0.02 to IP = 1.525 ± 0.031 after 24 and 72 hours respectively. A marked (p £ 0.05) inhibition of OC proliferation was observed in the presence of 1.0 µM, 25 µM and 100 µM of Res. A significant decrease in the release of O2. by OC, observed throughout
the experimental period, was attributed to the presence of 25 µM of Res. Exposition of OC to 100 µM of Res inhibited the release of O2. only after 48 and 72 hours of incubation. The presence of 25 µM of Res
resulted in the depletion of MDA level, which did not exceed 0.19±0.009 nM.
Proliferative activity of OC isolated from carcinogenic rats intensified throughout the culture period. When subjected to the carcinogenic effect of DEN, Res exerts anti-proliferative influence on OC. Moreover, our results provide evidence that Res attenuates oxidative stress during hepatocarcinogenesis.
Med. Weter. 2012, 68 (9) 563 niu chemicznego karcinogenu (diethylnitrozoaminy
DEN) o dzia³aniu genotoksycznym. Ponadto, opieraj¹c siê na dotychczasowych wynikach badañ wskazuj¹-cych na antyproliferacyjne i antyoksydacyjne dzia³a-nie resveratrolu (Res), postanowiono zbadaæ wp³yw tego fitoestrogenu na proliferacjê oraz parametry rów-nowagi oksydoredukcyjnej KO w warunkach in vitro.
Materia³y i metody
Do dowiadczenia u¿yto 10-tygodniowych szczurów rasy Wistar (samice, 200-250 g). W celu indukcji KO wykona-no w znieczuleniu ogólnym czêciow¹ hepatektomiê (PH), poprzez usuniecie lewego i prawego p³ata w¹troby, a na-stêpnie po 7-dniowym okresie rekonwalescencji podawa-no 0,005% roztwór diethylnitrozoaminy (DEN) w wodzie do picia. Po 6 tygodniach przyjmowania karcinogenu prze-prowadzono izolacjê KO metod¹ perfuzji w¹troby bufo-rem Krebsa-Ringera: a) zawieraj¹cym EGTA, b) nie za-wieraj¹cym jonów Ca2+ i EGTA, c) zawieraj¹cym
kola-genazê typu IV (17). W¹trobê umieszczono w pod³o¿u DMEM-HAMS12, rozdrobniono, przefiltrowano, a nastêp-nie poddano trawieniu (1 godz., 37°C) w roztworze PBS zawieraj¹cym: kolagenazê, protezê E, trypsynê i DNazê I. W kolejnym etapie zawiesinê komórek wirowano w gra-diencie Percolu (2000 rpm, 20 min). Po przep³ukaniu ko-mórki zawieszono w pod³o¿u DMEM-HAMS12 z dodat-kiem: p³odowej surowicy bydlêcej, insuliny, heparyny i mieszaniny antybiotyków, a nastêpnie wysiano do 24-do³-kowych p³ytek (5 × 105 komórek/ml). ¯ywotnoæ komórek
wyizolowanych w obu grupach dowiadczalnych, ocenio-na ocenio-na podstawie barwienia b³êkitem trypanu, wynosi³a 75--85%. Po 24 godzinach przyklejone do pod³o¿a komórki inkubowano: bez dodatku Res; I z dodatkiem 1,0 µM/ml Res; II z dodatkiem 25 µM/ml Res; III z dodatkiem 100 µM/ml do po¿ywki hodowlanej.
Po 24, 48 i 72 godz. inkubacji analizowano aktywnoæ proliferacyjn¹ komórek na podstawie testu MTT oraz uwal-nianie anionorodnika ponadtlenkowego (O2) (16, 17).
Aktywnoæ proliferacyjn¹ KO mierzono metod¹ kolory-metryczn¹ z u¿yciem odczynnika MTT (sól tetrazolowa (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl] diphenylotetrazolium bromide). Absorbancjê odczytywano przy d³ugoci fali 570 nm, a uzyskane wyniki gêstoci optycznej (OD) wykorzystano do obliczenia indeksu proliferacji (IP). Wytwarzanie O2
przez komórki oceniono za pomoc¹ reakcji Conffera. Na p³ytce 96-do³kowej 50 µl hodowli i 100 µl 0,1% roztworu b³êkitu tetrazoliowego (NBT) inkubowano 10 min. w tem-peraturze pokojowej. Wyniki odczytano w OD (przy d³u-goci fali 545 nm) i za pomoc¹ wspó³czynnika ekstynkcji równego 21,1 nM przeliczono na nM anionu ponadtlenko-wego wytwarzanego przez 1 × 105 komórek. Aldehyd
dwu-malonowy (MDA) oznaczano w pod³o¿u hodowlanym metod¹ spektrofotometryczn¹ (18). Do 1 ml zebranego pod-³o¿a dodano 2,5 ml TCA (1,22 M w 0,6 M HCl). Po inku-bacji w temperaturze pokojowej zawiesina zosta³a zmie-szana z 1,5 ml TBA (kwasu tiobarbiturowego) i wstawiona do ³ani wodnej na 25 minut. Po wystudzeniu dodane zo-sta³o 4 ml butanolu, zworteksowane i zwirowane przez 10 min. przy 1500 × g. Zawartoæ MDA mierzona by³a wobec czystego butanolu przy d³ugoci fali 532 nm.
Stê¿enie Res w pod³o¿u hodowlanym oznaczono meto-d¹ wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (15). Rozdzia³u dokonano w uk³adzie faz odwróconych przy u¿y-ciu kolumny LiChrospher 100 RP C18 (250 × 4 mm, 5 µm) i detekcji UV (d³ugoci fali l = 220 nm). Stê¿enie Res obli-czano w stosunku do standardów zewnêtrznych wg wzoru:
Cp = Cs/As × Ap,
gdzie: Cp oznacza stê¿enie Res w danej próbce; Cs stê-¿enie standardu; As pole powierzchni piku standardu; Ap pole powierzchni piku Res po analizie próbki. Opieraj¹c siê na ubytku standardu wewnêtrznego w ka¿dej próbce, uwzglêdniono straty powsta³e podczas ekstrakcji.
Dla ka¿dego badanego parametru ró¿nice miêdzy red-nimi wartociami kontrolnymi a badanymi porównywano, u¿ywaj¹c testu t-Studenta i analizowano programem Stati-stica.pl.
Wyniki i omówienie
Aktywnoæ proliferacyjna KO izolowanych od szczurów poddanych dzia³aniu DEN i inkubowanych bez dodatku Res wzrasta³a od 0,945 ± 0,02 do 1,525 ± 0,031, odpowiednio, po 24 i 72 godzinach (ryc. 1). Res we wszystkich u¿ytych w dowiadczeniu stê¿e-niach znacz¹co (p £ 0,05) hamowa³ proliferacjê KO. Zastosowanie 100 µM Res wi¹za³o siê z najni¿szym indeksem proliferacji, widocznym ju¿ w 24. godzinie hodowli (IP = 0,81 ± 0,014). Po 72 godzinach Res
Objanienie: ND poziom nieoznaczalny wybran¹ metod¹ Tab. 1. rednia procentowa zawartoæ resweratrolu w pod³o-¿u hodowlanym w warunkach dowiadczalnych
e i n e ¿ ê t s e w o i c j y W u ¿ o ³ d o p w s e R m y n a l w o d o h 24godz. 48godz. 72godz. l m / g µ 1 s e R 92,5±8,2 ND ND l m / g µ 5 2 s e R 87,0±2,8 81,5±7,4 78,2±8,5 l m / g µ 0 0 1 s e R 78,0±10,5 75,0±18,2 69,5±12,0
Ryc. 1. Indeks proliferacji KO inkubowanych bez dodatku Res oraz w warunkach ekspozycji na jego wzrastaj¹ce stê¿e-nia (n = 10, x ± s)
Objanienie: * p £ 0,05 w porównaniu do hodowli bez dodatku Res
Med. Weter. 2012, 68 (9) 564
w tym stê¿eniu równie¿ istotnie ogranicza³ prolifera-cjê KO do IP = 0,97 ± 0,04.
W hodowlach KO bez dodatku Res uwalnianie O2
nasila³o siê w czasie trwania dowiadczenia, osi¹ga-j¹c wartoæ 0,076 nM/5 × 105 komórek w 72. godz.
(ryc. 2). Res w stê¿eniu 25 µM znamiennie zmniej-sza³ przez ca³y okres inkubacji uwalnianie O2 w KO.
Najwy¿sze stê¿enie Res ogranicza³o uwalnianie tego rodnika jedynie po 48 i 72 godz. inkubacji, odpowied-nio, do 0,045 nM/5 × 105 komórek i 0,037 nM/5 × 105
komórek.
Bez dodatku Res obserwowano najpierw wzrost (0,76 ± 0,03 po 48 godz.), a nastêpnie niewielki spa-dek (0,7 ± 0,07 po 72 godz.) stê¿enia MDA w pod³o¿u hodowlanym (ryc. 3). Po najni¿szym stê¿eniu Res (1 µM /ml) zawartoæ aldehydu obni¿a³a siê jedynie przez pierwsze 48 godzin. Znacz¹cy (p £ 0,05) spa-dek MDA, utrzymuj¹cy siê przez ca³y okres inkubacji KO, obserwowano jedynie pod wp³ywem 25 µM Res,
gdzie maksymalna wartoæ MDA nie przekracza³a 0,19 ± 0,009 nM.
KO wyizolowane od szczurów poddanych dzia³aniu DEN charakteryzowa³y siê narastaj¹c¹ aktywnoci¹ proliferacyjn¹ z jednoczesnym nasilonym uwalnianiem przez nie anionorodnika ponadtlenkowyego. DEN jako karcinogen rodowiskowy jest metabolizowana w w¹trobie do reaktywnych metabolitów etylowych, które wchodz¹c w interakcje z DNA hepatocytów ha-muj¹ ich proliferacjê oraz powoduj¹ ich uszkodzenie (1, 2). Wielu autorów (3, 5, 12, 13), w tym po raz pierw-szy Wilson i Leduc, wykaza³o, i¿ masowe uszkodze-nie hepatocytów i w zwi¹zku z tym brak fizjologicz-nej regeneracji narz¹du jest sygna³em do pobudzenia puli rezerwowych komórek owalnych. Aktywacja bipotencjalnych KO obserwowana jest przede wszyst-kim w chronicznych uszkodzeniach w¹troby, tj. ciê¿-kim zatruciu alkaloidami pyrrolizydynowymi u koni, w chorobie Tyzzera na tle Clostridium piliforme, w he-mochromatozie, aflatoksycznym rozleg³ym zapaleniu w¹troby czy kamicy ¿ó³ciowej oraz u psów na tle chronicznego hepatitis (3, 12). Poza donios³¹ rol¹ KO w regeneracji w¹troby podnosi siê ich udzia³ w w¹t-robowej karcinogenezie, a w szczególnoci powsta-waniu HCC (5, 13). Dotychczasowe badania w³asne, oparte na modelu w¹trobowej karcinogenezy, wska-zuj¹, i¿ zapocz¹tkowanie neoplazji by³o poprzedzone aktywacj¹ komórek owalnych, ich nadmiern¹ prolife-racj¹ bez jednoczesnego ró¿nicowania do hepatocy-tów i/lub cholangiocyhepatocy-tów (17). W proliferacyjnej
od-Ryc. 2. Wp³yw Res na poziom uwalnianego przez KO anio-norodnika ponadtlenkowego (n = 10, x ± s)
Objanienie: jak na ryc. 1
Ryc. 3. Stê¿enie MDA w pod³o¿u hodowlanym w przebiegu hodowli KO bez resweratrolu oraz z jego dodatkiem we wzra-staj¹cych stê¿eniach (n = 10, x ± s)
Objanienie: a, b, c wartoci oznaczone ró¿nymi literami ró¿-ni¹ siê istotnie statystycznie przy p < 0,05
Ryc. 4. Rozdzia³ chromatograficzny resweratrolu (25 µg/ml) w pod³o¿u hodowlanym po 48 godz. (A) oraz 72 godz. hodow-li (B)
Med. Weter. 2012, 68 (9) 565 powiedzi KO na dzia³anie chemicznego uszkodzenia
w¹troby bierze udzia³ szereg czynników wzrostu, tj, EGF (epidermal growth factor), TGFá (transforming growth factor-á), HGF (hepatocyte growth factor), ro-dzina TNF (tumor necrosis factor) oraz interferon-ã. (9, 10). Dzia³anie EGF i TGFá wi¹¿e siê z aktywacj¹ receptorowej (EGFR) kinazy tyrozynowej. Z kolei wytwarzany zarówno w w¹trobie, jak i poza ni¹ HGF ³¹czy siê z odmiennym receptorem (c-met), nasilaj¹c proliferacjê KO (9).
Wobec braku skutecznej terapii HCC coraz czêciej zwraca siê uwagê na chemoprewencjê tego typu nowotworu z u¿yciem naturalnych sk³adników pokar-mowych, do których nale¿y m.in. resweratrol (1, 2). Szereg dotychczasowych wyników badañ wskazuje, i¿ ta fitoaleksyna, obok wp³ywu na proces zapalny towarzysz¹cy karcinogenezie, moduluje proliferacjê i apoptozê komórek w ró¿nych typach nowotworów. Ponadto wp³ywa na angiogenezê i potencja³ metasta-tyczny guzów nowotworowych (1, 2). Zastosowany w niniejszym dowiadczeniu Res hamowa³ aktywnoæ proliferacyjn¹ KO in vitro, a efekt ten pozostawa³ niezale¿ny od zastosowanego stê¿enia fitoestrogenu. W stosunku do uwalniania przez KO anionorodnika ponadtlenkowego udzia³ Res nie by³ ju¿ tak jedno-znaczny. Jedynie fitoestrogen w rednim i najwy¿szym stê¿eniu skutecznie ogranicza³ uwalnianie O2.
Podob-nie Res wp³ywa³ na poziom MDA, ograniczaj¹c tym samym jego mutagenny i karcinogenny wp³yw na ko-mórki. Uzyskane wyniki w³asne wydaj¹ siê potwier-dzaæ osi¹gniêcia Bishayee i wsp. (2), którzy wykazali ¿e Res obecny w diecie w niskich stê¿eniach nie ha-mowa³ promocji guzów w¹troby wywo³anych poda-waniem szczurom 3,3,4,4-tetrachlorobifenylu. Z dru-giej jednak strony, reguluj¹c ekspresjê bia³ek i czynni-ków transkrypcyjnych w³¹czonych w syntezê DNA i cykl komórkowy (p53, cykliny, CDK cell division kinases, NFkB, MAPKs), Res uznawany jest przez wielu autorów za skuteczny czynnik chemoprewen-cyjny (1, 2, 6). Jego dzia³anie przeciwzapalne pole-gaj¹ce na hamowaniu aktywnoci cykooksygenazy-2 (COX-2), a tym samym ograniczeniu wytwarzania prostaglandyn, nasila efekt hepatoprotekcyjny (6).
Wnioski
Obok dzia³ania antyoksydacyjnego, resweratrol wp³ywa³ hamuj¹co na proliferacjê komórek owalnych, wzbudzanych podawaniem chemicznego karcinogenu u szczurów.
Pimiennictwo
1.Bishayee A., Barnes K. F., Bhatia D., Darves A. S., Carrol R. T.: Resveratrol supress oxidative stress and inflamatory response in diethylnitrosamine--initiated rat hepatocarcinogenesis. Cancer Prev. Res. 2010, 3, 753-763. 2.Bishayee A., Dhir N.: Resveratrol-mediated chemoprevention of
diethyl-nitrosamine-initited hepatocarcinogenesis: inhibition of cell proliferation and induction of apoptosis. Chem. Biol. Interact. 2009, 179, 131-144. 3.Bergero D., Nervy J.: Hepatic diseases in horses. J. Anim. Physiol. Anim.
Nutr. 2008, 92, 345-355.
4.Fukui Y., Sato J., Sato R., Yasuda J., Naito Y.: Canine serum thermostable alkaline phosphatase isoenzyme from a dog with hepatocellular carcinoma. J. Vet. Med. Sci. 2006, 68, 1129-1132.
5.Laconi E.: Differential growth: From carcionogenesis to liver repopulation. Am. J. Pathol. 2000, 156, 389-392.
6.Lee E., Shin M., Yoon S., Moon J.: Resveratrol inhibits dimethylnitrosamine--induced hepatic fibrosis in rats. Arch. Pharm. Res. 2010, 33, 925-932. 7.Libbrecht L., Roskams T.: Hepatic progenitor cells in human liver diseases.
Cell. Dev. Biol. 2002, 13, 389-396.
8.Lowes K. N., Croager E. J., Olynyk J. K., Abraham L. J., Yeoh G. C.: Oval cell-mediated liver regeneration: Role of cytokines and growth factors. J. Gastroenterol. Hepatol. 2003, 18, 4-12.
9.Nagy P., Bisgaard H. C., Santoni-Rugiu E., Thorgeirrson S. N.: In vivo infu-sion of growth factors enhances the mitogenic response of rat hepatic ductal (Oval) cells after administration of 2-Acetylaminofluorene. Hepatology 1996, 23, 71-79.
10.Oh S. I., Ieather M., Iatch I., Petersen B. E.: Hepatic oval stem cell in liver regeneration. Cell. Dev. Biol. 2002, 13, 405-409.
11.Petersen B. E.: Hepatic stem cells: coming full circle. Blood. Cell. Mol. Dis. 2001, 27, 590-600.
12.Routhuizen J., Van den Ingh T. S.: Hepatitis in dog, a review. Tjidskr. Dier-genees. 1998, 15, 246-252.
13.Sell S.: Cellular origin of hepatocellular carcinomas. Cell. Dev. Biol. 2002, 13, 419-424.
14.Shiga A., Shirota K., Enomoto M.: Combined hepatocellular and cholangio-cellular carcinoma in a dog. J. Vet. Med. Sci. 2001, 63, 483-486.
15.Wang Ch., Prasain J., Barnes S.: Review of the methods used in the determi-nation of phytoestrogens. J. Chromatogr. 2002, 777, 3-28.
16.Wessely-Szponder J., Szponder T.: Comparison of the effects of two anaesthetic combinations in rabbits on some neutrophil functions in vitro. World Rabbit Sci. 2010, 18, 169-177.
17.Wójcik M., Bobowiec R., Martelli F.: Effect of carotenoids on in vitro pro-liferation and differentiation of oval cells during neoplastic and non-neo-plastic injures in rats. J. Physiol. Pharmacol. 2008, 59, Supl. 2, 203-213. 18.Wójcik M., Kosior-Korzecka U., Bobowiec R.: Cytoprotective action of
17â-oestradiol against iron-induced hepatic oxidative stress in vitro. Bull. Vet. Inst. Pulawy 2010, 54, 259-263.
19.Zimmermann A.: Liver regeneration. The emergence of new pathways. Med. Sci. Monit. 2002, 8, 53-63.
Adres autora: dr Marta Wójcik, ul. Akademicka 12, 20-033 Lublin; e-mail: marta.wojcik@up.lublin.pl
