Mariola Drozdowska, Teresa Leszczyńska, Aneta Koronowicz, Ewelina Piasna-Słupecka, Dominik Domagała
WPŁYW SOKU Z MŁODYCH PĘDÓW KAPUSTY GŁOWIASTEJ BIAŁEJ (B. OLERACEA VAR. CAPITATA F. ALBA)
NA ŻYWOTNOŚĆ KOMÓREK NOWOTWOROWYCH GRUCZOŁU PIERSIOWEGO LINII MCF-7 * Katedra Żywienia Człowieka, Wydział Technologii Żywności,
Uniwersytet Rolniczy im. Hugona Kołłątaja w Krakowie Kierownik: prof. dr hab. inż. T. Leszczyńska
Numerous research results confi rm the effective impact of bioactive food in-gredients of plant origin on the risk of diseases, including cancer. Cruciferous vegetables (white headed cabbage) are a valuable source of bioactive substan-ces in the diet. The purpose of the study was to applied the effect of juice from young shoots of white headed cabbage on the breast cancer cell line (MCF-7). It was found that juice from young shoots of white headed cabbage decrease the viability of MCF-7 breast cancer cells.
Hasła kluczowe: młode pędy, kapusta głowiasta biała, żywotność, nowotwór piersi. Key words: young shoots, white headed cabbage, viability, breast cancer.
Według Krajowego Rejestru Nowotworów liczba zachorowań na nowotwo-ry złośliwe w Polsce w ciągu ostatnich trzech dekad wzrosła ponad dwukrotnie. Od 2003 r. diagnozuje się ok. 120 tys. nowych przypadków rocznie, przy czym w 2014 r. stwierdzono ich już ponad 156 tys. (95 tys. zgonów). Nowotwory wykry-wane są najczęściej w narządach płciowych oraz w układzie pokarmowym i odde-chowym. Wśród kobiet najczęściej występującymi są nowotwory piersi i jajników (1). W ostatnich latach coraz większą uwagę zwraca się na rolę diety w profi laktyce oraz ograniczaniu ryzyka rozwoju tych chorób. Pojawiające się wciąż doniesienia, dotyczące wpływu diety na zapobieganie chorobom nowotworowym, poskutko-wały wprowadzeniem pojęcia chemoprewencji. Jest to działanie opierające się na zastosowaniu substancji bioaktywnych, naturalnie występujących w żywności, bądź nietoksycznych środków farmakologicznych, w celu zahamowania lub spowalniania procesu kancerogenezy, a nawet jego odwrócenia (2).
Cennym narzędziem chemoprewencji są biologicznie aktywne składniki żywności pochodzenia roślinnego. Należą do nich m.in. glukozynolany, polifenole, witamina * Badania zostały sfi nansowane z dotacji celowej na naukę przyznanej przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr BM-2707/WTŻ/2018
C, E, czy też karotenoidy. Bardzo dobrym źródłem takich substancji w codziennej diecie mogą być warzywa krzyżowe. W Europie Środkowej jednymi z najważniej-szych żywieniowo warzyw należących do tej rodziny, stanowiących tradycyjny element diety, są kapusta głowiasta biała i czerwona. Warzywa te spożywane są w stosunkowo dużych ilościach przez cały rok, zarówno w postaci surowej jak i po obróbce technologicznej (3).
Kapusta głowiasta biała jest bogata w związki bioaktywne, takie jak: witamina C, karotenoidy, składniki mineralne, czy też błonnik pokarmowy. Przeciwnowotworo-we właściwości tego warzywa związane są głównie z obecnością związków siarko-wych, które nazywamy glukozynolanami. Produkty enzymatycznej lub termicznej degradacji tych związków (np. izotiocyjaniany, idole, nitryle) odznaczają się wysoką aktywnością. Wykazują one dodatkowo działanie antyangiogenne, antyprzerzutowe, przeciwzapalne, przeciwbakteryjne i przeciwwirusowe (4, 5).
Większość danych literaturowych wskazuje na przeciwnowotworowe działanie jedynie pojedynczych związków zawartych w warzywach w fazie ich pełnej doj-rzałości. Bardzo dobrze opisane są właściwości przeciwnowotworowe np. izotio-cyjanianów, jako produktów rozpadu glukozynolanów (6, 7). Takie jednostkowe podejście badawcze, z żywieniowego punktu widzenia, nie uwzględnia wzajem-nych interakcji zawartych w produkcie składników, polegających na hamowaniu lub wzmacnianiu ich przeciwnowotworowego działania. Badania pilotażowe autorów niniejszej publikacji wykazały, że sok z młodych pędów kapusty głowiastej białej wykazywał działanie antyproliferacyjne względem wybranych linii komórkowych. Młode pędy opisywanego warzywa mogą być zatem bogate w związki bioaktywne oraz mogą stanowić łatwo dostępny, prozdrowotny komponent całodziennej diety.
Celem przeprowadzonych badań była ocena wpływu soku z młodych pędów kapusty głowiastej białej na żywotność komórek nowotworowych gruczołu pier-siowego linii MCF-7.
MATERIAŁ I METODY
Komórki nowotworowe gruczołu piersiowego MCF-7 (ATTC Collection, USA) hodowano w medium MEM (Sigma-Aldrich) z dodatkiem 10% FBS (Gibco), an-tybiotyku (SigmaAldrich) (100 μg/cm3) pirogronianu sodu (Sigma-Aldrich) (110
mg/dm3) i insuliny (Sigma-Aldrich) (0,01mg/cm3), w inkubatorze o
kontrolowa-nych warunkach (temp. 37°C, 95% powietrza, 5% CO2). Młode, czternastodniowe
pędy kapusty głowiastej białej (odmiana Gloria di Enkhuizen) zostały pozyskane ze Stacji Doświadczalnej Katedry Roślin Warzywnych i Leczniczych Uniwersytetu Rolniczego w Mydlnikach koło Krakowa.
Wpływ soku z młodych pędów kapusty głowiastej białej, względem komórek nowotworowych, badano w zakresie stężeń 1–10% oraz przedziale czasowym 24– 72 h. Komórki wysiano na płytki 96-dołkowe w ilości 8 tys. komórek na dołek i ho-dowano przez 24 godz. Następnie medium wymieniano na pożywkę zawierającą sok z młodych pędów kapusty głowiastej białej i hodowlę kontynuowano przez kolejne 24, 48 i 72 godz. Po tym czasie dokonano oceny żywotności komórek testem kolo-rymetrycznym z użyciem fi oletu krystalicznego. Medium z nad komórek usunięto, a komórki utrwalono metanolem i barwiono 0,5% roztworem fi oletu krystalicznego
przez 4 min. Nadmiar barwnika odpłukano wodą destylowaną a komórki odbarwio-no roztworem zawierającym kwas octowy o stęż. 0,069 mol/dm3, cytrynian sodu
o stęż. 0,037 mol/dm3 w 1:1 H
2O/metanol. Pomiary absorbancji wykonano przy dł.
fali 590 nm. Wyniki przedstawiono jako % kontroli ±SD (odchylenie standardowe). W pracy przeprowadzono również test cytotoksyczności za pomocą komercyj-nie dostępnego zestawu LDH Cytotoxicity Assay Kit (Thermo Fisher Scientifi c), mierzącego aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH) uwalnianej do medium hodowlanego podczas śmierci komórek. Poziom LDH w supernatancie określono poprzez spektrofotometryczny pomiar ilości produktu enzymatycznej reakcji kon-wersji soli tetrazolowej do kolorowego formazanu. Stężenie produktu określano mierząc absorbancję przy dł. fali 490 nm.
Wszystkie oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach, w dwóch niezależnych doświadczeniach. Wartości na wykresach przedstawiono jako średnie ±SD. Istot-ność statystyczną sprawdzano testem t-Studenta przy p<0,05.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Oznaczanie cytotoksycznego wpływu różnych substancji w hodowlach in vitro jest niezbędnym etapem badań, dotyczącym ich aktywności biologicznej względem komórek nowotworowych. Służy również do ustalenia bezpiecznego zakresu stężeń tych związków względem komórek prawidłowych (8). Dehydrogenaza mleczanowa, jako wewnątrzkomórkowy enzym, w prawidłowych warunkach fi zjologicznych nie przechodzi przez błonę komórkową i nie jest uwalniana z nieuszkodzonych komó-rek. Jej obecność w medium świadczy o uszkodzeniu błony komórkowej i wzroście przepuszczalności, powodowanej toksycznym wpływem badanego czynnika na ko-mórkę. Jak wskazują wyniki niniejszych badań żadne z zastosowanych stężeń soku z młodych pędów kapusty głowiastej białej nie wywołało istotnego wzrostu aktyw-ności LDH, a obliczone wartości cytotoksyczaktyw-ności nie przekraczały 10% (tab. I).
Ta b e l a I. Cytotoksyczność soku z młodych pędów kapusty głowiastej białej względem komórek nowotworowych gruczołu piersiowego linii MCF-7 w czasie 24, 48 i 72 godz. inkubacji
Ta b l e I. Cytotoxic effect of juice from young shoots of white headed cabbage on the breast cancer cell line MCF-7 in 24, 48 and 72 hours of incubation
Stężenie soku (%) MCF-7 cytotoksyczność (%) Stężenie soku (%) MCF-7 cytotoksyczność (%) Stężenie soku (%) MCF-7 cytotoksyczność (%) Sok vs kontrola ± SD Sok vs kontrola ± SD Sok vs kontrola ± SD 24 h 48 h 72 h 1 1,46 ± 0,017 1 4,97 ± 0,098 1 3,04 ± 0,039 2 1,68 ± 0,004 2 4,80 ± 0,021 2 3,88 ± 0,008 3 2,52 ± 0,005 3 3,34 ± 0,005 3 3,51 ± 0,023 4 1,30 ± 0,007 4 2,22 ± 0,009 4 4,76 ± 0,001 5 1,03 ± 0,022 5 6,12 ± 0,012 5 7,68 ± 0,094 10 2,02 ± 0,001 10 10,93 ± 0,021 10 9,03 ± 0,004
Badania żywotności komórek MCF-7 pod wpływem soku z młodych pędów kapusty głowiastej białej przeprowadzono za pomocą testu barwienia fi oletem kry-stalicznym. Wykazano wpływ rosnącego stężenia soku oraz czasu działania na ob-niżanie żywotności komórek (przy p<0,05) (ryc. 1). Największą zmianę żywotności komórek (obniżenie o 70%) odnotowano przy najwyższym z badanych stężeń soku (10%) i najdłuższym czasie inkubacji (72 h) (ryc.1). Należy równocześnie pod-kreślić, że po 72 h inkubacji, dla wszystkich badanych stężeń soków, wykazano obniżenie żywotności komórek od 30%, przy najniższym 1% stężeniu soku, do 70% przy 10% stężeniu soku (ryc. 1).
Wyniki przedstawiono jako % kontroli, średnie ± SD, *p<0,05.
Ryc. 1. Zmiany żywotności komórek nowotworowych gruczołu piersiowego linii MCF-7 pod wpływem soku z młodych pędów kapusty głowiastej białej po 24, 48 i 72 godz. inkubacji.
Fig. 1. Changes of the viability of cancer cell line MCF-7 after treatment of juice from young shoots white headed cabbage after 24, 48 and 72 hours of incubation.
Chemoprewencyjne właściwości kapusty głowiastej białej mogą wynikać z sy-nergistycznego działania wszystkich związków bioaktywnych zawartych w tym wa-rzywie. Produkty rozkładu glukozynolanów mogą modulować ekspresję enzymów fazy I i II detoksykacji, co zapobiega uszkodzeniu DNA w komórce, jak również regulować cykl komórkowy oraz apoptozę (9, 10, 11). Związki polifenolowe oraz witaminy zawarte w warzywach kapustnych wykazują dużą aktywność przeciwu-tleniającą, przejawiającą się zdolnością wyłapywania wolnych rodników tlenowych, ochroną organizmu przed stresem oksydacyjnym, czy też regulacją proliferacji i indukcji śmieci komórkowej (12, 13). Dotychczasowa wiedza na temat przeciw-nowotworowych właściwości związków bioaktywnych, zawartych w warzywach krzyżowych, dotyczy działania pojedynczych związków. Niewiele jest natomiast badań nad wpływem mieszaniny związków zawartych w tych warzywach na rozwój nowotworów. Badania in vitro prowadzone na liniach komórkowych, dotyczące wpływu soku lub ekstraktu z warzywa w fazie pełnej dojrzałości, wykazały, że substancje zawarte w tym warzywie wykazują silne działanie antyproliferacyjne, m. in. względem komórek linii MCF-7 (14). Badania przeprowadzone na
zwierzę-tach wykazały również, że duże spożycie warzyw z rodziny krzyżowych, takich jak kapusta głowiasta, brokuły, brukselka, kalafi or, może chronić organizm przed rozwojem nowotworów (15). W dotychczasowej literaturze nie znaleziono danych dotyczących przeciwnowotworowego działania młodych pędów warzyw. Na pod-stawie uzyskanych wyników można stwierdzić, że młode pędy kapusty głowiastej białej, jako część wegetatywna warzywa, mogą być źródłem substancji biologicznie aktywnych o potencjalnym działaniu przeciwnowotworowym.
WNIOSKI
1. Sok z młodych pędów kapusty głowiastej białej w badanym zakresie stężeń 1–10% nie wykazywał cytonekrotycznego wpływu wobec komórek nowotworo-wych linii MCF-7.
2. Sok z młodych pędów kapusty głowiastej białej wpływał na obniżenie ży-wotności komórek nowotworowych linii MCF-7. Obniżenie żyży-wotności komórek nasilało się ze wzrostem stężenia soku oraz czasu inkubacji komórek.
3. Przedstawione wyniki badań wstępnych stanowią podstawę do podjęcia dal-szych prac nad potencjalnymi przeciwnowotworowymi właściwościami młodych pędów kapusty głowiastej białej.
M . D r o z d o w s k a, T. L e s z c z y ń s k a , A. K o r o n o w i c z, E. P i a s n a - S ł u p e c k a, D. D o m a g a ł a
THE EFFECT OF JUICE FROM YOUNG SHOOTS OF WHITE HEADED CABBAGE (B. OLERACEA VAR. CAPITATA F. ALBA) ON THE VIABILITY
OF MCF-7 BREAST CANCER CELLS S u m m a r y
Introduction. Higher consumption of vegetables in general may protect against some diseases, including some types of cancer. Cruciferous vegetables (white headed cabbage) contain a polyphenols, carotenoids, vitamins, minerals, and a group of substances known as glucosinolates, which are sulfur--containing chemicals. Glucosinolates degradation products have strong anticancer properties.
Aim. The purpose of the study was to applied the effect of juice from young shoots of white cabbage on the breast cancer cell line (MCF-7).
Material ad methods. The human breast cancer cells MCF-7 were cultured in appropriate, respec-tively, medium according to the ATCC protocol. Cells were seeded on 96-well and 24 h after seeding, growth medium was replaced with a medium containing juice from young shoots of white cabbage. The fi nal applied concentrations of each treatment were 1, 2, 3, 4, 5 and 10% for 24, 48 and 72 h. Cy-totoxicity of the juice was examined by a commercially available CyCy-totoxicity Detection (LDH) test. Cell viability was determined by Crystal Violet Assay.
Results. Juice from young shoots of white cabbage in the investigated concentration range 1–10% did not show a cytonekrotic effect on MCF-7 breast cancer cells. However, the infl uence of increasing juice concentration and time of incubation on decreasing cell viability was demonstrated. The greatest change in cells viability (reduction of 70%) was observed at the highest concentration of juice (10%) and the longest incubation time (72 hours).
Conclusions. Juice from young shoots of white headed cabbage decrease the viability of MCF-7 breast cancer cells. Young shoots of white headed cabbage, as part of a plant that is in the phase of intensive growth, can be a good source of substances with health-promoting, including anticancer properties.
PIŚMIENNICTWO
1. Bray F., Ren J.S., Masuyer E., Ferlay J.: Global estimates of cancer prevalence for 27 sites in the adult population in 2008. Int. J. Cancer., 2013; 132(5): 1133-1145. – 2. Gosslau A., Chen K.Y.: Nutra-ceuticals, apoptosis, and disease prevention. Nutrition, 2004; 20(1): 95-102. – 3. Šamec D., Pavlović I., Salopek-Sondi B.: White cabbage (Brassica oleracea var. capitata f. alba): botanical, phytochemical and pharmacological. Phytochem. Rev., 2017; 16(1): 117-135. – 4. Fimognari C., Hrelia P.: Sulforaphane as a promising molecule for fi ghting cancer. Mutat. Res., 2007; 635(2-3): 90-104. – 5. Chen C., Kong A.N.: Dietary cancer-chemopreventive compounds: from signaling and gene expression to pharmacological effects. Trends Pharmacol. Sci., 2005; 26(6): 318-326. – 6. Novio S., Cartea M.E., Soengaz P., Freire-Garabal M., Núñez-Iglesias M.J.: Effects of Brassicaceae isothiocyanates on prostate cancer. Molecules, 2016; 21(5): 626. – 7. Sharma A., Sharma A., Yadav P., Singh D.: isothiocyanates in brassica: potential anticancer agents. Asian. Pac. J. Cancer Prev., 2016; 17(9): 4507-4510. – 8. Anuszewska E.: Badanie aktywności cytotoksycznej produktów leczniczych i wyrobów medycznych. Gazeta Farmaceutyczna, 2010. – 9. Higdon J.V., Delage B., Williams D.E., Dashwood R.H.: Cruciferous vegetables and human cancer risk: epidemiologic evidence and mechanistic basis. Pharmacol. Res., 2007; 55(3): 224-236. – 10. Thomson C.A., Newton T.R., Graver E.J., Jackson K.A., Reid P.M., Hartz V.L., Cussler E.C., Hakim I.A.: Cruciferous vegetable intake questionnaire improves cruciferous vegetable intake estimates. J. Am. Diet Assoc., 2007; 107(4): 631-643.
11. Keck A., Finley J.W.: Cruciferous vegetables: cancer protective mechanisms of glucosinolate hydrolysis products and selenium. Integr. Cancer Ther., 2014; 3(1): 5-12. – 12. Scalbert A., Manach C., Morand C., Rémésy C., Jiménez L.: Dietary polyphenols and the prevention of diseases. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 2005; 45(4): 287-306. – 13. Singh J., Upadhyay A.K., Prasad K., Bahadur A., Rai M.: Variability of carotenes, vitamin C, E and phenolics in Brassica vegetables. J. Food Compos. Anal., 2007; 20(2): 106-112. – 14. Boivin D., Lamy S., Lord-Dufour S., Jackson J., Beaulieu E., Côté M., Moghrabi A., Barrette S., Gingras D., Béliveau R.: Antiproliferative and antioxidant activities of common vegetables: a comparative study. Food Chem., 2009; 112(2): 374-380. – 15. Singh A.V., Xiao D., Lew K.L., Dhir R., Singh S.V.: Sulforaphane induces caspase-mediated apoptosis in cultured PC-3 human prostate cancer cells and retards growth of PC-3 xenografts in vivo. Carcinogenesis, 2014; 25(1): 83-90.
