Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 804
Praca oryginalna Original paper
W Polsce nie podejmowano dotychczas badañ
mo-nitoringowych nad statusem epidemiologicznym
chla-mydofilozy (dotychczas zwanej chlamydioz¹) byd³a.
Dane odnonie do uaktualnionej taksonomii
drobno-ustrojów z rodziny Chlamydiaceae, podobnie jak
in-formacje o ich patogennoci dla ludzi i zwierz¹t, by³y
w ostatnim czasie przedmiotem licznych publikacji (7,
9, 15, 19, 21) w tym tak¿e w jêzyku polskim (5, 12,
14, 18).
Bior¹c pod uwagê fakt du¿ej migracji zwierz¹t,
szczególnie zwi¹zanej z ich importem oraz brak
opra-cowañ dotycz¹cych byd³a rodzimego,
przeprowadze-nie serologicznych badañ monitoringowych,
obrazu-j¹cych obecnoæ przeciwcia³ anty-Chlamydophila
psit-taci i Chlamydophila abortus (Cp. psitpsit-taci, Cp.
abor-tus) w populacji byd³a w Polsce wydaje siê w pe³ni
zasadne. Warto podkreliæ, ¿e zgodnie z danymi
pi-miennictwa, sta³e ogniska tej zoonozy u byd³a oraz
u owiec i kóz wystêpuj¹ u naszych s¹siadów, np.
Niem-cy, czeskie Morawy (21). Potwierdzaj¹ to równie¿
ba-dania, wykonywane w krajowym laboratorium
refe-rencyjnym w zakresie chlamydiozy w Pu³awach, z
któ-rych wynika, ¿e u tryków i owiec eksportowanych
z Polski stwierdzano przeciwcia³a anty-Cp. abortus
w wysokim mianie (1/256 czy 1/516), a u byd³a
prze-ciwcia³a anty-Cp. psittaci i Cp. abortus.
Warto równie¿ przypomnieæ, ¿e chlamydofiloza jako
zoonoza stwarza du¿e niebezpieczeñstwo dla ludzi.
Potencja³ zoonotyczny drobnoustrojów z rodziny
Chla-mydiaceae ilustruje ryc. 1.
Celem podjêtych badañ by³a ocena wystêpowania
przeciwcia³ anty-Cp. psittaci i Cp. abortus w
dostêp-nej populacji byd³a w Polsce, a tak¿e dokonanie
po-równawczej analizy serologicznych metod
jakocio-wych (odczyn wi¹zania dope³niacza OWD) i
ilocio-wych (test ELISA) stosowanych w diagnostyce
chla-mydofilozy prze¿uwaczy.
Wystêpowanie przeciwcia³ anty-Chlamydophila spp.
w wybranej populacji byd³a w Polsce
KRZYSZTOF NIEMCZUK
Laboratorium Diagnostyki Serologicznej/Zak³ad Chorób Byd³a i Owiec
Pañstwowego Instytutu Weterynaryjnego Pañstwowego Instytutu Badawczego, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu³awy
Niemczuk K.
Occurrence of anti-Chlamydophila sp. antibodies in selected cattle populations in Poland
Summary
Bovine chlamydophilosis monitoring programs have not been run in Poland during the last decade, there-fore the epidemiological status of the disease remains unrecognised. Recently observed animal movements, including international trade and import of livestock into Polish territory, support the necessity of serological surveillance of chlamydophilosis in representative subsets of the Polish bovine population. The aim of the study was the evaluation of Chlamydophila psittaci and Chlamydophila abortus seroprevalence in a subset of the bovine population and the comparative evaluation of serological techniques used in chlamydophilosis diagnostics (CFT, ELISA).
Keywords: cattle, Chlamydophila sp.
Cp. psittaci Cp. abortus Cp.psit taci/abort us Cp.pneumoniae Cp. pecorum Cp. psittaci/abortus C. suis Cp. felis Cp. psit taci/ abort us Cp. pecorum Cp. pneumoniae
Ryc. 1. Potencja³ zoonotyczny drobnoustrojów z rodziny Chla-mydiaceae
Objanienia: Cp. drobnoustroje z rodzaju Chlamydophila, C. drobnoustroje z rodzaju Chlamydia, ® ród³a zaka¿enia cz³o-wieka znane dotychczas, Þ inne, potwierdzone po reklasyfikacji drobnoustrojów z rodziny Chlamydiaceae ród³a zaka¿enia cz³o-wieka nowymi gatunkami tych bakterii
Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 805
Materia³ i metody
Badania serologiczne wykonano z wykorzystaniem mikrome-tody odczynu wi¹zania dope³niacza, techniki diagnostycznej za-lecanej w tego typu badaniach przez Miêdzynarodowe Biuro ds. Epizootii O.I.E., a ponadto zwalidowanej w warunkach laborato-rium oraz akredytowanej przez Polskie Centrum Akredytacji (PCA, nr akredytacji AB 544) zgodnie z norm¹ PN-EN ISO/IEC 17025:2001/Ap1:2003. W odczynie tym u¿yto reagentów ze szwajcarskiej firmy Virion oraz z Wytwórni Surowic i Szczepio-nek Biomed Kraków. Przed ka¿dym badaniem przeprowadzo-no wewn¹trzlaboratoryjn¹ kontrolê, tj. miaprzeprowadzo-nowanie antygenu wobec surowicy kontrolnej pozytywnej oraz sprawdzenie aktyw-noci pozosta³ych reagentów u¿ytych w odczynie, celem stwier-dzenia ich faktycznego miana/aktywnoci w odniesieniu do deklarowanego przez producentów. Odczyn w³aciwy OWD, jak i poszczególne jego etapy oraz interpretacjê wyników wykonano zgodnie z zaleceniami zawartymi w Manual of standards for diag-nostic tests and vaccines (1) oraz w Instrukcji G³ównego Lekarza Weterynarii (13). Dodatkowo ka¿da próbka badana by³a dwoma testami ELISA, jednym wykrywaj¹cym gatunkowo swoiste prze-ciwcia³a anty-Cp. psittaci (test A, producent Dr Bommeli), dru-gim przeciwcia³a wobec immunogennego bia³ka, o masie cz¹-steczkowej 80-90 kDa, swoistego dla drobnoustroju Cp. abortus (test B, producent Instytut Pourqieur). £¹cznie przebadano 1333 surowice, pochodz¹ce od wysoko cielnych krów zarówno z ho-dowli rodzimej, jak i importowanych do Polski. Badania wyko-nano na terenie 57 powiatów.
Do wykonania preparatów odciskowych, barwionych zgodnie z metod¹ Stampa przy u¿yciu 10% fuksyny karbolowej, wyko-rzystano 40 ³o¿ysk pochodz¹cych od krów, które w badaniach serologicznych zdiagnozowano jako seropozytywne i które tak¿e poroni³y.
W analizie statystycznej testem c2 (chi-kwadrat) okrelono
zgodnoæ wyników uzyskiwanych dwoma porównywanymi me-todami, tj. wyniki uzyskane testami ELISA odnoszono do wyni-ków stwierdzonych w metodzie OWD. Ponadto wyliczono istot-n¹ (p = 0,00) wartoæ wspó³czynnika korelacji Pearsona oraz wspó³czynnika Cramera.
Wyniki i omówienie
Pomimo rosn¹cego w ostatnich latach zainteresowania infekcjami wywo³anymi przez drobnoustroje z rodzaju Chlamydophila u zwierz¹t i ich potencja³em zoonotycznym, w dostêpnym pimiennictwie generalnie stwierdza siê brak danych dotycz¹cych statystycznych ocen porównawczych metod serologicznych, stosowanych w ich diagnostyce szczególnie odnosz¹cych siê do badañ urzêdowych, tj. do technik laboratoryjnych zalecanych przez Miêdzynarodo-wy Urz¹d ds. Epizootii OIE. W zwi¹zku z tym nale¿y zwró-ciæ uwagê na fakt, ¿e zaprezentowane badania w³asne s¹ w znacznym zakresie pionierskie i dlatego te¿ trudno jest znaleæ odniesienie w dostêpnym pimiennictwie facho-wym do stwierdzonych w nich zale¿noci. Wiêkszoæ au-torów (2, 3, 6, 10, 20), podejmuj¹c próby porównywania wyników uzyskiwanych metodami serologicznymi, ogra-nicza siê bowiem jedynie do obliczenia procentowych za-le¿noci stwierdzonych pomiêdzy nimi.
W badaniach w³asnych, wykonanych metod¹ OWD, jak i testami ELISA, 1333 surowic wyniki pozytywne stwier-dzono u 257 zwierz¹t, co stanowi³o 19,3%. Do analizy sta-tystycznej wybrano losowo surowice pochodz¹ce od 93 zwierz¹t, zdiagnozowanych jako pozytywnie oraz
negatyw-Tab. 1. Powtarzalnoæ wyników stwierdzona w zastosowanych testach (n-93) w ó t s e t h c y n a w o s o t s a z e i n a n w ó r o P zwLiieczrzb¹atireparogcuej¹nctoywchytaukdsizaam³o h c a t s e t h c y n a w y n w ó r o p w D W O ELISAtestA 76 81,72% D W O ELISAtestB 60 64,52% A t s e t A S I L E ELISAtestB 51 54,84% B t s e t A S I L E , A t s e t A S I L E , D W O 47 50,54%
Objanienia: neg negatywny, poz pozytywny, Ks kontrola surowicy, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 kolejne rozcieñczenia badanych surowic
Tab. 2. Przyk³adowy rozk³ad mian przeciwcia³ anty-Chlamydophila spp. stwierdzony w metodzie OWD i wartoci gêstoci optycznej (OD) uzyskane w testach ELISA badanych surowic
D W O TestELISA(A) TestELISA(B) Uwagi s K 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 Wynik WaOtrDoæ Wynik WaOtrDoæ Wynik * æ o n l a z r a t w o p w ó k i n y w A t s e t D W O * * æ o n l a z r a t w o p w ó k i n y w B t s e t D W O * * * æ o n l a z r a t w o p w ó k i n y w B t s e t A t s e t * * * * e i k t s y z s w i k i n y w e w o k a n d e j neg 29,8 neg 15,3 neg **** + + + + + neg 12,2 neg 14,5 neg **** + + + neg 29,1 neg 12 neg **** 3+ 3+ 2+ 2+ + pos 77,7 pos 13,3 neg * 2+ 2+ 2+ 2+ + pos 60,6 pos 24,9 neg * + + + neg 11,0 neg 45 neg **** + + + + neg 7,98 neg 5,4 neg **** 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ pos 185 pos 38,9 neg * + + + neg 58,7 pos 304 pos *** + + + neg 87,2 pos 83,9 pos *** 3+ + neg 47,1 pos 1,9 neg ** 3+ 2+ neg 86,9 pos 110 neg ** 4+ 3+ 2+ 2+ pos 48,5 pos 99,4 pos ****
Medycyna Wet. 2006, 62 (7) 806
nie reaguj¹ce. Analizê wyników uzyskanych poszczegól-nymi testami przedstawiono w tab. 1, a ich przyk³adowe zestawienie w tab. 2.
Analizuj¹c uzyskane wartoci nale¿y podkreliæ, ¿e naj-wiêksz¹ powtarzalnoæ wyników (81,72%) wykazano w przypadku zastosowania metody OWD i ELISA test A, wykrywaj¹cego przeciwcia³a specyficzne tylko dla Cp. psit-taci. W metodzie OWD wykorzystano antygen grupowo swoisty, wykrywaj¹cy swoiste przeciwcia³a zarówno wo-bec Cp. psittaci, jak i Cp. abortus. Mo¿na domniemaæ, ¿e w takich przypadkach mamy do czynienia z nosicielstwem b¹d z infekcj¹ uogólnion¹. U krów tych nie odnotowano bowiem ronieñ, a w badaniu bakterioskopowym pochodz¹-cych od nich ³o¿ysk nie stwierdzono cia³ek elementarnych (EB) chlamydofil. W odniesieniu do testu ELISA z anty-genem Cp. psittaci podobne zale¿noci wykazane zosta³y przez Hoelzla i wsp. oraz Stepaneka i wsp. (8, 21). Celem wyeliminowania wyników fa³szywie ujemnych, odnosz¹-cych siê do postaci rozrodczej chlamydofilozy byd³a, w ba-daniach serologicznych autorzy ci sugeruj¹ koniecznoæ zastosowania zestawów zawieraj¹cych antygen biwalent-ny, tj. taki, który ma zdolnoæ wykrywania przeciwcia³ swo-istych dla Cp. psittaci, jak i Cp. abortus.
W przeprowadzonej analizie statystycznej, test c2 (na
poziomie istotnoci p = 0,00) wykaza³ du¿¹ zgodnoæ wy-ników porównywanych testów. Jego wartoæ wynios³a 37,31 i da³a podstawy do wysuniêcia twierdzenia, ¿e po-równywane metody s¹ zale¿ne i daj¹ istotnie zgodne wy-niki. Ponadto okrelono wspó³czynnik korelacji liniowej Pearsona. Jego wartoæ wynios³a 0,6572. Dla tablicy 2 × 2, zawiera siê ona w przedziale pomiêdzy 0 a 0,707 i okrela stopieñ zale¿noci porównywanych metod. Im bli¿ej zera znajduje siê jego wartoæ, tym zale¿noæ jest s³absza, nato-miast im bli¿ej 0,707, tym zale¿noæ jest silniejsza. Podob-n¹ sytuacjê stwierdzono w przypadku wspó³czynnika Cra-mera, którego wartoæ, w przedziale od 0 do 1, wynios³a równie¿ 0,6572.
Nastêpnie zbadano zale¿noæ pomiêdzy metod¹ OWD i ELISA test B, za pomoc¹ którego wykrywa siê swoiste przeciwcia³a dla immunogennego bia³ka, wystêpuj¹cego tylko u Cp. abortus. Zosta³a ona okrelona powtarzal-noci¹ wyników wobec 60 surowic, co stanowi³o 64,52%. Zastosowanie testu ELISA, zdolnego wykrywaæ swoiste przeciwcia³a wobec Cp. abortus, zalecaj¹ tak¿e inni auto-rzy (2, 6, 16), sugeruj¹c jednoczenie, ¿e mo¿e on stano-wiæ cenne uzupe³nienie OWD. Zgodnie z danymi pimien-nictwa (9, 16, 20), ta postaæ chlamydofilozy objawiaj¹ca siê zapaleniem dróg rodnych, powoduje znaczne straty eko-nomiczne i stanowi powa¿ne zagro¿enie dla ludzi (ronie-nia). W wykonanej analizie statystycznej stwierdzono ni¿-sz¹ ni¿ poprzednio wartoæ testu c2. W porównaniu tym
wynios³a ona 10,08 przy wspó³czynniku Cramera i Pearso-na równym 0,540. Wymienione wartoci funkcji statystycz-nych daj¹ podstawy do stwierdzenia, ¿e porównywane metody s¹ zale¿ne i daj¹ istotnie zgodne wyniki. Porówna-nie dwóch testów ELISA, tj. testu A i B, wyra¿aj¹ce siê powtarzalnoci¹ wyników wobec 51 zbadanych surowic, nie znalaz³o potwierdzenia w analizie statystycznej. War-toæ testu c2 wynosi³a bowiem zaledwie 0,08, przy
war-toci wspó³czynnika Cramera: 0,0541 i ujemnej warwar-toci wspó³czynnika Pearsona 0,0541. W przypadku tych testów analiza statystyczna wykaza³a nieistotn¹ zgodnoæ porów-nywanych wyników.
Sporód poddanych szczegó³owej analizie 93 zwierz¹t, 47 reagowa³o pozytywnie, we wszystkich zastosowanych
testach, a 40 z nich, tj. 43,01% poroni³o. W ³o¿yskach po-chodz¹cych od krów, które poroni³y, stwierdzono cia³ka ele-mentarne chlamydofil.
Ustalenie zale¿noci statystycznej pomiêdzy serologicz-nymi metodami jakociowymi a ilociowymi wymaga nie-w¹tpliwie dalszych rozszerzonych badañ. Dlatego te¿ stwierdzone w zaprezentowanych badaniach zale¿noci nale¿y traktowaæ jako wstêpne. W ramach projektu badaw-czego Doskonalenie metod diagnozowania oraz ocena sytuacji epidemiologicznej chlamydofilozy byd³a w Pol-sce nr 2 PO6K 040 27 dalsze badania z tego zakresu bêd¹ kontynuowane. Ponadto bêd¹ one uzupe³nione o me-tody potwierdzaj¹ce polimerazow¹ reakcjê ³añcuchow¹ i metody hodowlane.
Pimiennictwo
1.Aitken J. D., Longbottom D.: Enzootic abortion of ewes (owine chlamydiosis), [w:] Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. Off. Internat. Epizoot. Paris 2004, 635-641.
2.Borel N., Doherr M. G., Vretou E., Psarrou R., Thoma R., Pospischil A.: Sero-prevalences for ovine enzootic abortion in Switzerland. Prev. Vet. Med. 2004, 65, 205-216.
3.Buendia A. J., Cuello F., Del Rio L., Caro M., Salinas J.: Field evaluation of a new commercially available ELISA based on a recombinant antigen for diagnosing Chlamydophila abortus. Vet. Microbiol. 2001, 78, 229-239.
4.Daniel R. G., Holliman A., Davig G. P., Kirby F. D., Simpson V. R., Cranwell M. P., Dawson M., Griffitsh P. C., Bevan B. J.: Bovine chlamydiosis in the United King-dom. Vet. Rec. 1993, 133, 351-352.
5.Deptu³a W., Pawlikowska M., Travnicek M.: Chlamydofilozy u zwierz¹t i ludzi. Medycyna Wet. 2002, 58, 337-340.
6.Entrican G., Buxton D., Longbottom D.: Chlamydial infection in sheep: immune control versus fetal pathology. J. R. Soc. Med. 2001, 94, 273-277.
7.Everett K. D. E., Bush R. M., Andersen A. A.: Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chla-mydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int. J. Syst. Bacteriol. 1999, 49, 415-440. 8.Hoelzle L., Hoelzle K., Wittenbrink M.: Recombinant major outer membrane
pro-tein (MOMP) of Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, and Chlamy-dia suis as antigens to distinguish chlamyChlamy-dial species-specific antibodies in ani-mal sera.Vet. Microbiol. 2004, 103, 85-90.
9.Jee J., Degraves F., Kim T., Kaltenboeck B.: Hight prevalence of natural Chlamy-dophila species infection in calves. J. Clin. Microbiol. 2004, 42, 5664-5672. 10.Johnson F. W. A., Clarkson M. J., Spencer W. N.: Direct isolation of the agent of
enzootic abortion of ewes (Chlamydia psittaci) in cell cultures. Vet. Rec. 1988, 113, 413-414.
11.Jones G. E., Low J. C., Machell J., Armstrong K.: Comparison of five tests for the detection of antibodies against chlamydial (enzootic) abortion of ewes. Vet. Rec. 1997, 141, 164-168.
12.Niemczuk K.: Chlamydiozy/chlamydofilozy jako zoonozy diagnostyka laborato-ryjna. Monografia PIWet-PIB, Pulawy 2004, 1-82.
13.Niemczuk K.: Instrukcja nr 42/2003 G³ównego Lekarza Weterynarii, z dnia 25 czerwca 2003 r., dotycz¹ca przeprowadzania serologicznej diagnostyki chla-mydiozy byd³a z wykorzystaniem mikrometody odczynu wi¹zania dope³niacza (OWD). Nr GIWzVII.420/lab 19/2003.
14.Niemczuk K., Truszczyñski M.: Klasyfikacja bakterii ze szczególnym uwzglêdnie-niem reklasyfikacji rodziny Chlamydiaceae. Medycyna Wet. 2003, 59, 27-30. 15.Niemczuk K., Truszczyñski M.: Pathogenicity of the microorganisms of the family
Chlamydiaceae respecting the changes in their classification. P. J. Vet. Sci. 2002, 5, 99-102.
16.Pospischil A., Thoma R., Hilbe M., Grest P.: Abortion in humans by Chlamydo-phila abortus. Schweiz Arch. Tierheilkd. 2002, 144, 463-466.
17.Rodolakis A.: Chlamydiosis in ruminants and the possibbility of human contami-nation. Rev. Int. Trach. Pathol. Ocul. Trop. Subtrop. Sante. Publique. 1982, 2, 31-41.
18.Rzedzicki J., Tokarzewski S.: Ptaki jako potencjalne ród³o zaka¿enia ludzi chla-mydiami. Medycyna Wet. 2001, 57, 459-463.
19.Sachse K., Gallien P.: Molekularbiologische Nachweis-Methoden ausgewählter Zoonoseerreger. Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin BGVV Hefte, 2000, 2, 29-41.
20.Salti-Montesanto V., Tsoli E., Papavassiliou P., Psarrou E., Markey B. K., Jones G. E., Vretou E.: Diagnosis of ovine enzootic abortion, using a competitive ELISA based on monoclonal antibodies against variable segments 1 and 2 of the major outer membrane protein of Chlamydia psittaci serotype 1. A. J. Vet. Res. 1997, 58, 228-235.
21.Stepanek O., Jindrichova J., Horacek J., Krpata V.: Chlamydiosis in cattle and in man: an epidemiologic and serologic study. J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immu-nol. 2003, 27, 445-459.
Adres autora: dr Krzysztof Niemczuk, Al. Partyzantów 57, 24-100 Pu-³awy; e-mail: kniem@piwet.pulawy.pl
