Widok W poszukiwaniu mikroskopu idealnego - rzecz o mikroskopii konfokalnej.

(1)

K OSM OS 1992, 40 (1): 123— 140

PA W E Ł P O M O R S K I

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego PAN W arszawa

W PO SZ U K IW A N IU M IK R O SK O PU ID E A L N E G O — R Z EC Z O M IK R O SK O PII K O N F O K A L N E J

M ikroskopia towarzyszy biologii od samego początku jej historii. Znaczenie obserwacji m ikroskopowej jest odbiciem nierozerwalnego związku pomiędzy strukturą a funkcją elementów żywej materii. W raz z rozwojem nauki i techniki pojawiały się nowe m ikroskopy, począwszy od elektronowego, a skończywszy na m ikroskopie tunelowym. Jednak dziś, po niemal trzystu latach, znaczenie m ikroskopii optycznej nie tylko nie zmalało, ale w ostatnich piętnastu, dwudziestu latach przeżywa ona prawdziwy renesans.

M ikroskop pojawił się jako narzędzie do obserwacji niewidocznych gołym okiem struktur organizm u żywego. Jednak zarów no konstrukcja m ikroskopu, jak i budow a większości organizmów, posiadały cechy czyniące z niego narzędzie niedoskonale. Z jednej strony, m ikroskop optyczny m a nieprzekraczalną zdolność rozdzielczą, nie jesteśmy więc w stanie dojrzeć obiektów mniejszych niż połowa długości fali światła oświetlającego preparat. Z drugiej strony, większość struktur biologicznych jest przezroczysta dla światła widzialnego i z tego pow odu niewidoczna w m ikroskopie. Z drugim problemem radzono sobie tworząc niezliczone procedury barwienia, ale wszystkie one były stosunkowo niespecyficzne, w jeszcze większym stopniu zmniejszały zdolność rozdzielczą obserwacji i w większości wymagały pracy z martwym , w znacznym stopniu zmienionym materiałem. Osiągnięcie granic ówczesnych możliwości, w połącze niu ze wzrostem znaczenia technik biochemicznych i pojawieniem się m ikro skopu elektronowego, spowodowało, że m ikroskop optyczny stawał się powoli przyrządem pomocniczym.

D opiero na przełomie lat sześćdziesiątych i siedemdziesiątych trend ten uległ gwałtownemu odwróceniu. Pojawienie się szeregu nowych m etod, z immunocy- tochem ią na czele, spowodowało pow rót mikroskopii optycznej do dawnego znaczenia. Spowodowało również burzliwy rozwój nowych konstrukcji m ikro skopów, którego ukoronow aniem jest laserowy skanujący m ikroskop konfokalny — CLSM (ang. Confocal Laser Scanning M icroscope) (rys. 1).

Zasada działania m ikroskopu konfokalnego została zgłoszona do biura patentow ego w 1957 roku przez M arvina M insky’ego. Ale dopiero w 1987 roku pojawiły się na rynku jej pierwsze, w pełni zadowalające realizacje. Potrzebne

(2)

124 Paweł Pomorski

Rys. 1. Laserowy, skanujący m ikroskop konfokalny Phoibos 100 firmy M olecular Dynamics wraz z konsolą sterującego nim kom putera Personal Iris firmy Silicon G raphics. A — M oduł optyki konfokalnej, B — m oduł sterow ania detektoram i i laserem, C — M ikroskop optyczny firmy N ikon, D — blok zasilający lampy rtęciowe do klasycznej m ikroskopii epifluorescencyjnej i E — konsola

kom putera

było aż trzydzieści lat rozwoju technologii, aby to, najbardziej chyba zaaw an sowane technicznie urządzenie wykorzystywane w biologii, ujrzało światło dzienne. Jak pisze S h i n y a I n o u e (1990), „niezwykle rzadko wprowadzenie nowego instrum entu wzbudza takie podniecenie wśród biologów jak w przypad ku C L SM ” . Niewiarygodnie czysty obraz, możliwość wykonywania skrawków optycznych przez grube preparaty, możliwość generowania obrazów będących pionowymi przekrojam i przez obserwowany obiekt, tworzenie trójw ym iaro wych rekonstrukcji o nieosiągalnej dotąd rozdzielczości, czy wreszcie nie spotykana dotąd dokładność pom iarów m ikrofotom etrycznych. To krótkie wyliczenie zalet CLSM tłumaczy dlaczego jest on często postrzegany jako nowy, idealny m ikroskop (A m o s 1988; W h i t e i in. 1987).

Niniejszy artykuł m a zapoznać czytelnika z możliwościami oferowanymi przez m ikroskopię konfokalną, ale też przedstawić ograniczenia, które są nałożone na tę , tak jak na każdą inną, m etodę badawczą. Celem moim jest takie pokazanie tej techniki, by ułatwić ewentualną decyzję o w ykorzystaniu CLSM do konkretnych badań w szeroko pojętym zakresie biologii kom órki, ze szczególnym zwróceniem uwagi na badania cytoszkieletu i zjawiska lokomocji kom órek, co wynika z osobistych zainteresowań autora.

(3)

M ikroskopia konfokalna 125 K onstrukcja m ikroskopu M insky’ego była bardzo prosta (Inoue 1990) (rys. 2). Tradycyjny kondensor został zastąpiony układem optycznym identycznym jak obiektyw. Pomiędzy źródłem światła a kondensorem , na osi optycznej przyrządu, umieszczono przesłonę o bardzo małym otworze (ang. pinhole). Zmniejszony obraz tej przesłony był rzutowany na preparat przez kondensor. Pole widzenia obiektywu było ograniczone przez drugą, bliźniaczą przesłonę umieszczoną symetrycznie do pierwszej i oddzielającej obiektyw do fotodetek tora. Tak więc obie przesłony oraz pun k t na obserwowanej płaszczyźnie obiektu były umieszczone w ogniskach dwóch układów optycznych, przy czym ognisko znajdujące się w polu obserwacji było wspólne dla obiektywu i kondensora. Przesłony były współogniskowe, czyli konfokalne, z płaszczyzną obserwacji i stąd pochodzi nazwa całego układu optycznego. N a skutek takiej konstrukcji, na detektor był rzutow any obraz jednego punktu z jednej płaszczyzny, tym precyzyjniej im mniejsze było światło przesłon. Obrazy punktów leżących poza poziomem ostrości nie były w płaszczyźnie przesłony punktam i lecz miały charakter powierzchniowy. W związku z tym większość tworzącego je światła była odcinana i nie docierała do fotodetektora. Jeśli teraz obiekt przesuwano i rejestrowano kolejne stany detektora, możliwe było odtworzenie punkt po punkcie obrazu jednej, wyciętej spośród innych, warstwy preparatu z nie spotykaną dotąd czystością obrazu.

Rys. 2. Schemat najprostszego m ikroskopu konfokalnego. 1 — źródło światła, 2 — przysłona tw orząca plam kę oświetlającą, 3 — kondensor, 4 — obiekt obserwowany, 5 — obiektyw, 6 — przysłona odcinająca światło pochodzące spoza płaszczyzny ostrości, 7 — detektor, a — punkt w preparacie leżący poza płaszczyzną ostrości, b — wiązka światła wychodząca z punktu, a jest

zatrzym yw ana przez przysłonę

Realizacja m ikroskopu M insky’ego napotkała na dwie trudności. Pierwszą była konieczność bardzo dokładnego zestawienia optyki, tak aby kondensor i obiektyw były współogniskowe. problem ten znacznie wzrastał, jeśli chciano zastosować zmienne powiększenie, co wiązało się z koniecznością jednoczesnego zmieniania kondensora i obiektywu. D ruga trudność to przesuw preparatu. D okładność ruchu stolika m usiała być porównywalna ze zdolnością rozdzielczą m ikroskopu, przy jednoczesnym dużym zasięgu ruchu i praktycznej, czyli niezbyt małej prędkości przesuwu.

(4)

dzącego przez p reparat na rzecz konstrukcji m ikroskopu z epiiluminacją. W tym systemie oświetlenia obiektyw jest jednocześnie kondensorem , co w sposób naturalny typuje go jako bazę konstrukcyjną dla m ikroskopu konfokalnego. Decyzja ta ograniczyła jednak zastosowanie m ikroskopii konfokalnej do m etod, które wykorzystują epiiluminację, czyli, przede wszystkim do epifluorescencji oraz m ikroskopii światła odbitego. Rezygnacja w m ikroskopii konfokalnej ze światła przechodzącego nie była wbrew pozorom aż tak bolesna jakby się na pierwszy rzut oka wydawało. Głębia ostrości uzyskiwana w konwencjonalnym m ikroskopie wyposażonym w kontrast D IC Nom arskiego jest porównywalna z tą, uzyskiwaną w m ikroskopie konfokalnym (I n o u e 1988). Jeśli połączymy w jednym przyrządzie CLSM z kontrastem N om arskiego, co m ożna zrobić ( H o o k i O d e y a l e 1989), to powinniśmy zaspokoić każde wymagania, nawet najwybredniejszego użytkownika.

Drugi problem okazał się dużo trudniejszy. Do dziś nie udało się skon struować zadowalającego systemu przesuwu stolika, chociaż i tu obserwujemy ogrom ny postęp. W 1967 roku nastąpiła pierwsza próba obejścia trudności z poruszaniem obiektu przez wprawienie w ruch rzutowanej nań plamki światła. Próby tej dokonał M ojm ir Petrań z Pragi konstruując konfokalny m ikroskop tandem owy ( K i n o 1990). Podstaw ą tego m ikroskopu jest dysk N ipkow a (rys. 3), nazwany tak od nazwiska jego k o nstruktora Paula Nipkowa, niemieckiego studenta, który zbudował go w roku 1884 jako urządzenie do telegraficznego przekazu obrazu. Przesunięcie dysku o jeden cykl powoduje przejście przed detektorem szeregu otworków odwzorowujących kolejne linie przetwarzanego obrazu. Jeśli na dysku znajduje się jeden zestaw otworów, to cykl jest równy

Rys. 3. Z asada działania dysku Nipkow a. 1 — obraz rzutow any na powierzchnię dysku, 2 — otwór, przez który część światła pochodzącego z obrazu przechodzi w stronę obserw atora, 3 — następny otw ór w dysku. Po przejściu otw oru 2 przez obraz wejdzie nań otw ór 3 i będzie odwzorowywał

(5)

M ikroskopia konfokalna 127 obrotow i dysku, jeśli zestawów jest więcej, to na jeden obrót przypada wiele cykli. N a dysku stosowanym w tandem owym m ikroskopie konfokalnym znajduje się parzysta liczba zestawów otworów. Połowa z nich służy jako przesłony dla wiązki oświetlającej, pozostałe — dla światła pochodzącego z preparatu. Przy odpowiednio dużych obrotach dysku uzyskujemy obraz charakterystyczny dla m ikroskopu konfokalnego. N adaje się on do bezpośred niej obserwacji, bez konieczności używania detektora i dalszego przetw arzania sygnału elektronicznego ( B o y d e i in. 1990; S h e p p a r d i W ilson 1981). Pozwała to na dokonywanie obserwacji w czasie rzeczywistym. O statnio G ordon Kino ( K i n o 1990) z Uniwersytetu w Stanford zmodyfikował tę konstrukcję tak, że wystarczy jeden zestaw otworów, przez które światło przechodzi w obie strony (W i 1 s o n + /1989). Podstawowe problemy, które powstają przy wyko rzystaniu dysku N ipokow a w praktyce, to konieczność bardzo dokładnego wykonania samego dysku i jego bardzo precyzyjne ustawienie w wiązce światła, połączone ze znaczną szybkością wirowania. Dysk taki ma około 200 000 precyzyjnie umieszczonych otworów i kręci się z prędkością około 2000 obrotów na minutę. Tak precyzyjna m echanika bardzo podnosi koszty urządzenia. Drugim jeszcze większym problem em jest to, że dysk znacznie redukuje ilość światła, k tóra najpierw pada na preparat, a potem dochodzi do obserw atora. Problem y te spowodowały, że tandem owe m ikroskopy konfokalne, mimo swej dwudziestoletniej obecności na rynku, nigdy nie znalazły szerszego zastosow a nia.

W 1987 roku wszedł na rynek CLSM , który zyskał już dużą popularność i wszystko wkazuje, że jest konstrukcją, która wreszcie zadowoliła użytkow ników. Nie jest on wynikiem jakiegoś jednego, genialnego pomysłu, lecz wykorzystuje postęp techniczny, jaki dokonał się ostatnio w różnych dziedzinach od optyki po elektronikę (I n o u e 1990; W i l s o n 1989).

W yróżniającą cechą CLSM jest zastosowanie lasera jako źródła światła. W ykorzystanie spójnego światła laserowego pozwoliło na rezygnację z przesłony poprzedzającej kondensor. W iązka światła laserowego może być odchylana i w ten sposób om iata ona pole widzenia tworząc obraz bez konieczności poruszania preparatu. W odróżnieniu od plam ki oświetlającej otrzymywanej przy użyciu przesłony, która zatrzym uje znaczną część padającego na nią światła, wiązka lasera m a dużą jasność i daje czyste, jasne obrazy. Po przejściu przez układ odchylający wiązka laserowa trafia na okular, a potem na obiektyw, będący jednocześnie kondensorem . Obiektywy używane w CLSM m ają aperturę num eryczną rzędu 1,4, co daje jednocześnie bardzo dużą rozdzielczość i duże pole widzenia ( K e l l e r 1990). D opiero światło powracające z preparatu przez obiektyw jest rzutowane na przesłonę konfokalną i uwolnione przez nią od zakłóceń, pochodzących spoza obserwowanej płaszczyzny, dociera do detek tora. D ostępne na rynku konstrukcje pozwalają na jednoczesne w y k o r z y s ta j dwóch detektorów rejestrujących świecenie dwóch barw ników ( M o s s b e r g i E r i c s s o n 1990).

(6)

Zdolność rozdzielcza m ikroskopu, rozum iana jak o najmniejsza odległość pomiędzy obserwowanymi obiektam i, przy której w m ikroskopie pow staną ich odrębne obrazy, zależy od dwóch czynników: długości światła i własności optycznych układu. Determ inuje ona minimalny rozm iar piksela i wyraża się wzorem:

Zdolność rozdzielcza =

-n si-n a

gdzie X — długość światła, n — współczynnik załam ania światła substancji w której znajduje się oglądany obiekt, a — połow a kąta widzenia obiektywu.

W m ikroskopie konfokalnym równie istotny jest najmniejszy odstęp między kolejnymi skrawkam i optycznymi. Wielkość ta m a podobne własności co zdolność rozdzielcza m ikro skopu i wyraża się wzorem:

M inim alny odstęp = 4- x —

4 n sin2 y

-W praktyce można wykorzystać wzory uproszczone: Zdolność rozdzielcza = ° ^ 6

N.A. M inimalny odstęp = ■ ■■ ■■■■

-N .A .2 gdzie N.A. — liczba aperturow a obiektywu.

[Wzory uproszczone za M olecular Dynamics]

Integralną częścią takiego m ikroskopu jest kom puter (rys. 4), który z jednej strony steruje m echaniką odchylania wiązki i pionow ą pozycją preparatu, z drugiej zaś zbiera obrazy z detektorów i wyświetla je na ekranie. Ten sam kom puter pozwala na dalszą obróbkę otrzym anych obrazów, łącznie z tworze niem rozm aitych projekcji i rekonstrukcji trójwym iarowych.

W szystko to razem tworzy instrum ent dość skom plikowany i stosunkowo kosztowny (cena CLSM wynosi powyżej 200 000$) jednak jego możliwości sprawiają, że staje się coraz powszechniejszy. (Obecnie wiele firm oferuje swoje rozw iązania CLSM . Wszystkie konkretne odniesienia do konstrukcji m ikro skopu lub oprogram ow ania, które czytelnik n apo tka w dalszej części tego artykułu, będą dotyczyły m ikroskopu Phoibos 1000 firmy M olecular Dynamics (dawniej Sarastro).

W praktyce CLSM najczęściej wykorzystuje się jak o m ikroskop fluorescen cyjny. Od tego też zastosowania rozpoczniemy opis jego możliwości. Pod stawową m etodą m ikroskopii fluorescencyjnej ( P l o e m 1989), stosow aną w biologii, jest immunofluorescencja. Polega ona na znakow aniu poszczegól nych białek w kom órkach i tkankach za pom ocą specyficznych dla nich przeciwciał. Przeciwciała te są sprzęgnięte z barw nikam i fluorescencyjnymi,

(7)

Mikroskopia konfokalna 129

Rys. 4. Interfejs użytkow nika CLSM Phoibos 1000. Widoczne okna tw orzone są przez graficzny system operacyjny IRIX , zbliżony do systemu U N IX . Widoczne: A — okno z obrazem , B — okno sterow ania m ikroskopem , C — okno sterow ania program em tworzącym projekcje obrazów

trójwymiarowych. D — okno regulacji kontrastu oraz E — zegar

świecącymi światłem wzbudzonym, co pozwala na ich obserwację. Zastosowanie CLSM podnosi jakość otrzymywanych obrazów i pozwala obserwować rozkład barwionego epitopu w trzech wymiarach. W celu określenia tego rozkładu możemy posłużyć się serią przekrojów przez obserwowany preparat, jak również, o czym będzie mowa w dalszej części artykułu, stworzyć projekcję trójwymiarowej rekonstrukcji całego prep aratu w zadanej perspektywie. Często użyteczna jest możliwość w ykonania pionowego przekroju przez obiekt, wzdłuż płaszczyzny prostopadłej do płaszczyzny zazwyczaj obserwowanej. Przygotow a nie preparatu dla potrzeb CLSM jest bardzo podobne do przygotowywania preparatów do tradycyjnej m ikroskopii immunofiuorescencyjnej. W ystępują jednak pewne drobne różnice. Najważniejszą jest rezygnacja z wszelkich praktyk mających na celu spłaszczenie preparatu. Są one nie tylko niepotrzebne, ale wręcz szkodliwe, gdyż uniemożliwiają zachowanie nie zmienionej, trójw ym iaro wej struktury obserwowanego obiektu. Korzystając z m ikroskopu konfokalnego należy chronić preparat przed przypadkowym zgnieceniem przez szkiełko przykrywkowe, na przykład używając odpowiedniej wielkości koralików szkla nych lub ziaren sephadex’u wprowadzonych pomiędzy szkiełka przed za mknięciem preparatu. N astępna różnica jest wynikiem bardzo dobrego

(8)

tłumie-130 Pawel Pomorski

nia światła pochodzącego spoza płaszczyzny obserwacji m ikroskopu konfokalnego. Pozwala ono na stosowanie znacznie większych stężeń barw nika niż w tradycyjnym m ikroskopie, gdzie świecenie spoza płaszczyzny ostrości utrudnia rozróżnianie szczegółów. Wyższe stężenie barw nika powoduje intensywniejsze świecenie preparatu, a to z kolei umożliwia zmniejszenie czułości detektora, co powoduje zmniejszenie szumów w obrazie, który staje się jeszcze bardziej czysty i bardziej kontrastow y niż by to wynikało z samego wykorzystania efektu konfokalnego. Aby osiągnąć wyższe stężenie barw nika, należy podczas przygo towywania preparatu zastosować wyższe stężenie sprzężonego z nim przeciw ciała. N a ogół stężenie to jest około czterdzieści do pięćdziesięciu razy większe niż w metodzie tradycyjnej. Niestety stosowanie tak dużych ilości przeciwciał w znacznym stopniu podnosi koszty metody. Preparaty barwione niskim stężeniem sprzęganego z barwnikiem przeciwciała również dają popraw ne obrazy i doskonale nadają się do prac wstępnych, których wyniki nie będą publikowane.

Przy zastosowaniu CLSM bardzo istotny jest dobór używanego barw nika fluorescencyjnego ( T s i e n i W a g g o n e r 1990). W ynika to z ograniczonej ilości pasm chrom atycznych, jakie daje laser ( G r a t t o n i v a n d e V e n 1990). W normalnym m ikroskopie fluorescencyjnym źródłem światła jest lam pa rtęciowa, produkująca światło o wszystkich długościach fali, jakie wykorzystuje się w m ikroskopii fluorescencyjnej. Różne długości m ają w jej widmie różne natężenia, ale w zasadzie wszystkie możemy wykorzystać do wzbudzania barwnika. W przypadku lasera jest inaczej. Laser emituje światło tylko w określonych pasmach częstotliwościowych, czyli o wąskich przedziałach długości fali. Światło o pośrednich długościach fali nie jest emitowane. W m ikro skopie Phoibos 1000 (podobnie jak w większości innych dostępnych na rynku) zastosowany jest laser gazowy (argonowy) o niskiej mocy w trzech pasmach: 457 nm, 488 nm i 514 nm. O dpow iadają one mniej więcej światłu: fioletowemu, niebieskiemu i zielonemu. Używane barwniki muszą być tak dobrane, by długości fali wzbudzającego je światła odpowiadały długościom dostępnym w pasmach lasera. Laser jest tak wybrany, aby pokrywać długość fali w zbudzają cej najpopularniejszy barwnik fluorescencyjny, izotiocyjanian fluoresceiny, którego maksimum absorpcji znajduje się w pobliżu 488 nm ( T s i e n i W a g g o n e r 1990). Powoduje to jednak bardzo słabe wzbudzanie drugiego bardzo popularnego barw nika, izotiocyjanianu tetram etylrodam iny (TRITC), którego m aksimum absorpcji, zlokalizowane koło 550 nm ( T s i e n , W a g g o n e r 1990), jest tak odległe od długości fali wzbudzającej, że barwnik świeci z bardzo zredukowaną intensywnością. N akłada się na to fakt, że linia 514 nm jest najsłabszą linią lasera. W sumie świecenie rodaminy jest słabe i jeśli istnieje taka możliwość, należy użyć innego barwnika. Najlepiej do tego nadaje się R-fikoerytryna, wzbudzana przy 488 nm ( T s i e n i W a g g o n e r 1990). Jej użycie jest bardzo dogodne, jeśli chcemy obserwować preparat podwójnie barwiony przy użyciu dwóch detektorów. Sprzyja temu wspólna z fluoresceiną długość fali światła

(9)

M ikroskopia konfokalna 131 wzbudzającego. Barwnik ten ma jednak znaczną wadę. N a rynku jest znacznie mniej sprzęganych z nim przeciwciał niż sprzęganych z TR ITC . M a to szczególne znaczenie przy wykorzystaniu przeciwciał m onoklonalnych, gdzie przeciwciała w tórne, przeciw mysim im m unoglobulinom , pochodzące od jednego producen ta, m ogą dawać bardzo słabą lub nie dawać wcale reakcji z pierwotnym, mysim, przeciwciałem pochodzącym od drugiego producenta. W takich sytuacjach użycie T R IT C jest możliwe, choć uzyskane efekty m ogą odbiegać od oczekiwań.

Oprócz immunocytochemicznego, możliwe jest też bezpośrednie barwienie struktur kom órkow ych barw nikam i fluorescencyjnymi. W ostatnich latach stworzono cały zestaw sond chemicznych, specyficznych dla różnych organelli kom órkowych. Barwniki te, przy stosunkow o niskiej szkodliwości omiatającego światła laserowego, pozwalają przyżyciowo barwić poszczególne struktury wewnątrz kom órki. Do barwienia m itochondriów m ożna wykorzystać rodam inę 123 wzbudzoną przy 505 nm pasmem zielonym ( H a u g l a n d 1989). Mniej specyficznie, ale stosunkow o precyzyjnie, m ożna barwić siateczkę śródplaz- m atyczną używając karbocyjaniny D iO D 6, wzbudzanej przy 484 nm pasmem niebieskim ( H a u g l a n d 1989). Cała rodzina innych karbocyjanin (głównie D iO C16 i DiOC18) bardzo wydajnie barwi wszystkie struktury błoniaste w kom ór ce. Spośród nich DiOC18, wzbudzająca się przy 484 nm, dobrze nadaje się do użycia w CLSM ( H a u g l a n d 1989). Specyficzną sondą dla aparatu Golgiego jest ceramid kwasu N B D dodekanowego, wzbudzany pasmem niebieskim przy 481 nm ( C o o p e r i in. 1990). Trudniejsze jest znakowanie jąd ra kom órkowego. Większość popularnych barw ników znakujących D N A , takich jak oranż akrydyny, D A PI czy barwniki z grupy Hoechst, wymagają wzbudzania w za kresie ultrafioletu i nie nadają się do wykorzystania w m ikroskopii konfokalnej. Pozostaje tylko brom ek etydyny, który barwi zarów no D N A , jak i RN A , co może zaciemniać obraz. Jego zaletą jest to, że wzbudzając się podobną długością fali co FIT C (482 nm) może być również wykorzystany do wizualizacji jąd ra w obserwacji preparatów przygotowanych immunocytochemicznie ( H a u g l a n d 1989). Coraz częściej pojawiają się prace wykorzystujące barwienie jąd ra m etodam i in situ hybrydyzacji z fluorescencyjnymi sondami ( v a n D e k k e n i in. 1990.

Opisane dotąd barwniki służą do tworzenia statycznych obrazów struktury badanych obiektów. W ostatnich latach otrzym ano również całą grupę barw ników pozwalających określać fizjologiczny stan kom órki. Najpowszechniej używane barwniki z tej grupy to sondy m olekularne pozwalające określać wew nątrzkom órkowe stężenie jonów wapniowych. N ajdoskonalsza z tych substancji, F ura 2, nie nadaje się do wykorzystania w CLSM , ponieważ wymaga wzbudzania światłem ultrafioletowym . Do wykorzystania w tej metodzie nadaje się jednak inny barw nik, Fluo-3. M aksim um jego absorpcji przypada na 505 nm, zaś wydajność kw antow a waha się od 0,0051 przy niskim stężeniu jonów C a2+ do 0,183 przy wysokim stężeniu C a2+, pozwalając precyzyjnie określać względne różnice stężeń wapnia ( H a u g l a n d 1989). Największą wadą Fluo-3 jest to, że

(10)

132 Pawel Pomorski

w odróżnieniu do Fury 2, zmianie indukowanej przez jony w apnia ulega tylko jeden param etr z charakterystyki barw nika. Niemożliwe jest więc określenie dokładnego stężenia C a2+, jeśli nie znam y stężenia samej sondy, a wyznaczenie stężenia barw nika wewnątrz kom órki jest praktycznie niewykonalne. Teoretycz nie istnieje możliwość, że jego rozkład w cytoplazmie jest nierównom ierny, a to w sposób zasadniczy rzutowałoby na otrzym ane wyniki. M imo tych wad wykorzystuje się barw nik Fluo-3 i m ikroskop konfokalny do określania zmian stężenia C a +2+ na niewielkich obszarach, a to z przyczyn, które szczegółowo omówimy przy okazji opisu param etrów czasowych pracy CLSM (N i g g 1 i i L e d e r e r 1990). Podobnie jak z sondą określającą wew nątrzkom órkowe pH, z użyciem fluoresceiny BCECF. Barwnik ten, podobnie jak F ura 2, należy do grupy pozwalającej na bezwzględne określenie stężenia badanej substancji na podstawie wyznaczania stosunku intensywności świecenia wzbudzanego dwom a długościami fali. Laser argonow y niskiej mocy, stanowiący źródło światła w CLSM , pozwala na wzbudzenie fluoresceiny BCECF tylko w jednej z tych długości, 490 nm. Istnieje więc tu ten sam problem co w przypadku oznaczania stężenia wapnia za pom ocą Fluo-3 (H a u g 1 a n d 1989).

W ada oświetlenia laserowego, jak ą jest dyskretny charakter jego widma, w jednym przypadku stanowi pewne ułatwienie. W tradycyjnej m ikroskopii fluorescencyjnej preparaty podwójnie barwione wymagają osobnej obserwacji dla każdego barw nika. Z uwagi na ciągłość widma emisji lampy rtęciowej, za każdym razem musimy wycinać (za pom ocą filtrów) wąski jego wycinek w celu wzbudzenia barw nika. W przeciwnym razie światło emitowane przez ten barwnik zostałoby całkowicie zagłuszone przez odbite od p reparatu światło wzbudzające o tej samej długości fali. W przypadku lasera, jeśli tylko długości światła emitowanego przez barwniki nie pokryw ają się z żadnym z jego pasm aktywnych, możemy oświetlić prep arat wiązką niefiltrowaną. Emituje on wtedy światło pochodzące z obu barw ników , które możemy skierować na dwa detektory i rozdzielić za pom ocą odpowiednich filtrów barierowych. Pozwala to na jednoczesną obserwację obu barwników, co jest szczególnie istotne przy barwieniach przyżyciowych, gdzie obraz p reparatu zmienia się w czasie ( M o s s b e r g i E r i c s s o n 1990).

Oprócz wykorzystania technik fluorescencyjnych, CLSM pozwala na pracę z użyciem światła odbitego. Ten typ oświetlenia pozwala na oglądanie p rep ara tów znakowanych złotem koloidalnym ( W h i t e i in. 1989). Jest to użyteczna technika, jeśli chcemy połączyć m ikroskopię świetlną z elektronow ą. Możemy wtedy obejrzeć przygotowany p reparat w niskich powiększeniach m ikroskopu optycznego i następnie, po zatopieniu w żywicy, badać jego ultrastrukturę w m ikroskopie elektronowym. Powiązanie tych dwóch technik jest szczególnie obiecujące w badaniach morfologii cytoszkieletu.

W spom niano już, że CLSM jest szczególnie użytyczny do przyżyciowego badania układów dynamicznych. Jest to wynikiem małej, w porów naniu z pełnym oświetleniem przez tradycyjną lam pą rtęciową, szkodliwości om iatają

(11)

Mikroskopia konfokalna 133 cej wiązki laserowej. Istnieje jednak poważne ograniczenie tej metody, jakie stanowi jej rozdzielczość czasowa. Często nie zdajemy sobie sprawy, że każda obserwacja w konwencjonalnym m ikroskopie optycznym przebiega w czasie rzeczywistym, czyli cały czas możemy obserwować całą powierzchnię obiektu. W przypadku CLSM jest inaczej. Kolejne punkty obrazu są obserwowane po kolei. M imo że prędkość om iatania wiązki jest stosunkow o duża, to jednak zebranie pojedynczego obrazu wymaga pewnego czasu. W zależności od wielkości obserwowanego pola czas ten jest zmienny i wynosi od około 1 sekundy dla pola 64 na 64 piksele do około 20 sekund dla pola 1024 na 1024 piksele. Obserwowany proces musi być na tyle powolny, by w ciągu czasu potrzebnego do zebrania jednego obrazu nie zaszły istotne zmiany. W przeciwnym razie w jednym obrazie będą reprezentowane w różnych miejscach różne etapy zjawiska. Uniemożliwia to rejestację szybko poruszających się kom órek, inten sywnych strumieni cytoplazm atycznych i innych szybkich procesów. W tych przypadkach trzeba użyć tradycyjnych m ikroskopów optycznych lub, jeśli musimy wykorzystać efekt konfokalny — m ikroskopu tandemowego, z rejestra cją obrazu techniką video. Uzyskiwana wtedy rozdzielczość czasowa jest 50 razy większa i wynosi około 20 ms. Od tej reguły jest jeden wyjątek. K onstrukcja CLSM umożliwia osiągnięcie rozdzielczości czasowej lepszej niż przy użyciu magnetowidu, jeśli zrezygnujemy z odtw arzania całego obrazu na rzecz obser wacji jednej linii biegnącej przez preparat. W ynika to z tego, że wiązka lasera w m ikroskopie konfokalnym jest odchylana przez dwa lustra, tak zwane «lustro szybkie, obracane galwanometrycznie, i lustro wolne, sterowane mechanicznie. Jeżeli zrezygnujemy z lustra wolnego i będziemy om iatać jedną linię za pom ocą lustra szybkiego, możemy uzyskać czas rejestracji linii rzędu 8 ms, czyli znacznie lepszy niż w przypadku techniki video. Dalsze przyspieszenie rejestracji jest niemożliwe ze względu na konieczność zachow ania pewnego, minimalnego czasu całkow ania prądu z fotodetektora, by uzyskać odpowiedni odstęp sygnału od szumów. M etoda ta została z powodzeniem zastosow ana do badania szybkich zmian poziom u wapnia w kom órkach mięśniowych ( N i g g l i i L e d e r e r

1990).

W tradycyjnej m ikroskopii optycznej uzyskanie obrazu kończy pracę. W przypadku CLSM jest inaczej. Dalsza obróbka cyfrowa surowego obrazu stanowi integralną część procesu obserwacji. W odróżnieniu od obrazu uzys kanego inną m etodą, na przykład fotograficznie, którego struktura jest ciągła, już pierwotny wynik pracy m ikroskopu konfokalnego m a charakter cyfrowy. Obraz taki jest nieciągły, to znaczy składa się z określonej liczby punktów , zwanych pikselami, dla których określona jest jasność. Ich duża ilość zapewnia złudzenie płynności zmian szarości w obrazie (W e b b i D o r e y 1990). Obraz taki, zwany inaczej rastrow ym , bardzo dobrze poddaje się rozm aitym m anipula cjom. M ożemy swobodnie dobierać formę prezentacji, używając skali szarości, by obraz przypom inał zdjęcie czarno-białe, decydować się na jego zabarwienie, tak by wyglądał jak naturalne świecenie danego barw nika (łub arbitralnie

(12)

wybranego jakiegokolwiek innego np. obraz uzyskany z preparatu barwionego fluoresceiną możemy przedstawić jako czerwone świecenie rodam iny), czy wreszcie zastosować kodowanie tak zwanym pseudokolorem . Ta ostatnia m etoda polega na arbitralnym przypisaniu jakiegoś koloru do każdej wartości jasności obrazu czarno białego. Powstaje kolorow a m apa jasności, bardzo praktyczna gdy jasność ta odpow iada na przykład stężeniu wapnia w danym miejscu kom órki. T aka obróbka może dotyczyć także większej liczby obrazów. N a przykład, znając siłę, z jak ą fluoresceiną świeci w paśmie rodam iny i odwrotnie, możemy dokonać ostatecznej separacji obrazów preparatu podw ój nie barwionego. Możemy też oczywiście dwa takie obrazy zakodować właś ciwymi im koloram i i nałożyć na siebie. Jeśli obraz jest słaby, możemy dokonać cyfrowego wzmocnienia kontrastu, tak by był dobrze widoczny. Jeśli jest zaś zakłócony szumami na skutek konieczności używania bardzo czułego detektora, możemy dokonać jego liniowej filtracji zmniejszając ten niekorzystny efekt.

Oprócz indywidualnej obróbki każdego obrazu, CLSM , pozwala na rekon strukcję przestrzenną obserwowanego obiektu. W tym celu wykorzystuje się serie skrawków optycznych. Serią skrawków jest grupa przekrojów optycznych dokonanych w równoległych do siebie płaszczyznach oddalonych od siebie 0 stałą odległość, równą lub większą od pionowej zdolności rozdzielczej m ikroskopu. K ażdy skrawek składa się z określonej liczby pikseli. Każdemu z tych pikseli nadajemy grubość rów ną odległości pomiędzy płaszczyznami przekrojów, tworząc w ten sposób woksel (od ang. volume pixel) (G ratton 1 vandeVen 1990). W ten sposób w pamięci kom putera powstaje trójwym iarowa reprezentacja obserwowanego obiektu. Jest ona dla nas niedostępna bezpośred nio, gdyż naszą drogą kom unikacji z kom puterem jest dwuwymiarowy ekran m onitora. Aby obejrzeć tak powstałą rekonstrukcję, musimy stworzyć jej dwuwymiarową projekcję. Istnieje wiele m etod tworzenia tych projekcji. D obór m etody zależy od tego, jakie właściwości obiektu chcemy obrazow ać ( B r a k e - n h o f f i in. 1988, 1989: C a r l s s o n i in. 1989: S c h e y n i u s i L u n d h a l 1990: van der V o o r t 1989). Projekcje, z praktycznego punktu widzenia, dzielimy na szybkie i perspektywiczne. Projekcje szybkie są tworzone równolegle do rejestracji serii obrazów. Obiekt w takiej projekcji widoczny jest zawsze tak jak w konwencjonalnym m ikroskopie. CLSM Phoibs 1000 pozwala na dwa typy takich rekonstrukcji: projekcje maksymalnej intensywności (rys. 5) i projekcje typu rentgenowskiego (rys. 6). W pierwszym przypadku jasność piksela ostatecz nego obrazu jest równa jasności najjaśniejszego woksela z leżącej pod nim kolumny, w drugim jasność ta jest rów na średniej z kolumny. W arto zdawać sobie sprawę, że w przypadku m ikroskopii tradycyjnej widziany obraz jest tego samego typu rekonstrukcją i ostateczna jasność obrazu jest sumą jasności z wszystkich warstw obiektu. Większe możliwości daje zastosowanie projekcji perspektywicznych, wymagają one jednak znacznie więcej obliczeń i otrzymanie ich zajmuje więcej czasu. W projekcji perspektywicznej użytkownik dowolnie wybiera punkt w przestrzeni z którego obserwuje rekonstruow any obiekt. Po

(13)

M ikroskopia konfokalna 135

Rys. 5. Stereopara przedstaw iająca projekcję typu maksymalnej intensywności. O braz przedstaw ia kom órkę orzęska Paraurostyla weissei barw ioną fluoresceiną sprzęganą z przeciwciałem przeciw a-tubulinie. Aby uzyskać wrażenie trójwymiarowości przy oglądaniu stereopar, należy rozdzielić zdjęcia pionow o ustaw ioną kartką papieru i starać się patrzeć na jedno z nich lewym, a na drugie

praw ym okiem

Rys. 6. Stereopara przedstaw iająca projekcję typu rentgenowskiego tej samej kom órki. (Preparat widoczny na rys. 5-6 otrzym any dzięki uprzejmości p. mgr M ałgorzaty Frontczak z Z akładu Biologii

(14)

wybraniu kierunku patrzenia wybieramy zasadę rekonstrukcji. Szczególniebogato oprogramowany Phoibos 1000 pozwala na użycie jednej z czterech takich metod. Pierwszą jest opisana już m etoda maksymalnej intensywności (rys. 7). Różnica polega na tym, że najjaśniejszy woksel nie jest wybierany z kolumny, ale jest ustalany wzdłuż promieni rozchodzących się z punktu patrzenia. Drugą jest metoda rekonstrukcji powierzchniowej (rys. 8). W metodzie tej ustalamy graniczną wartość jasności pomiędzy wnętrzem obiektu a jego otoczeniem. G ranica ta określa powierzchnię obiektu, która jest następnie cieniowana względem pozornego źródła światła i obserwowana z wybranego punktu. M etoda ta daje szczególnie efektowne obrazy, zbliżone do obrazów tworzonych przez skaningowy m ikro skop elektronowy. Trzecia m etoda, którą m ożna nazwać m etodą naturaln ą (rys. 9), polega na sumowaniu jasności wzdłuż prom ieni rozchodzących się z punktu

Rys. 7-10. Projekcje trójwymiarowej rekonstrukcji kom órki granulocytu barwionego okradecyl- rodam iną. Zdjęcia przedstaw iają projekcje: 7 — maksymalnej intensywności, 8 — powierzchniową, 9 — naturalną i 10 — kodow aną głębokość obrazu (kom órki otrzym ane dzięki uprzejmości prof, dr

(15)

M ikroskopia konfokalna 137

Rys. 11 A -H . O brót rekonstrukcji przestrzennej typu powierzchniowego wokół osi pionowej. Kolejne projekcje sporządzano co 20°. O braz przedstaw ia ten sam granulocyt co na poprzednich ilustracjach

(16)

obserwacji. Powstający obraz jest taki, jaki widzielibyśmy obserwując powięk szony obiekt gołym okiem. O statnia m etoda rekonstrukcji, zwana kodowaniem głębokości (rys. 10), służy do obróbki obiektów nieprzezroczystych. Jasność danego p unktu obrazu zależy od odległości pomiędzy obserw atorem a punktem na powierzchni obiektu. M ożemy też tworzyć serie projekcji pozwalających nam obserwować obiekt ze wszystkich stron (rys. 11).

Podsum owując, należy stwierdzić, że CLSM nie jest m ikroskopem dosko nałym, nie jest też ulepszoną wersją m ikroskopu fluorescencyjnego. Jest przyrządem nowym, którego pole możliwości pokryw a się częściowo z m oż liwościami sprzętu tradycyjnego, ale w wielu zastosowaniach umożliwia całkiem nowe podejście do badanego m ateriału. Rozszerzenie możliwości badania kom órek in vivo budzi nadzieję tam , gdzie ważna jest nie tylko badana struktura, ale i jej zmiany w czasie, jak przy analizie ruchów kom órek i zjawisk im pokrewnych, takich jak cytokineza, endo- i egzocytoza, ruchy w ew nątrzkom ór kowe i wiele innych. Najlepszym dowodem na upowszechnianie się m ikroskopii konfokalnej jest wykładniczy wzrost liczby publikacji w których m etoda ta jest wykorzystywana ukazujących się w biomedycznych czasopismach naukowych. Wszystkie te fakty, oraz pojawienie się pierwszego CLSM w Polsce, skłoniło mnie do napisania tego artykułu, którego celem jest przybliżenie m ikroskopii konfokalnej szerokiemu gronu biologów.

C O N FO C A L M ICR O SCO PY — T O W A R D T H E ID E A L M IC R O SC O PE

S u m m a r y

Short and simple outline o f a new m ethod in optical microscopy — the confocal m icroscopy is presented. This new m ethod gives quite new possibilities in visualisation o f the biological material. Confocal Scanning Laser M icroscope (CSLM ) is one o f the m ost recent constructions in optical microscopy. It offers improved rejection o f out-of-focus noise and greater resolution than the conventional fluorescence imaging. In the CSLM condenser and objective lenses are identical and m ounted confocally. The image plane is projected onto the pinhole aperture. The only light allowed through this diaphragm is light emitted from the objective focal plane. This cuts off any out-of-focus image blurring.

The short history o f confocal microscopy, from M arvin M insky patent to tandem scanning microscope and CSLM is presented. The second part o f the article describes some particular features o f confocal microscopy m ethods. The lim itations o f laser as the light source are discussed. Some fluorescence dyes are not fit for CSLM due to their excitation wavelengths. The m ost useful dyes for Ca2+ and H + detection and selective mem brane dyes are described. M ultiple dye staining is described and the troubles with T R IT C as the m ost popular second dye are stressed. The com puter processing o f signal from fotodetector is the last topic discussed. The background o f two- and three-dimensional data presentation, simple m ethods o f image contrast enhancem ent o f projecting three-dimensional vectors onto such images are presented.

(17)

Mikroskopia konfokalna 139

L IT E R A T U R A

1. A m o s W. B. — Results obtained with a sensitive confocal scanning system designed fo r

epifluorescence. Cell M otil. Cytoskeleton 10: 54-61, 1988.

2. B o y d e A., J o n e s S. J., T a y l o r M. L., W o l f e L. A., W a t s o n T. F. — Fluorescence in

the tandem scanning microscope. J. Microsc. 157: 39-49, 1990.

3. B r a k e n h o f f G. J., van der V o o r t H. T., B a a r s l a g M. W. , M a n s B., O u d J. L., Z w a r t R., van D r i e 1 R. — Visualization and analysis techniques fo r three dimensional

information acquired by confocal microscopy. Scanning. Microsc. 2: 1831-1838, 1988.

4. B r a k e n h o f f G. J., van der V o o r t H. T. van S p r o n s e n E. A., N a n n i n g a N. — Three-dimensional imaging in fluorescence by confocal scanning microscopy. J. Microsc. 153:

151-159, 1989.

5. C a r l s s o n K. , W a l l e n P., B r o d i n L. — Three-dimensional imaging o f neurons by confocal

fluorescence microscopy. J. Microsc. 155: 15-26, 1989.

5. C o o p e r M. S., C o r n e l l B e l l A. H. , C h e r n j a v s k y A., D a n i J. W. , S m i t h S. J. — Tubulovesicular processes emerge fro m trans-Golgi cisternae, extend along microtubules, and

interlink adjacent trans-golgi elements into a reticulum. Cell 61: 135-145, 1990.

7. G r a t t o n , E . , v a n d e V e n , M . J . — Laser Sources for Confocal Microscopy. W:

Handbook o f Biological Confocal Microscopy, Pod red. Pawley, J.B. Plenum Press, New Y ork

and London, 1990, s. 53-67.

8. H a u g l a n d R . P . — Molecular Probes. Handbook o f Fluorescent Probes and Research

Chemicals, M olecular Probes, Inc., Eugene, 1989.

9. H o o k G . R . , O d e y a l e C . O . — Confocal scanning fluorescence microscopy: a new method

fo r phagocytosis research. J. Leukoc. Biol. 45: 277-282, 1989.

10. I n o u e S. — Progress in Video Microscopy. Cell M otil. Cytoskeleton 10: 13-17, 1988. 11. I n o u e , S. — Fundations o f Confocal Scanned Imaging in Light Microscopy. W: Handbook o f

Biological Confocal Microscopy, Pod red. Pawley, J.B. Plenum Press, New Y ork and London,

1990, s. 1-14.

12. K e l l e r , H . E . — Objective Lenses fo r Confocal Microscopy. W: Handbook o f Biological

Confocal Microscopy, Pod red. Pawley, J.B. Plenum Press, New Y ork and London, 1990, s.

77-86.

13. K i n o , G . S . — Intermediate Optics in Nipkow D isk Microscopes. W: Handbook o f Biological

Confocal Microscopy, Pod red. Pawley, J.B. Plenum Press, New Y ork and London, 1990, s.

105-111.

14. M o s s b e r g K . , E r i c s s o n M . — Detection o f doubly stained fluorescent specimens using

confocal microscopy. J. Microsc. 158: 215-224, 1990.

15. N i g g l i E . , L e d e r e r W . J . — Real-time confocal microscopy and calcium measurements in

heart muscle cells: towards the development o f a fluorescence microscope with high temporal and spatial resolution. Cell Calcium 11: 121-130, 1990.

16. P l o e m , J . S . — Fluorescence Microscopy. W: Light Microscopy in Biology. A Practical

Approach, Pod red. Lacey, A.J. IR L Press, O xford, 1989, s. 163-186.

17. S c h e y n i u s A . , L u n d a h 1 P . — Three-dimensional visualization o f human Langerhans’

cells using confocal scanning laser microscopy. Arch. D erm atol. Res. 281: 521-525, 1990.

18. S h e p p a r d C . J . , W i l s o n T . — The theory o f the direct-view confocal microscope. J. Microsc. 124: 107-117, 1981.

19. T s i e n . R . Y . , W a g g o n e r , A . — Fluorophor es fo r Confocal Microscopy: Photophysics

and Photochemistry. W: Handbook o f Biological Confocal Microscopy, Pod red. Pawley, J.B.

Plenum Press, New Y ork and Lodnon, 1990, s. 169-178.

20. v a n D e k k e n H . , v a n R o t t e r d a m A . , J o n k e r R . , v a n d e r V o o r t H . T . , B r a k e n h o f f G . J . , B a u m a n J . G . — Confocal microscopy as a tool fo r the study o f the

(18)

21. v a n d e r V o o r t H . T . , B r a k e n h o f f G . J . , B a a r s l a g M . W . — Three-dimensional

visualization methods fo r confocal microscopy. J. M icrosc. 153: 123-132, 1989.

22. W e b b , R . H . , D o r e y , C . K . — The Pixelated Image. W: Handbook o f Biological Confocal

Microscopy, Pod red. Pawley, J.B. Plenum Press, New Y ork and London, 1990, s. 41-51.

23. W hite J.G ., Amos W.B., F ordham M . — An evaluation o f confocal versus conventional imaging o f

biological structures by fluorescence light microscopy. J. Cell Biol. 105: 41-48, 1987.

24. W h i t e N . S . , L a c k i e P . M . , S h o t t o n D . M . — Imaging o f immunogold labelled

antigens on capping thymocytes by confocal reflection contrast scanning optical microscopy. Cell

Biol. Int. Rep. 13: 941-948, 1989.