Artyku³ przegl¹dowy Review
Prze³omowym odkryciem w wiecie biologii mole-kularnej by³o zsekwencjonowanie genomu cz³owieka i wielu gatunków zwierz¹t. Niemniej jednak do pe³-nego zrozumienia funkcji zdrowego organizmu i zmian jego czynnoci w przebiegu chorób niezbêdna jest zna-jomoæ poziomu ekspresji i struktury kodowanych przez genom bia³ek, a tak¿e wzajemnych interakcji po-miêdzy bia³kowymi produktami genów. Dynamicznie zmieniaj¹cy siê proteom (PROTEin complement to genOME), a nie kwasy nukleinowe, stanowi o prze-biegu wiêkszoci procesów fizjologicznych wewn¹trz uk³adu biologicznego. Powy¿sze sta³o siê przyczyn-kiem szybkiego rozwoju nowej ga³êzi nauki prote-omiki, która mo¿e byæ zdefiniowana jako ca³ocio-wa analiza czasowej i przestrzennej ekspresji bia³ek w okrelonym systemie biologicznym (4). Proteomi-ka daje mo¿liwoæ nie tylko identyfiProteomi-kacji bia³ek obec-nych w organizmie, narz¹dzie, tkance, komórce, ale równie¿ pozwala na analizê ich modyfikacji potrans-lacyjnych (10). Ponadto porównywanie proteomów osób zdrowych i chorych umo¿liwia ustalanie przy-czyn, mechanizmów i przebiegu schorzeñ. Proteomi-ka posiada ogromny potencja³, dlatego znajduje swo-je zastosowanie w wielu ga³êziach medycyny, miêdzy innymi w badaniach nad fizjologi¹ i patofizjologi¹ nerek.
Zarówno w genomice, jak i proteomice wykorzys-tywane s¹ wysoko specjalistyczne techniki badawcze. Analiza ekspresji tysiêcy genów jest mo¿liwa dziêki wykorzystaniu mikromacierzy cDNA (12). Natomiast proteomika najczêciej opiera siê na po³¹czeniu dwóch
technik: elektroforezy dwukierunkowej w ¿elu poli-akryloamidowym (two-dimensional gel electrophore-sis 2-DE) oraz spektrometrii masowej typu MALDI TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight). Elektroforeza dwukierunkowa jest najsze-rzej stosowan¹ metod¹ umo¿liwiaj¹c¹ jednoczesny rozdzia³ tysiêcy bia³ek i póniejsz¹ ich wizualizacjê. Z wysok¹ rozdzielczoci¹ pozwala na detekcjê bia³ek w szerokim zakresie, w zale¿noci od ich punktu izo-elektrycznego i masy cz¹steczkowej. Punkt izoelek-tryczny (pI) jest definiowany jako okrelona wartoæ pH, przy której ³adunek wypadkowy bia³ka wynosi zero, co powoduje brak migracji tego bia³ka w polu elektrycznym (6). Ró¿nice pomiêdzy punktami izo-elektrycznymi poszczególnych bia³ek s¹ podstaw¹ ich rozdzia³u. W pierwszym etapie 2-DE dokonuje siê ogniskowania izoelektrycznego (IEF isoelectric focusing) na w¹skich paskach IPG (immobilised pH gradient) z ¿elem poliakryloamidowym, o okrelonym gradiencie pH. W drugim etapie przeprowadza siê roz-dzia³ bia³ek w zale¿noci od ich masy cz¹steczkowej, w ¿elu poliakryloamidowym z dodatkiem SDS (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis--SDS-PAGE). Rozdzielone cz¹steczki identyfikuje siê na podstawie ich masy. Jedn¹ z najbardziej efektyw-nych technik wykorzystywaefektyw-nych w tym celu jest spek-trometria mas (mass spectrometry MS), która ze wzglêdu na wysok¹ czu³oæ umo¿liwia analizowanie próbek o wysokiej z³o¿onoci. W badaniach proteo-micznych MS stosowana jest m.in. w wykrywaniu interakcji pomiêdzy bia³kami, modyfikacji
potrans-Proteomika a fizjologia i patofizjologia nerek
MA£GORZATA O¯GO, WIES£AW F. SKRZYPCZAK,AGNIESZKA HEROSIMCZYK, ANDRZEJ MAZUR*
Katedra Fizjologii Zwierz¹t i Cytobiologii Wydzia³u Biotechnologii i Hodowli Zwierz¹t AR, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin
*Equipe Stress Métabolique et Micronutriments, Unité de Nutrition Humaine, INRA Clermont-Ferrand/Theix, Saint Genès, Champanelle, Francja
O¿go M., Skrzypczak W. F., Herosimczyk A., Mazur A. Proteomics in relation to renal physiology and pathophysiology
Summary
Proteomics is a new, dynamically developing branch of science. It uses specific research tools which enable analysis of a whole protein expression in definite time and a concrete biological system. The purpose of current applications of renal and urinary proteomics are to better understand renal physiology, to explore the molecular mechanisms of the occurrence and progression of diseases, and also to identify protein biomarkers. This review is intended to discus the present status of the contribution of proteomic analysis to nephrology.
lacyjnych bia³ek, mapowaniu poszczególnych prze-dzia³ów komórkowych oraz ilociowej analizie eks-presji genów w ró¿nych stanach fizjologicznych i pa-tofizjologicznych (17) (ryc. 1).
Wykorzystanie technik proteomicznych w badaniach czynnoci nerek
Nerki s¹ narz¹dem spe³niaj¹cym funkcjê wydalni-cz¹, regulacyjn¹ i endokrynn¹. Odgrywaj¹ zasadnicz¹ rolê w selekcji i eliminacji zbêdnych produktów prze-miany materii, utrzymuj¹ homeostazê hormonaln¹ oraz równowagê kwasowo-zasadow¹ i elektrolitow¹ ustroju (7, 11). U cz³owieka przez nerkê (która stanowi oko³o 0,5% masy cia³a) przep³ywa w ci¹gu minuty oko³o 650 ml osocza. Z tej iloci powstaje oko³o 120 ml prze-s¹czu k³êbkowego. W trakcie pasa¿u przez nefron za-chodzi selektywna sekrecja niektórych sk³adników osocza do p³ynu kanalikowego oraz resorpcja wody
i innych elementów przes¹czu do krwi, co w rezulta-cie prowadzi do redukcji objêtoci p³ynu kanalikowe-go (do oko³o 1% wielkoci filtratu), który wraz z koñ-cowymi produktami przemiany materii zostaje wyda-lony z organizmu.
Badania proteomiczne maj¹ ogromne znaczenie w poznaniu i lepszym zrozumieniu czynnoci nerek, bowiem pozwalaj¹ na analizê, identyfikacjê i okrele-nie funkcji szerokiej gamy bia³ek wp³ywaj¹cych bez-porednio na nerki lub zwi¹zanych z ich czynnoci¹. Technika ta znajduje obecnie coraz wiêksze zastoso-wanie w wielu orodkach naukowych. Sarto i wsp. (16) jako jedni z pierwszych przeprowadzili globaln¹ ana-lizê bia³ek pochodzenia nerkowego (proteomu nerek). Autorzy stwierdzili ekspresjê 2000 bia³ek, sporód których 47 zidentyfikowali. Arthur i wsp. (2) przeana-lizowali proteom w dwóch warstwach: korze i rdze-niu nerek. Wykazali, ¿e ekspresja bia³ek pomiêdzy tymi regionami wykazuje znaczne ró¿nice. W korze nerek stwierdzili ekspresjê 1095, a w rdzeniu 885 bia³ek. Sporód wszystkich bia³ek tylko 72 zosta³y zidentyfi-kowane poprzez analizy spektrometrem masowym (MALDI TOF). Wed³ug autorów 10 zidentyfikowa-nych bia³ek wykazywa³o wiêksz¹ ekspresjê w korze, podczas gdy 6 bia³ek wykazywa³o wiêksz¹ ekspresjê w rdzeniu nerek. Podobne badania przeprowadzili Witzman i wsp. (23). W wyniku rozdzia³u bia³ek przy u¿yciu 2-DE i identyfikacji spektrometrem masowym, autorzy stwierdzili ekspresjê 727 bia³ek pochodz¹cych z kory i 716 z rdzenia nerek. W badaniach tych auto-rzy wykazali ró¿nice w ekspresji ³¹cznie 127 bia³ek, pomiêdzy tymi dwoma warstwami.
Techniki proteomiczne umo¿liwiaj¹ równie¿ anali-zê bia³ek pochodz¹cych ze struktur wewn¹trznerko-wych, miêdzy innymi k³êbuszka nerkowego. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e k³êbki nerkowe nie tylko odgrywaj¹ decyduj¹c¹ rolê w filtracji osocza, ale równie¿ mog¹ byæ miejscem progresywnego rozwoju chorób nerek. Yoshida i wsp. (25) stworzyli mapê proteomu tej struk-tury, uzyskuj¹c ekspresjê 1713 bia³ek, sporód których 347 zidentyfikowali. Autorzy zaklasyfikowali te bia³-ka, na podstawie pe³nionych funkcji, do bia³ek cyto-szkieletu i bia³ek zaanga¿owanych w metabolizm DNA, RNA, wêglowodanów i lipidów. Miêdzy inny-mi wykryli bia³ko wystêpuj¹ce na szczytowej b³onie podocytów, o nazwie podocalexina, które pe³ni istot-n¹ rolê w przesy³aniu informacji pomiêdzy rodowis-kiem zewnêtrznym a podocytami. Yoshida i wsp. (25) wykryli równie¿, metodami proteomicznymi, elementy cytoszkieletu (wimentynê, alfa i beta tubulinê, beta aktynê i miozynê). Wynikiem analizy proteomu k³êb-ków przeprowadzonej przez autorów by³o stworzenie listy bia³ek, które uleg³y ekspresji w ludzkim, zdro-wym k³êbuszku nerkozdro-wym. Lista ta umieszczona jest na stronie internetowej http://www.sw.nec.co.jp/ bio/rd/hgldb/index.html. Równie¿ Ransom i wsp. (15) zidentyfikowali 88 unikalnych bia³ek podocytowych i sugeruj¹, ¿e analiza zmian ekspresji tych bia³ek mo¿e
EKSTRAKCJA BIA£EK
ROZDZIA£ BIA£EK (2-DE)
PORÓWNYWANIE PRÓB
WYCINANIE BIA£KA ORAZ TRAWIENIE
ANALIZA MS (MALDI-TOF)
INTERNETOWE BAZY DANYCH (BIOINFORMATYKA)
IDENTYFIKACJA BIA£KA
pozwoliæ na lepsze zrozumienie mechanizmów po-wstawania proteinurii. Xing i wsp. (24) zaobserwo-wali u szczurów, u których wystêpowa³a proteinuria, ekspresjê bia³ek b³ony szczelinowej i bocznych b³on podocytów, takich jak: nefryna, podocyna, CD2AP (CD2-associated protein) i alfa-aktyna 4.
Wykorzystuj¹c techniki proteomiczne mo¿na anali-zowaæ proteom kanalików nerkowych. Van Balkom i wsp. (21) przeanalizowali proteom kanalików zbior-czych nerek u szczurów otrzymuj¹cych analog wazo-presyny (dAVP) agonistê receptorów typu II, obec-nych w bazolateralnej czêci b³ony komórkowej ka-nalików zbiorczych. Autorzy zaobserwowali ró¿nicê w ekspresji 43 bia³ek, pomiêdzy kanalikami zbiorczy-mi szczurów dowiadczalnych i kontrolnych. Uzyskane wyniki pozwoli³y autorom okreliæ m.in. rolê wazo-presyny w regulacji determinantów indukcji tlenku azotu (syntazy tlenku azotu typu II, arginazy II, oksy-dazy NADPH).
Proteomika w sposób unikalny pozwala okreliæ globalne zmiany w ekspresji bia³ek wynikaj¹ce z kon-troli transkrypcyjnej i modyfikacji potranslacyjnych pomiêdzy ró¿nymi przedzia³ami komórkowymi, pod wp³ywem ró¿norodnych czynników. Dihazi i wsp. (5) przeprowadzili badania proteomiczne, których celem by³o okrelenie zmian w ekspresji bia³ek, w komór-kach nab³onkowych grubego ramienia wstêpuj¹cego pêtli nefronu, pod wp³ywem stresu osmotycznego. Autorzy eksponowali ww. komórki na cinienie
osmo-tyczne wynosz¹ce 900 mmol/kg H2O i analizowali
wp³yw zwiêkszonej molalnoci na morfologiê i zmia-ny proteomu. Wykazali ekspresjê 2000 bia³ek, zarów-no w komórkach ekspozarów-nowanych na wysokie, jak i fiz-jologiczne cinienie osmotyczne. Sporód nich, wy-korzystuj¹c spektrometriê masow¹, zidentyfikowali 132 bia³ka, z których, pod wp³ywem stresu osmotycz-nego, 25 uleg³o nadekspresji. Najbardziej charakte-rystyczn¹ zmian¹ zaobserwowan¹ przez autorów by³a nadekspresja bia³ka: reduktazy aldozy (AR), która re-dukuje d-glukozê w procesie powstawania alkoholu wielowodorotlenowego. Zmiany w ekspresji AR by³y 15-krotnie wiêksze po wyst¹pieniu stresu osmotycz-nego. Wed³ug autorów, zwiêkszenie aktywnoci tego bia³ka, indukowane wysok¹ molalnoci¹ zewn¹trz-komórkow¹ powoduje wzrost syntezy nerkowego sor-bitolu i jego akumulacjê w komórkach kanalików zbiorczych rdzenia nerki. Sorbitol jest jedn¹ z g³ów-nych organiczg³ów-nych substancji osmotycznie czyng³ów-nych w rdzeniu nerek. Zdaniem autorów, jego akumulowa-nie chroni komórki nerek przed gwa³townymi zmia-nami osmotycznymi, wywieranymi przez skoncentro-wane jony sodowe, chlorkowe i mocznik w ródmi¹¿-szu nerek. Autorzy stwierdzili równie¿ nadekspresjê dehydrogenazy mleczanowej i dehydrogenazy jab³cza-nowej, enzymów zaanga¿owanych w metabolizm wêg-lowodanów. Sugeruj¹, ¿e nadekspresja tych bia³ek jest zwi¹zana z aktywacj¹ procesu glukoneogenezy, w celu dostarczenia odpowiedniej iloci glukozy do syntezy
sorbitolu. Dihazi i wsp. (5) zaobserwowali równie¿ nadekspresjê kinazy adenylanowej i kinazy kreatyni-ny, bia³ek odpowiedzialnych za utrzymanie odpowied-niego stê¿enia ATP w tkankach, niezbêdnego w pro-cesie pozyskiwania energii, przez komórki wstêpu-j¹cego ramienia pêtli nefronu, bêd¹ce pod wp³ywem stresu osmotycznego. Obserwowany wzrost ekspresji wimentyny (bia³ka cytoszkieletu) w tych komórkach, w rodowisku o wysokiej molarnoci jest, zdaniem autorów, zwi¹zany ze stabilizacj¹ i wzmocnieniem tych komórek.
Zastosowanie proteomiki w badaniach moczu Techniki proteomiczne sta³y siê bardzo wa¿nym narzêdziem umo¿liwiaj¹cym identyfikacjê bia³kowych markerów obecnych w p³ynach ustrojowych np. w moczu. Nale¿y zaznaczyæ, ¿e proteom moczu za-wiera bia³ka nie tylko przefiltrowane, ale równie¿ pochodzenia nerkowego. Analiza i identyfikacja tych bia³ek mo¿e u³atwiæ zrozumienie fizjologii zarówno k³êbków, jak i kanalików nerkowych (16). Proteom moczu mo¿e byæ równie¿ bardzo pomocny w analizie procesów patologicznych zachodz¹cych w nerkach.
U zdrowych ludzi wydalanie bia³ek z moczem w czasie doby nie powinno byæ wy¿sze ni¿ 150 mg. W schorzeniach nerek iloæ wydalanych bia³ek mo¿e wzrastaæ, nawet do kilku gramów. Wittke i wsp. (22) wykazali w moczu zdrowych ludzi, wykorzystuj¹c technikê elektroforezy kapilarnej i spektrometrii ma-sowej, ekspresjê 1000 polipeptydów. Autorzy nie za-obserwowali ró¿nic osobniczych w ich ekspresji. Uzys-kane wyniki umo¿liwi³y ustalenie prawid³owego wzoru polipeptydów w moczu zdrowych ludzi. W tym sa-mym dowiadczeniu Wittke i wsp. (22) porównali pro-teomy moczu osób zdrowych i z zaburzeniami czyn-noci nerek. Zaobserwowali ró¿nice w ekspresji poli-peptydów 27 z nich wystêpowa³o w moczu osób chorych, a nie by³y obecne w moczu osób zdrowych, 13 polipeptydów wystêpuj¹cych w moczu zdrowych pacjentów nie wystêpowa³o u chorych. Badania pro-teomu moczu przeprowadzili równie¿ Adachi i wsp. (1). Autorzy w moczu zdrowych ludzi zidentyfikowa-li 1543 bia³ka, wród których 488 nale¿a³o do bia³ek b³on komórkowych. By³y to transportery wody (akwa-poryny: AQP1, AQP2, AQP7), leków (MRP1 mul-tidrug resistance protein 1), sodu, potasu, chlorków (bia³ka: solute carrier family 12 formy 1, 2, 3; so-dium/potassium-transporting ATPase gamma chain; potassium voltage-gated channel subfamily E forma 3; amiloride-sensitive sodium channel gamma-sub-unit). Na uwagê zas³uguje fakt, ¿e bia³ka b³on komór-kowych zosta³y przetransportowane do moczu w formie niezmienionej. Oprócz bia³ek b³on komór-kowych autorzy zaobserwowali wystêpowanie w mo-czu równie¿ bia³ek lizosomalnych i sugeruj¹ istnienie specyficznych cie¿ek transportowych dla bia³ek b³o-nowych i lizosomalnych (formowanie egzosomów). Zidentyfikowane trzy akwaporyny (AQP1, AQP2,
AQP7) zlokalizowane by³y w szczytowej czêci b³o-ny komórkowej, natomiast nie wystêpowa³y po stro-nie bazolateralnej. Rówstro-nie¿ Pistikun i wsp. (14) stwier-dzili wydalanie akwaporyny 2 do moczu w procesie formowania siê egzosomów. Autorzy wykazali obec-noæ w moczu bia³ek transportuj¹cych bêd¹cych inte-graln¹ czêci¹ b³on komórkowych, ró¿nych segmen-tów nefronów i sugeruj¹, ¿e analizy tych frakcji b³o-nowych w moczu mog¹ dostarczyæ informacji o fizjo-logii i patofizjofizjo-logii kanalika nerkowego.
Mo¿liwoæ nieinwazyjnego pobierania moczu oraz szeroka dostêpnoæ materia³u jest dodatkowym argu-mentem uzasadniaj¹cym stosowanie technik proteo-micznych w badaniach nerek. Zmiany w wydalaniu bia³ek wraz z moczem daj¹ istotne informacje pozwa-laj¹ce na poznanie mechanizmów odpowiedzi kanali-ków oraz k³êbuszkanali-ków nerkowych na stymulacje fizjo-logiczne.
Thongboonkerd i wsp. (20) na podstawie badañ pro-teomu moczu ludzkiego stworzyli mapê bia³ek. Auto-rzy zidentyfikowali 67 bia³ek nale¿¹cych do transpor-terów, moleku³ adhezyjnych, chaperonów, receptorów, enzymów, bia³ka macierzy i bia³ek sygna³owych. Za-obserwowali, ¿e bia³ka w normalnym moczu ulega-j¹ ekspresji jako rozsiane pasy bia³ek, z niewielkimi ró¿nicami w punkcie izoelektrycznym i masie cz¹stecz-kowej. W innych badaniach proteomicznych Thong-boonkerd i wsp. (19) scharakteryzowali bia³ka w fiz-jologicznym moczu szczurów oraz wykazali zmiany w wydalaniu 111 bia³ek wraz z moczem po obci¹¿e-niu szczurów sodem. Autorzy jako pierwsi zidentyfi-kowali bia³ka: diphor-1, growth-associated protein 43, 1-myc, które nie by³y wczeniej wykrywane w moczu, innymi metodami. Analizy proteomiczne, po obci¹¿e-niu szczurów du¿ym ³adunkiem sodu, pozwoli³y au-torom na zidentyfikowanie w moczu obecnoci typo-wych bia³ek b³onotypo-wych komórek kanalików nerko-wych, które mog¹ odgrywaæ bardzo wa¿n¹ rolê w re-gulacji resorpcji sodu. Do bia³ek tych nale¿¹: NEP 24.11, solute carrier family 3, meprin 1 alpha oraz ezrina. Szczególn¹ uwagê autorzy zwrócili na potencjaln¹ rolê bia³ek: ezriny i aktyny. Sugeruj¹, ¿e ezrina, przy³¹cza-j¹c siê do aktyny, uczestniczy w formowaniu wielo-bia³kowego kompleksu wp³ywaj¹cego na hamowanie reabsorpcji NaCl w kanalikach proksymalnych.
Proteomika w wykrywaniu nowych markerów chorób nerek
Jednym z wa¿niejszych zadañ proteomiki klinicz-nej jest identyfikacja biomarkerów w p³ynach biolo-gicznych, które umo¿liwia³yby wczesne diagnozo-wanie choroby i/lub mog³yby znaleæ zastosodiagnozo-wanie w prewencji schorzeñ nerek.
Nowotwory, w tym nerek, s¹ jednymi z najpowa¿-niejszych problemów w medycynie. Skomplikowany mechanizm powstawania choroby i jej przebiegu w wielu przypadkach utrudnia w³aciwe postêpowa-nie terapeutyczne. Wykorzystapostêpowa-nie proteomiki do
pre-cyzyjnego diagnozowania i identyfikacji poszczegól-nych klas nowotworów daje nadzieje na zrozumienie molekularnego pod³o¿a procesu nowotworzenia. Jed-nym z nowotworów dojrza³ych nerek jest nowotwór RCC (rak jasnokomórkowy). Stanowi on oko³o 2% wszystkich nowotworów tego narz¹du powoduj¹cych szybk¹ mieræ, miêdzy innymi ze wzglêdu na pón¹ wykrywalnoæ tego schorzenia. Identyfikacja biomar-kerów dla RCC by³a przedmiotem dociekañ wielu autorów. Badania przeprowadzone przez Balabanova i wsp. (3) nad tym nowotworem u ludzi wykaza³y ob-ni¿on¹ ekspresjê niektórych bia³ek w nerkach. Auto-rzy zidentyfikowali je jako: enoyl-coA hydratazê, alpha-glicerol-3-dehydrogenazê fosforanow¹, dehydro-genazê aldehydow¹ I i aminoacylazê I. Z kolei Kell-ner i wsp. (8) obserwowali we wczesnej fazie RCC nadekspresjê bia³ek: cytokreatyny-8, statminy i wimen-tyny. Inni autorzy przeprowadzili analizê proteomicz-n¹ moczu u ludzi z nowotworem RCC. Wykazali zwiêkszon¹ ekspresjê bia³ka wi¹¿¹cego retinol (reti-nol-binding protein), anhydrazy wêglanowej I oraz beta 2 mikroalbuminy. Natomiast bia³ka: lektyna wi¹¿¹ca mannozê proteazy serynowej 2 oraz kininogen mia³y obni¿on¹ ekspresjê (13).
Bardzo wa¿ne zastosowanie znalaz³a proteomika w identyfikacji biomarkerów w celu wczesnego wy-krywania schorzeñ k³êbuszków nerkowych. Przyk³a-dem s¹ badania Thongboonkerda i wsp. (18). Autorzy przebadali bia³ka obecne w moczu ludzi z nefropati¹ cukrzycow¹ oraz ze stwardnieniem k³êbków nerko-wych i porównali je z bia³kami wystêpuj¹cymi w mo-czu ludzi zdrowych. Wykazali ró¿nice w ekspresji 25 bia³ek. W moczu zdrowych ludzi ekspresja: albumi-ny, transferyny i alfa-1-antytrypsyny by³a znacz¹co ni¿sza w porównaniu z ekspresj¹ bia³ek w moczu pacjentów ze schorzeniami k³êbuszków nerkowych. U osób zdrowych stwierdzono jednoczenie wysok¹ ekspresjê kininogenu oraz proboliny-3.
Wykorzystanie technik proteomicznych do analizy zmian ekspresji bia³ek zwi¹zanych z wiekiem pozwa-la na dok³adniejsze zrozumienie molekupozwa-larnych me-chanizmów odpowiedzialnych za proces starzenia i stany chorobowe, w tym nowotwory nerek. Kim i wsp. (9) zaobserwowali w nerkach starzej¹cych siê szczurów wzrost ekspresji, miêdzy innymi, katepsyny B i katepsyny L, bia³ek zaanga¿owanych w apoptozê komórkow¹. Wed³ug autorów, wysoka ekspresja tych bia³ek mo¿e byæ zwi¹zana z patologi¹ nerek wystêpu-j¹c¹ w wyniku starzenia siê organizmu. Sporód 103 zidentyfikowanych bia³ek, które uleg³y ekspresji w ner-kach u starzej¹cych siê szczurów Kim i wsp. (9) zwró-cili szczególn¹ uwagê na bia³ko SMP30 (senesscence marker protein 30). Nisk¹ ekspresjê tego bia³ka i jej obni¿anie w procesie starzenia stwierdzono w nab³on-kach kanalików nerkowych. SMP30 jest zwi¹zane z utrzymaniem homeostazy wapnia w ustroju. Obni-¿ona ekspresja tego bia³ka z wiekiem prowadziæ musi w konsekwencji do zaburzenia homeostazy wapnia,
poprzez upoledzenie funkcjonowania komórek kana-lików nerkowych, prawdopodobnie na skutek zabu-rzenia wewn¹trzkomórkowego systemu sygna³owego. Proteomika dziêki wykorzystywaniu wysoko spec-jalistycznych technik badawczych, np. elektroforezy dwukierunkowej w ¿elu poliakryloamidowym oraz spektrometrii masowej typu MALDI TOF, daje mo¿-liwoæ szybkiej i precyzyjnej identyfikacji bia³ek obec-nych w badaobec-nych uk³adach biologiczobec-nych (organizm, narz¹d, tkanka, komórka) oraz p³ynach ustrojowych (np. mocz). Stwierdzenie obecnoci (lub braku eks-presji) bia³ek, ich identyfikacja oraz analiza interakcji i modyfikacji potranslacyjnych pozwalaj¹ na okrele-nie funkcji szerokiej gamy bia³ek wp³ywaj¹cych bez-porednio na nerki lub zwi¹zanych z ich czynnoci¹, co umo¿liwia lepsze zrozumienie czynnoci tego na-rz¹du. Ponadto porównywanie proteomów osób zdro-wych i chorych umo¿liwia ustalanie przyczyn, mecha-nizmów i przebiegu schorzeñ. Identyfikacja bia³ko-wych markerów w p³ynach biologicznych umo¿liwia wczesne diagnozowanie choroby i/lub mo¿e znaleæ zastosowanie w prewencji schorzeñ nerek. Wykorzys-tanie technik proteomicznych do analizy zmian eks-presji bia³ek zwi¹zanych z wiekiem pozwala na do-k³adniejsze zrozumienie molekularnych mechanizmów odpowiedzialnych za proces starzenia i stany choro-bowe wieku starczego. Potwierdzeniem s¹ wyniki pio-nierskich badañ proteomu nerek, poszczególnych ich struktur oraz moczu, przeprowadzonych przez auto-rów cytowanych prac.
Pimiennictwo
1.Adachi J., Kumar C., Zhang Y., Olsen J. V., Mann M.: The human urinary proteome contains more than 1500 proteins, including a large proportion of membrane proteins. Genome Biol. 2006, 7, R80.
2.Arthur J. M., Thongboonkerd V., Scherzer J. A., Cai J., Pierce W. M., Klein J. B.: Differential expression of proteins in renal cortex and medulla: a proteomic approach. Kidney Int. 2002, 62, 1314-1321.
3.Balabanov S., Zimmermann U., Protzel C., Scharf C., Klebingat K. J., Walther R.: Tumour-related enzyme alterations in the clear cell type of human renal cell carcinoma identified by two-dimensional gel electrophore-sis. Eur. J. Biochem. 2001, 268, 5977-5980.
4.Cutillas P., Burlingame A., Unwin R.: Proteomic strategies and their applica-tion in studies of renal funcapplica-tion. News. Physiol. Sci. 2004, 19, 14-119. 5.Dihazi H., Asif A. R., Agarwal N. K., Doncheva Y., Muller G. A.: Proteomic
analysis of cellular response to osmotic stress in thick ascending limb of Henles loop (TALH) cells. Mol. Cell Proteomics 2005, 4, 445-1458. 6.Herosimczyk A., Dejeans N., Sayd T., O¿go M., Skrzypczak W. F., Mazur A.:
Plasma proteome analysis: 2D gels and chips. J. Physiol. Pharmacol. 2006 (Suppl. 7), 57, 81-93.
7.Higgins J. P. T., Wang L., Kambham N., Montgomery K., Mason V., Vogel-mann S. U., Lemley K. V., Brown P. O., Brooks J. D., Rijn M.: Gene expression in the normal adult human kidney assessed by complementary DNA microarray. Mol. Biol. Cell 2004, 15, 649-656.
8.Kellner R., Lichtenfels R., Atkins D., Bukur J., Ackermann A., Beck J., Brenner W., Melchior S., Seliger B.: Targeting of tumor associated antigens in renal cell carcinoma using proteome-based analysis and their clinical significance. Proteomics 2002, 2, 1743-1751.
9.Kim C. H., Park D. U., Chung A. S., Zou Y., Jung K. J., Sung B. K., Yu B. P., Chung H. Y.: Proteomic analysis of post-mitochondrial fractions of young and old rat kidney. Exp. Gerontol. 2004, 39, 1155-1168.
10.Knepper M. A.: Proteomics and the kidney. J. Am. Soc. Nephrol. 2002, 13, 1398-1408.
11.O¿go M., Skrzypczak W. F.: Uk³ad renina-angiotensyna-aldosteron w okresie oko³oporodowym i neonatalnym. Medycyna Wet. 1999, 55, 737-741. 12.O¿go M., Skrzypczak W. F., Mazur A.: Mikromacierze cDNA w badaniach
fizjologii i patologii nerek. J. Elementol. 2005, 10, 1177-1186.
13.Pieper R., Gatlin C. L., McGrath A. M., Makusky A. J., Mondal M., Seona-rain M., Field E., Schatz C. R., Estock M. A., Ahmed N., Anderson N. G., Steiner S.: Characterization of the human urinary proteome: a method for high-resolution display of urinary proteins on two-dimensional electrophore-sis gels with a yield of nearly 1400 distinct protein spots. Proteomics 2004, 4, 1159-1174.
14.Pistikun T., Shen R. F., Knepper M. A.: Identification and proteomic profi-ling of exosomes in human urine. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2004, 101, 13368-13373.
15.Ransom R. F., Vega-Warner V., Smoyer W. E., Klein J.: Differential proteo-mic analysis of proteins induced by glucocorticoids in cultured murine podocytes. Kidney Int. 2005, 67, 1275-1285.
16.Sarto C., Marocchi A., Sanchez J. C., Giannone D., Frutiger S., Golaz O., Wilkins M. R., Doro G., Cappellano F., Hughes G., Hochstrasser D. F., Mocarelli P.: Renal cell carcinoma and normal kidney protein expression. Electrophoresis 1997, 18, 599-604.
17.Tarkowski B., Girstun A.: Zastosowanie spektrometrii mas w poszukiwaniach biomarkerów chorób nowotworowych. Kosmos 2005, 54, 331-343. 18.Thongboonkerd V., Klein J. B., Jevans A. W., McLeish K. R.: Urinary
proteo-mics and biomarker discovery for glomerular diseases. Contrib. Nephrol. 2004, 141, 292-307.
19.Thongboonkerd V., Klein J. B., Pierce W. M., Jevans A. W., Arthur J. M.: Sodium loading changes urinary protein excretion: a proteomic analysis. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2003, 284, F1155-F1163.
20.Thongboonkerd V., McLeish K. R., Arthur J. M., Klein J. B.: Proteomic analysis of normal human urinary proteins isolated by acetone precipitation or ultracentrifugation. Kidney Int. 2002, 62, 1461-1469.
21.Van Balkom B. W., Hoffert J. D., Chou C. L., Knepper M. A.: Proteomic analysis of long-term vasopressin action in the inner medullary collecting duct of the Brattleboro rat. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2004, 286, F216--F224.
22.Wittke S., Fliser D., Haubitz M., Bartel S., Krebs R., Hausadel F., Hill-mann M., Golovko I., Koester P., Haller H., Kaiser T., Mischak H., Weis-singer E. M.: Determination of peptides and proteins in human urine with capillary electrophoresis-mass spectrometry, a suitable tool for the establish-ment of new diagnostic markers. J. Chromatogr. A 2003, 1013, 173-181. 23.Witzmann F. A., Fultz C. D., Grant R. A., Wright L. S., Kornguth S. E.,
Siegel F. L.: Differential expression of cytosolic proteins in the rat kidney cortex and medulla: preliminary proteomics. Electrophoresis 1998, 19, 2491--2497.
24.Xing Y., Ding J., Fan Q., Guan N.: Diversities of podocyte molecular changes induced by different antiproteinuria drugs. Exp. Biol. Med. 2006, 231, 585-593.
25.Yoshida Y., Miyazaki K., Kamiie J., Sato M., Okuizumi S., Kenmochi A., Kamijo K., Nabetani T., Tsugita A., Xu B., Zhang Y., Yaoita E., Osawa T., Yamamoto T.: Two-dimensional electrophoretic profiling of normal human kidney glomerulus proteome and construction of an extensible markup language (XML) based database. Proteomics 2005, 5, 1083-1096. Adres autora: dr in¿. Ma³gorzata O¿go, ul. Doktora Judyma 6, 71-466 Szczecin; e-mail: malgorzata.ozgo@biot.ar.szczecin.pl
