XI Ogólnopolskie Sympozjum z cyklu: Biofilm tworzony przez drobnoustroje w patogenezie zakażeń

(1)

AKTYWNOŚĆ PRZECIWGRZYBICZA OMIGANANU ORAZ JEGO RETRO ANALOGU

Czechowicz P1_{| Jaśkiewicz M}2_{| Neubauer D}2_{| Gościniak G}1_{| Kamysz W}2

1 Katedra i Zakład Mikrobiologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu

2 Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej Wydziału Farmaceutycznego Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego

Wstęp Jednym z najczęstszych czynników etiologicznych zakażenia pochwy oraz szyjki macicy są grzyby z rodzaju

Can-dida. Szacuje się, że około 75% wszystkich kobiet w wieku rozrodczym przynajmniej raz w życiu doświadczyło epizodu

ob-jawowego grzybiczego zapalenia pochwy i sromu (ang. vulvovaginal candidiasis – VVC), nawet w sytuacji braku czynni-ków predysponujących. Przyjmuje się, że około 10% z nich będzie cierpieć z powodu nawrotów, a nawet 20% populacji ko-biet jest jedynie bezobjawowymi nosicielkami szczepów Candida spp. Choć czynniki wirulencji grzybów drożdżopodob-nych są dość dobrze poznane i opisane, szczegółowy patomechanizm rozwoju grzybic pochwy wciąż pozostaje niewyjaśnio-ny. Natomiast rola potencjalnych czynników umożliwiających kolonizację przez Candida spp., zapoczątkowanie inwazyjne-go zakażenia oraz tendencje do nawrotów wciąż pozostają niejednoznaczne. Wielu autorów skłania się ku hipotezie, że zdol-ność tworzenia biofilmu stanowi istotę patomechanizmu zapalenia pochwy. Tymczasem od lat obserwuje się rosnący odse-tek szczepów Candida spp. opornych na klasyczne leki przeciwgrzybicze, np. flukonazol – zwłaszcza wśród grzybów z grupy NCAC (ang. non-C. albicans Candida), jak np. C. glabrata czy C. parapsilosis. Dlatego też stale poszukuje się alternatywnych dróg terapii. Obiecującą grupę związków o działaniu przeciwgrzybiczym, aktywnych wobec biofilmu, mogą stanowić pep-tydy przeciwdrobnoustrojowe (ang. antimicrobial peptides – AMPs). Jednym z nich jest omiganan, syntetyczny analog in-dolicydyny – peptydu wyizolowanego z ziarnistości bydlęcych neutrofilów. Związek charakteryzuje się szerokim spektrum aktywności przeciwdrobnoustrojowej i jest jednym z AMPs, który w ostatnim czasie zakończył III fazę badań klinicznych. Ponadto badania z ostatnich lat wskazują, iż jego retro analog (o odwróconej sekwencji) wykazuje poprawioną aktywność, również wobec szczepów Candida. Z tego względu postuluje się, iż obydwa te związki mogą mieć zastosowanie w terapii C.

albicans związanej z obecnością biofilmu. Cel Cel pracy stanowiła ocena wpływu omigananu oraz jego retro analogu

wo-bec form planktonowych oraz biofilmu utworzonego przez kliniczne szczepy C. albicans. Badane grzyby zostały wyizolo-wane od kobiet z zakażeniem pochwy i/lub szyjki macicy. Ponadto dokonano oceny synergizmu peptydów z flukonazolem oraz określono aktywność hemolityczną badanych AMPs. Materiał i metody Omiganan i retro omiganan otrzymano ma-nualnie metodą syntezy na stałym nośniku polimerowym z zastosowaniem chemii Fmoc. Otrzymane związki oczyszczone

XI OGÓLNOPOLSKIE SYMPOZJUM

Z CYKLU: BIOFILM TWORZONY PRZEZ

DROBNOUSTROJE W PATOGENEZIE ZAKAŻEŃ

KUDOWA ZDRÓJ, 1416.11.2019 r.

DONIESIENIA ZGŁOSZONE DO 10 PAŹDZIERNIKA 2019 r.

(2)

zostały przy użyciu RP-HPLC, zaś tożsamość określono przy użyciu spektrometrii mas (ang. electrospray ionization mass spectrometry – ESI-MS). Do badań wykorzystano 18 szczepów C. albicans wyizolowanych z pochwy i szyjki macicy oraz szczep referencyjny C. albicans ATCC 10231. W pierwszym etapie wyznaczono wartość minimalnego stężenia hamujące-go wzrost drobnoustrojów (ang. minimal inhibitory concentration – MIC) oraz określono minimalne stężenie eradykują-ce biofilm (ang. minimal biofilm eradication coneradykują-centration – MBEC) dla tych związków, stosując metodę mikrorozcień-czeń w podłożu płynnym RPMI 1640. Badania MIC zrealizowane zostały zgodnie z rekomendacjami CLSI (ang. Clinical and Laboratory Standards Institute). W celu oceny wzajemnego oddziaływania flukonazolu z badanymi peptydami prze-ciwdrobnoustrojowymi wobec form planktonowych wyznaczono wartość FIC index (ang. fractional inhibitory concentra-tion index) przy użyciu metody (ang.) checkerboard. Wizualizację otrzymanych wyników przeprowadzono z użyciem mi-kroskopii konfokalnej oraz skaningowej mimi-kroskopii elektronowej, wykorzystując dwa losowo wybrane szczepy spośród ba-danych. Zdolność AMPs do hemolizy określono wobec ludzkich erytrocytów na polistyrenowych płytkach 96-dołkowych. Wyniki Zdecydowana większość badanych szczepów w formie planktonowej okazała się być wrażliwa na działanie fluko-nazolu (MIC <64 μg/mL), przy czym szczepy mniej wrażliwe na flukonazol okazały się być bardziej wrażliwe na działanie peptydów. Wartości MIC omigananu wynosiły od 64 do 256 μg/mL, zaś stężenie 64 μg/mL było wartością najczęściej wy-stępującą (9/18 szczepów). Analogiczne wyniki uzyskano w przypadku retro omigananu, dla którego wartości MIC wyno-siły od 32 do 128 μg/mL, najczęściej uzyskując wartość 32 μg/mL (w przypadku 15 szczepów C. albicans spośród 18 bada-nych). Stężenie MBEC flukonazolu przekraczało maksymalną wartość 512 μg/mL, podczas gdy MBEC obu peptydów było co najwyżej dwukrotnie wyższe od analogicznych wartości MIC; uzyskane wartości MBEC omigananu mieściły się w zakre-sie 128–512 μg/mL i najczęściej wynosiły 256 μg/mL (15/18 szczepów), natomiast wartości MBEC retro omigananu wyno-siły od 64 do 256 μg/mL, najczęściej przyjmując wartość 128 μg/mL (9/18 szczepów). Uzyskane wartości FIC index wska-zują na synergistyczne lub addytywne działanie połączeń peptydów z flukonazolem wobec szczepów C. albicans, w stęże-niach nawet 8-krotnie niższych, niż przy stosowaniu każdego z wymienionych związków osobno wobec form planktono-wych. Badania aktywności hemolitycznej dla obu związków wskazały, iż była ona marginalna (<10%) w zakresie stężeń ak-tywności przeciwgrzybiczej, przy czym bardziej hemolityczny był retro omiganan. Mikroskopię konfokalną przeprowadzo-no, wykorzystując barwienie LIVE/DEAD z użyciem barwników SYTO® 9 i jodku propidyny. Zaobserwowaprzeprowadzo-no, że masa bio-filmu Candida, traktowanego badanymi związkami w stężeniach równych odpowiednim wartościom MBEC oraz FIC, zo-staje niemalże całkowicie usunięta, a ewentualnie pozostałe komórki drożdży w przeważającej większości są martwe. Prze-prowadzona skaningowa mikroskopia elektronowa potwierdziła także, że – poza zmniejszeniem masy biofilmu – w obec-ności badanych związków wśród nielicznie przeżywających komórek obserwowane są blastospory i nie dochodziło do ich filamentacji. Wnioski Wszystkie zastosowane związki wykazały aktywność przeciwdrobnoustrojową wobec form plankto-nowych badanych szczepów Candida. Na podstawie uzyskanych wyników badań można wywnioskować, że retro analog jest aktywniejszy przeciwdrobnoustrojowo wobec szczepów Candida niż związek wyjściowy, choć jednocześnie nieco bardziej hemolityczny. W przeciwieństwie do flukonazolu, omiganan i retro omiganan są skuteczne w eradykacji biofilmu Candida. Ponadto zastosowane AMPs w połączeniu z flukonazolem wykazują synergizm, co jest najprawdopodobniej spowodowa-ne odmiennym mechanizmem działania tych grup związków. Celem molekularnym flukonazolu jest enzym Erg11 (deme-tylaza 14α-lanosterolu), biorący udział w syntezie ergosterolu. Pod wpływem flukonazolu dochodzi do zmiany składu bło-ny komórkowej, jej upłynnienia i zwiększenia przepuszczalności dla jonów K+ oraz ATP, co wywołuje efekt fungistatycz-ny. Natomiast omiganan i retro omiganan oddziałują bezpośrednio z błoną komórkową, prowadząc do jej permeabilizacji i śmierci komórki. Hipotetycznie upłynnienie błon przez AMPs może wspomagać przedostanie się flukonazolu do jego we-wnątrzkomórkowego celu molekularnego, połączenie z którym w efekcie również wpływa na budowę błony komórkowej, ułatwiając jej z kolei permeabilizację przez AMPs. Uzyskane wyniki są obiecujące i mogą stanowić punkt wyjścia dalszych badań nad potencjalnym działaniem synergistycznym konwencjonalnie stosowanych środków przeciwgrzybiczych z nowo sytezowanymi AMPs. W toku dalszych prac niewątpliwie warto byłoby określić również toksyczność omigananu oraz jego retro analogu względem ludzkich linii komórkowych. Przeprowadzenie dodatkowych badań i potwierdzenie, że stosowanie połączeń peptydów z flukonazolem umożliwia stosowanie znacząco niższych stężeń tych związków wobec szczepów

Can-dida, mogłoby stanowić rozwiązanie jednego z najpoważniejszych problemów stosowania AMPs – toksyczności peptydów

przeciwdrobnoustrojowych.

Badania współfinansowane były z dotacji statutowej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego nr ST-02-0087/07/508 oraz dotacji statutowej Uniwersyte-tu Medycznego we Wrocławiu nr SUB.A130.19.021.

(3)

OCENA TWORZENIA BIOFILMU PRZEZ SZCZEPY KLINICZNE

STAPHYLOCOCCUS AUREUS WYIZOLOWANE

OD PACJENTÓW Z TRACHEOSTOMIĄ

Drożdż K1_{| Ochońska D}2_{| Ścibik Ł}3_{| Brzychczy-Włoch M}2

1 Wydział Hodowli i Biologii Zwierząt Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie

2 Zakład Molekularnej Mikrobiologii Medycznej Katedry Mikrobiologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie

3 Kliniczny Oddział Otolaryngologiczny 5. Wojskowego Szpitala Klinicznego z Polikliniką, Samodzielny Publiczny Zakład Opieki Zdrowotnej w Krakowie

Wstęp Tracheostomia od niemal 100 lat jest znaną i powszechnie stosowaną w medycynie klinicznej techniką chirur-giczną. Ta metoda operacyjna polega na przywróceniu właściwej drożności dróg oddechowych poprzez wprowadzenie rurki tracheostomijnej (biomateriału) do tchawicy i może być wykonywana w trybie planowym lub w trybie pilnym jako zabieg ratujący życie. Najczęstszymi wskazaniami do wykonania tracheostomii są: mechaniczna niedrożność dróg odde-chowych powodowana przez guzy zamykające światło dróg oddeodde-chowych, np.: rak krtani i gardła, wady wrodzone krtani i tchawicy, urazy krtani i tchawicy, ciała obce zamykające górne drogi oddechowe, zaburzenia drożności dróg oddecho-wych z powodu zalegającej wydzieliny, a także przedłużająca się intubacja lub brak możliwości jej wykonania. Mimo iż tra-cheostomia opisywana jest jako procedura bezpieczna, nie jest pozbawiona wczesnych i późnych powikłań, spośród któ-rych do najczęstszych należą duszność związana z niedrożnością rurki tracheostomijnej oraz zakażenia wywoływane przez szczepy biofilmotwórcze. Źródła zakażeń szpitalnych towarzyszących zabiegom terapeutycznym i diagnostycznym, prze-biegającym z użyciem przyrządów wykonanych z materiałów syntetycznych (biomateriałów), w tym rurek tracheostomij-nych, mają naturę endogenną lub egzogenną, z szerokim spektrum bakteryjnych czynników etiologicznych je wywołują-cych [8]. Do nabycia zakażenia może dochodzić w trakcie interwencji medycznej w miejscu wprowadzenia biomateriału (zakażenie okołostomijne), aż do zakażeń drogą układu krążenia. Należy podkreślić, że ważną rolę w patomechanizmie >80% przewlekłych chorób infekcyjnych pełnią biofilmy bakteryjne. Według bieżących danych literaturowych spośród drobnoustrojów Gram-dodatnich Staphylococcus aureus jest dominującym czynnikiem etiologicznym w patogenezie za-każeń u pacjentów hospitalizowanych, poddanych zabiegowi tracheostomii [1, 3, 7]. Wytworzenie biofilmu S. aureus na powierzchni rurki tracheostomijnej może być skutkiem zanieczyszczenia rurki podczas zabiegu tracheostomii, efektem translokacji bakterii z miejsc naturalnego występowania, tj. przedsionka nosa, nosogardzieli i skóry, lub konsekwencją przejściowej bakteriemii u pacjenta [3]. Cel Celem pracy było zbadanie zdolności do tworzenia biofilmu na biomateria-łach wykorzystywanych w produkcji rurek tracheotomijnych przez szczepy kliniczne S. aureus wyizolowane od pacjentów z tracheostomią. Materiał i metody Materiał do badań stanowiły 24 izolaty S. aureus, w tym 11 szczepów metycylinoopor-nych MRSA (ang. methicillin-resistant S. aureus) oraz 11 szczepów MSSA (ang. methicillin-susceptible S. aureus), pocho-dzących od pacjentów Klinicznego Oddziału Otolaryngologicznego 5. Szpitala Wojskowego z Polikliniką w Krakowie. Za-bieg tracheostomii wykonano u wszystkich chorych po usunięciu krtani oraz leczonych z powodu zmian chorobowych wywołanych dusznością krtaniową podczas radioterapii nowotworów krtani, gardła środkowego i nasady języka. Badane szczepy S. aureus, pochodzące z wymazów z rurek tracheostomijnych, identyfikowano do gatunku na podstawie morfolo-gii kolonii na podłożu Columbia Agar z 5% krwią owczą (Becton Dickinson), wyników reakcji biochemicznych (API® Staph, miniAPI®, bioMérieux) oraz przy pomocy reakcji multiplex PCR (ang. multiplex polymerase chain reaction), pole-gającej na amplifikacji gatunkowo-specyficznych fragmentów DNA. Wytwarzanie biofilmu przez badane szczepy S. aureus oceniano metodą jakościową i ilościową na powierzchni dwóch biomateriałów: polietylenu PE (DEMED) oraz polichlor-ku winylu PVC (SUMI), używanych w produkcji rurek tracheostomijnych. Biomateriały przygotowywano przez pocięcie w warunkach aseptycznych na fragmenty o długości 1 cm. W celu oceny jakościowej wytwarzania biofilmu przez S. aureus zastosowano metodę Richardsa zmodyfikowaną przez Różalską i wsp., której zasada opiera się na zdolności żywych drob-noustrojów do metabolizowania bezbarwnego chlorku 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego (ang. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC, Sigma-Aldrich) do czerwonego formazanu [8]. Wyniki oceniano wizualnie jako zmianę zabarwienia bio-filmu pokrywającego biomateriał w umownej 4-stopniowej skali od (-) do (+++) dla PVC oraz 3-stopniowej od (-) do (++) dla PE, gdzie kolejne stopnie korelowały ze stopniem intensywności zabarwienia badanego fragmentu rurki. Kontrole ujemne stanowiły fragmenty rurek inkubowane w jałowym podłożu TSB (ang. tryptic soy broth, POCH S.A.). Oceny ilo-ściowej biofilmu dokonano z zastosowaniem metody z użyciem 0,5% roztworu saponiny (Sigma-Aldrich), opisanej przez Kwiecińską-Piróg i wsp. [6]. Dla każdego biomateriału obliczano średnią z trzech posiewów dla danego rozcieńczenia. Do-datkowo ilościową ocenę tworzenia biofilmu przez badane izolaty S. aureus przeprowadzono z wykorzystaniem metod spektrofotometrycznych. Hodowlę biofilmu prowadzono na 96-dołkowej płytce polistyrenowej (Corning Costar® Co.). Barwienie przy użyciu fioletu krystalicznego CV (ang. crystal violet) oraz oznaczenie redukcji TTC

(4)

prowadzono w oparciu o opublikowane dane literaturowe przez Christensen i wsp. dla CV oraz Gabrielson i wsp. dla TTC [2, 4]. Odczytów absorbancji dokonano w aparacie Synergy™ H1 Hybrid Multi-Mode Reader (BioTek, UK) przy długo-ściach fali λ=570 nm dla CV i λ=485 nm dla TTC. Eksperyment wykonywano w trzech powtórzeniach. Uzyskane wyniki poddano kategoryzacji z wyszczególnieniem grup szczepów w zależności od wartości absorbancji. Kontrole dodatnie sta-nowiły szczepy referencyjne: S. aureus ATCC® 25923 i Staphylococcus epidermidis ATCC® 35984 (RP62A), natomiast kon-trolę ujemną – szczep S. epidermidis ATCC® 12228. Wyniki Wszystkie badane szczepy S. aureus tworzyły biofilm na po-wierzchniach rurek tracheostomijnych wykonanych zarówno z polietylenu, jak i polichlorku winylu. W wyniku oceny ja-kościowej w przypadku rurek wykonanych z PVC, w grupie 24 izolatów S. aureus 23% (n=6) silnie tworzyło biofilm, 54% (n=14) szczepów było średnio biofilmujących, a 23% (n=6) było słabo biofilmujących. Z kolei analiza tworzenia biofilmu na powierzchni rurek PE wykazała 15% (n=4) szczepów średnio biofilmujących, 85% (n=22) szczepów słabo biofilmują-cych. Nie wykryto szczepów silnie biofilmująbiofilmują-cych. Po 24 godzinach inkubacji z TTC wszystkie szczepy S. aureus tworzyły biofilm na powierzchni polietylenu i polichlorku winylu. W ocenie z wykorzystaniem metody ilościowej z biofilmu two-rzonego na powierzchni polietylenu izolowano średnio 103 jtk (jednostek tworzących kolonie, ang. colony forming units – CFU)×106_×ml-1_{, natomiast na powierzchni polichlorku winylu, 133 jtk×10}6_×ml-1_{(Ryc. 1). W przypadku metod} spektro-fotometrycznych zarówno barwienie fioletem krystalicznym (CV), jak i TTC wykazało, że wszystkie z analizowanych szczepów S. aureus wyizolowanych z rurek tracheostomijnych są w stanie tworzyć biofilm w warunkach in vitro. Z uży-ciem klasycznej metody CV wykazano, że około 100% przebadanych izolatów klinicznych S. aureus tworzyło biofilm z róż-ną i zależz róż-ną od szczepu intensywnością [2]. Dodatkowo w pracy zastosowano proponowane przez Stepanović i wsp. kry-teria oceny gronkowców jako producentów biofilmu [9]. Przyjęte kategorie podziału były zgodne z wystandaryzowanym dokumentem zaproponowanym przez Kumar Singh i wsp. [5]. W metodzie oceny redukcji TTC po 24-godzinnej inkuba-cji wartości absorbaninkuba-cji wynosiły od 0,39 do 3,4 (Ryc. 2). Przy pomocy tej metody większość badanych izolatów S. aureus – 54% (n=13) – zaliczono do średnich producentów biofilmu. Analizę statystyczną wykonano przy użyciu oprogramowa-nia TIBCO Statistica 13.3. Z jego wykorzystaniem przeprowadzono analizę podstawowych statystyk opisowych wraz z te-stami Shapiro-Wilka, jak również analizę korelacji z wykorzystaniem współczynnika τ Kendalla, analizę częstości z testem χ2_{i dokładnym testem Fishera oraz analizę testem Wilcoxona. Za poziom istotności uznano klasyczny próg α=0,05.} W me-todzie jakościowej z TTC porównania tworzenia biofilmu na rurkach tracheostomijnych wykonanych z różnych materia-łów uzyskano wynik istotny statystycznie (p<0,001), oznaczający, że na rurkach tracheostomijnych wykonanych z PVC za-chodzi 18,333× większa szansa na utworzenie co najmniej średniego biofilmu niż na rurkach z PE. W przypadku oceny ilo-ściowej analiza wykazała, że także dochodzi do istotnie mniejszego tworzenia biofilmu na rurkach wykonanych z PE. Róż-nice w uzyskanych wartościach były istotne statystycznie (p=0,012). Celem oceny korelacji pomiędzy wynikami metody jakościowej i ilościowej w ocenie biofilmu zastosowano współczynnik τ Kendalla. Wynik nie okazał się istotny statystycz-nie: τ=0,030; p=0,757. Nie zaobserwowano istotnych statystycznie powiązań pomiędzy wynikami otrzymanymi przy uży-ciu obu metod. Wnioski Wykazano użyteczność zastosowanych metod jakościowych, ilościowych i spektrofotometrycz-nych do oceny biofilmu gronkowcowego. Przeprowadzone badania potwierdziły zdolność tworzenia biofilmu przez izola-ty kliniczne S. aureus na powierzchniach rurek tracheostomijnych wykonanych z różnych biomateriałów. Uzyskane wyni-ki dowodzą, że rurka tracheostomijna może stanowić ważny rezerwuar groźnych patogenów bakteryjnych rozwijających się w postaci biofilmu. Istotne jest poszukiwanie skutecznych rozwiązań naukowych, ukierunkowanych na modyfikację

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 PVC PE Biomateriał jtk 10 6 × ml -1 Średnia Średnia +/- SE Średnia +/- 1,96*SE SA 25923 TT_1 TT_5 TT_11TT_22TT_26TT_29TT_32TT_34TT_36TT_41TT_44TT_48 Szczepy bakteryjne Absorbancja [485] 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0

Ryc. 1. Wartości średnie i przedziały ufności wyników tworzenia bioﬁlmu przez szczepy S. aureus na powierzchni polietylenu i polichlorku winylu.

Ryc. 2. Dynamika tworzenia bioﬁlmu przez szczepy S. aureus; metoda z chlorkiem 2,3,5-trójfenylotetrazoliowym.

(5)

powierzchni rurek tracheostomijnych przeciwdziałających tworzeniu biofilmów bakteryjnych lub projektowanie nowych biomateriałów wykorzystywanych w ich produkcji.

Słowa kluczowe: biofilm, CV, rurka tracheostomijna, Staphylococcus aureus, TTC

PIŚMIENNICTWO

1. Abdollahi A, Shoar S, Shoar N. Microorganisms’ colonization and their antibiotic resistance pattern in oro-tracheal tube. Iran J Microbiol 2013;5(2):102–107. 2. Christensen GD, Simpson WA, Younger JJ et al. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic tissue culture plates: a quantitative model for the

adheren-ce of staphylococci to medical deviadheren-ces. J Clin Microbiol 1985;22(6):996–1006.

3. El Cheikh MR, Barbosa JM, Caixêta JAS, Avelino MAG. Microbiology of tracheal secretions: what to expect with children and adolescents with tracheostomies. Int Arch Otorhinolaryngol 2018;22(1):50–54.

4. Gabrielson J, Hart M, Jarelöv A, Kühn I, McKenzie D, Möllby R. Evaluation of redox indicators and the use of digital scanners and spectrophotometer for quantiﬁcation of microbial growth in microplates. J Microbiol Methods 2002;50(1):63–73.

5. Kumar Singh A, Prakash P, Achra A, Prakash Singh G, Das A, Kumar Singh R. Standardization and classiﬁcation of _{in vitro bioﬁlm formation by clinical isolates of} Staphy-lococcus aureus. J Glob Infect Dis 2017;9(3):93–101.

6. Kwiecińska-Piróg J, Bogiel T, Skowron K, Więckowska E, Gospodarek E. Proteus mirabilis bioﬁlm – qualitative and quantitative colorimetric methods-based evaluation. Braz J Microbiol 2015;45(4):1423–1431.

7. Lepainteur M, Ogna A, Clair B et al. Risk factors for respiratory tract bacterial colonization in adults with neuromuscular or neurological disorders and chronic trache-ostomy. Respir Med 2019;152:32–36.

8. Różalska B, Sadowska B, Wieckowska M, Rudnicka W. Wykrywanie biofilmu bakteryjnego na biomaterialach medycznych. Med Dośw Mikribiol 1998;50(1–2):115–122. 9. Stepanović S, Vuković D, Hola V et al. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of

bioﬁlm production by staphylococci. APMIS 2007;115(8):891–899.

WRAŻLIWOŚĆ NA ANTYBIOTYKI I ŚRODKI ODKAŻAJĄCE BAKTERII WYIZOLOWANYCH Z RAN KOŃCZYN

DOLNYCH OSÓB BEZDOMNYCH PRZEBYWAJĄCYCH NA TERENIE KRAKOWA

Gajda M1_{| Jędras J}2_{| Bulanda M}3_{| Talaga-Ćwiertnia K}4

1 Szkoła Doktorska Nauk Medycznych i Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie 2 Szpital Specjalistyczny im. J. Dietla w Krakowie

3 Zakład Epidemiologii Zakażeń Katedry Mikrobiologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie 4 Zakład Mykologii Katedry Mikrobiologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie

Wstęp Stale narastająca lekooporność bakterii wywołujących zakażenia jest jednym z głównych czynników wydłużają-cych hospitalizację, zwiększająwydłużają-cych jej koszt oraz wpływająwydłużają-cych na występowanie powikłań u pacjentów. Osoby bezdomne ze względu na częste urazy, a także brak środków na leczenie lub jego zaniechanie stanowią jedną z grup, w której występuje oporność bakterii na antybiotyki. Rany bezdomnych są często zaniedbane, zanieczyszczone, a opatrunki są rzadko zmieniane lub w ogóle niewykonywane. Ponadto u osób bezdomnych występują często schorzenia współistniejące, których leczenie także bywa zaniedbywane, co wydłuża proces gojenia ran i zwiększa prawdopodobieństwo wystąpienia powikłań infekcyjnych, czę-sto prowadzących nawet do amputacji kończyny. Bezdomni są hospitalizowani w placówkach medycznych z innymi pacjen-tami, co sprawia, że problem zakażeń nie zamyka się tylko w obrębie tej grupy, ale stanowi istotną kwestię dla całego systemu opieki medycznej. Cel Celem badania była identyfikacja szczepów występujących w ranach kończyn dolnych osób bezdom-nych i ocena wrażliwości tych szczepów na antybiotyki oraz wybrane środki dezynfekcyjne. Celem nadrzędnym było stwo-rzenie podstaw do dyskusji na temat empirycznej terapii zakażeń u osób bezdomnych, tak by nie zwiększać problemu leko-oporności oraz zapobiegać potencjalnym ogniskom epidemicznym. Materiał i metody Wymazy pobrano z ran kończyn dol-nych od 44 osób bezdomdol-nych przebywających na terenie Krakowa. Szczepy bakterii zidentyfikowano przy zastosowaniu ko-mercyjnych testów biochemicznych oraz metody MALDI-TOF. Ocenę lekowrażliwości wykonano zgodnie z wytycznymi EU-CAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Zbadano również wrażliwość na najczęściej sto-sowane do odkażania ran głębokich środki dezynfekcyjne (Octenispet®, Microdacyn®) lekoopornych szczepów Staphylococcus

aureus wyizolowanych z ran bezdomnych oraz szczepu wzorcowego S. aureus ATCC6538. Badanie wykonano według normy

EN 13727:2012+A1:2013. Wyniki Z ran wyizolowano 102 szczepy, spośród których najliczniejszą grupę stanowiły gronkowce (42,2%; n=43), w tym S. aureus (n=32) i gronkowce koagulazo-ujemne (n=11), bakterie z rodziny Enterobacteriaceae (25,5%; n=26), paciorkowce (25,5%; n=26) oraz rodzaj Pseudomonas (6,9%; n=7). Wśród gatunku S. aureus najwięcej szczepów wyka-zało oporność na makrolidy i linkozamidy, podobnie wśród gronkowców koagulazo-ujemnych (53,1%; n=17 vs. 72,7%; n=8). Wśród Pseudomonas sp. wykazano obecność fenotypu MBL u jednego szczepu (14,3%). W badaniu środków dezynfekcyjnych Microdacyn® wykazał lepszą skuteczność niż Octenisept® (odpowiednio 72,7% vs. 54,5%). Wnioski Oporność na antybiotyki

(6)

bakterii izolowanych z ran osób bezdomnych stanowi problem terapeutyczny oraz epidemiologiczny. W badaniu bakterie oporne przynajmniej na jedną grupę antybiotyków izolowano z rany u co trzeciego pacjenta. Obecnie stosowana antybiotyko-terapia empiryczna – w świetle uzyskanych wyników – może być nieskuteczna, szczególnie przy tak dużym odsetku szczepów opornych na antybiotyki pierwszego rzutu. Mimo to trzeba mieć świadomość, że obecnie opieka medyczna nad osobami bez-domnymi jest dosyć trudna i z tego względu istnieje konieczność wypracowania pewnych schematów leczenia w tej grupie pa-cjentów. Badania środków dezynfekcyjnych podjęto ze względu na fakt, iż często w grupie osób bezdomnych leczenie zakażeń ran ogranicza się do oczyszczenia i odkażenia rany. Z uzyskanych danych wynika, że Microdacyn® jest skuteczniejszym środ-kiem i należy preferować ten preparat w dezynfekcji ran głębokich zamiast Octeniseptu®. Badania środków dezynfekcyjnych były prowadzone w czasie, gdy następowały zmiany charakterystyki produktu leczniczego Octenisept®.

Słowa kluczowe: antybiotykooporność, bezdomni, kończyny dolne, rany, zakażenia

BIOFILM TWORZONY PRZEZ BAKTERIE W PRZEWLEKŁYM ZAPALENIU ZATOK A NAWROTY

UCIĄŻLIWYCH OBJAWÓW CHOROBY

Gibała A1,2_{| Szaleniec J}3_{| Szyk-Warszyńska L}2_{| Szaleniec M}2_{| Gosiewski T}1

1 Katedra Mikrobiologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie 2 Instytut Katalizy i Fizykochemii Powierzchni PAN im. J. Habera w Krakowie

3 Katedra i Klinika Otolaryngologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie

Wstęp Przewlekłe zapalenie zatok przynosowych (PZZP) to choroba o złożonej etiologii, a zakażenia bakteryjne mogą być jednym z czynników. Mikroorganizmy występujące w zatokach mogą nie mieć wpływu na podstawowy przebieg schorzenia, jednak prawdopodobnie prowadzą do zaostrzenia stanu zapalnego wskutek tworzenia biofilmu. Może to prowadzić do bra-ku możliwości całkowitego wyleczenia pacjentów po zastosowaniu antybiotyków. Cel Identyfikacja najczęściej występujących drobnoustrojów u pacjentów z PZZP poddanych endoskopowej operacji zatok i ocena możliwości tworzenia przez nie biofil-mu. Materiał i metody Od 50 chorych z PZZP w trakcie operacji endoskopowej zatok pobrano wymazy i wycinki ze śluzów-ki z trzech lokalizacji: przewodu nosowego środkowego, zatośluzów-ki szczękowej i zatośluzów-ki czołowej. Wymazy posiewano na podłoża agarowe, rekomendowane dla diagnostyki bakterii przez EUCAST (ang. European Committee on Antimicrobial Susceptibi-lity Testing). Wyhodowane bakterie poddano standardowej identyfikacji do gatunku, a pomocniczo używano również testów BD Phenix™ Panels (Becton Dickinson). Ponadto dokonano oceny wrażliwości na antybiotyki według standardu EUCAST. Dla wybranych izolatów zakładano hodowle biofilmu in vitro w celu określenia siły biofilmowania. Hodowlę biofilmu prowadzono na płytkach 12-dołkowych (Axygen) przez 24 godziny w temperaturze 36°C z dostępem CO₂. Oceny biofilmu dokonano za po-mocą metody z filetem krystalicznym i pomiaru absorbancji przy długości fali 570 nm. Moc biofilmowania porównywano ze szczepem wzorcowym Staphylococcus epidermidis ATCC 35984/RP62A. Strukturę biofilmu sprawdzano przy pomocy skanin-gowego mikroskopu konfokalnego LSM 780, zbudowanego na optycznym mikroskopie odwróconym (Axio Observer Z1 firmy Zeiss). Wyniki Łącznie wyizolowano 776 szczepów bakterii. Wśród nich zdecydowanie najliczniejszą grupę (58%) stanowiły gronkowce koagulazo-ujemne, wśród których 46% to S. epidermidis. Spośród potencjalnych szczepów patogennych najczęściej izolowano: Staphylococcus aureus (17%), Escherichia coli (7%) oraz szczepy z rodzaju Klebsiella (5%) i Pseudomonas

aerugino-sa (1%). Pozostałe wyhodowane drobnoustroje (Streptococcus pneumoniae, Streptococcus z grupy viridans, Corynebacterium, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis) można uznać za skład mikrobiomu, ponieważ kolonizują one okolice

nosogar-dła. Na podstawie analizy antybiogramów stwierdzono, że prawie połowa wyhodowanych szczepów z rodzaju Staphylococcus wytwarzała mechanizm metycylinooporności lub/i MLS (tj. makrolidy-linkozamidy-streptograminy). Wśród pałeczek Gram- -ujemnych nie wykazano mechanizmów oporności ESβL (ang. extended-spectrum beta-lactamases) w badanej próbie. Na podstawie pomiarów absorbancji szczepu przyjętego za wzorzec (S. epidermidis ATCC 35984/RP62A) dla bakterii Gram-do-datnich ustalono punkt odcięcia na poziomie ≥0,25 dla szczepów mocno biofilmujących i ≤0,2 dla szczepów uznanych za bio-filmujące w mniejszym stopniu. Dla pałeczek Gram-ujemnych, w związku z mniejszym powinowactwem fioletu krystaliczne-go, punkty odcięcia zostały ustalone arbitralnie o 50% niższe niż dla Gram-dodatnich bakterii. Spośród przebadanych drob-noustrojów 71% wykazało właściwości biofilmujące, z czego 40,5% szczepów uzyskało pomiar absorbancji powyżej lub równy granicy punktu odcięcia dla szczepów silnie biofilmujących. Pozostałe szczepy po 24 godzinach hodowli wytwarzały biofilm, jednak wzrost nie był aż tak silny, absorbancja osiągała wartość granicznej 0,2 dla Gram-dodatnich i 0,1 dla Gram-ujemnych drobnoustrojów. Większe powinowactwo do tworzenia biofilmu wykazały pałeczki Gram-ujemne, gdzie 54% przebadanych szczepów posiadało właściwości silnie biofilmujące, natomiast wśród Gram-dodatnich było to 37,5% przebadanych szczepów.

(7)

Nie wykazano istotnych różnic w sile biofilmowania pomiędzy szczepami występującymi w różnych lokalizacjach u tego same-go pacjenta (tj. w przewodzie nosowym środkowym, zatoce szczękowej i zatoce czołowej). Wnioski 1. Różnorodność taksono-miczna wyhodowanych drobnoustrojów może świadczyć o złożonej etiologii PZZP, a bakterie kolonizujące nosogardło

(Strep-tococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis) mogą przyczyniać się do występowania przewlekłego

za-palenia zatok przynosowych. 2. Większość wyhodowanych szczepów bakteryjnych wykazywała silne właściwości biofilmujące, co mogło być przyczyną braku skuteczności terapeutycznej i nawracania objawów chorobowych u pacjentów z PZZP. 3. Stan-dardowe leczenie antybiotykami może jedynie prawdopodobnie złagodzić objawy chorobowe, w związku z występowaniem mechanizmów oporności i zdolnością patogenów do tworzenia biofilmu.

AG dziękuje za dofinansowanie w ramach projektu InterDokMed numer POWER. 03.02.00-00|013/16.

Projekt został sfinansowany przez Narodowe Centrum Nauki Polska (MINIATURA 2, 2018/02 / X / NZ6 / 00289).

Słowa kluczowe: biofilm, przewlekłe zapalenie zatok

AKTYWNOŚĆ PEXIGANANU WOBEC BIOFILMU GRONKOWCÓW KOAGULAZOUJEMNYCH

Janczura A1_{| Nowicka J}1_{| Pajączkowska M}1_{| Jaśkiewicz M}2_{| Pietrucha T}3_{| Kamysz W}2

2 Katedra i Zakład Chemii Nieorganicznej Wydziału Farmaceutycznego Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego

3 Student Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu, członek Koła Naukowego Mikrobiologów, działającego przy Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu

Wstęp Peptydy przeciwdrobnoustrojowe należą do endogennych substancji, będących elementem odporności nie-swoistej wielu organizmów. Wykazują aktywność bójczą wobec: bakterii, drożdżaków, niektórych wirusów i pierwotnia-ków. Działanie peptydów polega najczęściej na dezintegracji osłon komórkowych oraz tworzeniu kanałów w ich wnętrzu, co prowadzi do zniszczenia komórek. Ze względu na endogenny charakter oraz szeroki zakres aktywności poszukuje się możliwości zastosowania peptydów w leczeniu zakażeń u ludzi, w tym również zakażeń związanych z tworzeniem bio-filmu. Pexiganan (MSI-78) jest syntetycznym analogiem naturalnie występującej magaininy-2, peptydu, który początko-wo został wyekstrahowany ze skóry żaby afrykańskiej (Xenopus laevis). Potencjalne zastosowanie pexigananu obejmuje aplikację miejscową w leczeniu zakażeń stopy cukrzycowej, a także w leczeniu sepsy przy podaniu skojarzonym z anty-biotykami β-laktamowymi. Cel W pracy oceniono aktywność pexigananu wobec biofilmu gronkowców. Materiał i me-tody Badania przeprowadzono na 10 szczepach Staphylococcus epidermidis izolowanych z rany od pacjentów ze stwier-dzonym zakażeniem związanym z implantem. Do badań dołączono szczep wzorcowy S. epidermidis RP62A, którego ce-chą charakterystyczną jest silne tworzenie biofilmu. Oceniono aktywność pexigananu w odniesieniu do dojrzałego (24, 48 i 72 godziny) biofilmu gronkowców, utworzonego na 96-dołkowych płytkach titracyjnych. Równolegle przeprowadzo-no analizę porównawczą dla gentamycyny, antybiotyku z grupy amiprzeprowadzo-noglikozydów. Hodowlę mikroorganizmów prowa-dzono na podłożu Columbia Agar w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Wartości minimalnego stężenia hamującego (ang. minimal inhibitory concentration – MIC) pexigananu i gentamycyny względem analizowanych szczepów wyzna-czono z zastosowaniem metody mikrorozcieńczeń w podłożu płynnym. Po naniesieniu zawiesiny mikroorganizmów do odpowiednich rzędów płytki 96-dołkowej wprowadzano rozcieńczony w postępie geometrycznym peptyd/antybiotyk. Po okresie inkubacji (24 godziny, 37°C) odczytywano wartość minimalnego stężenia hamującego. Aktywność badanych związków wobec biofilmu gronkowców oceniono również z zastosowaniem metody mikrorozcieńczeń. Oceny dokona-no wobec biofilmu o różnym stopniu dojrzałości. Po naniesieniu zawiesiny mikroorganizmów do odpowiednich rzędów płytki 96-dołkowej i inkubacji (24, 48 lub 72 godziny, 37°C) zawiesinę usuwano, a dołki przepłukiwano. Następnie wpro-wadzano rozcieńczony w postępie geometrycznym peptyd lub odpowiednio antybiotyk. Po okresie inkubacji odczyty-wano wartość minimalnego stężenia eliminującego biofilm MBEC (ang. minimal biofilm eradication/eliminating con-centration). Wyniki Wartości minimalnego stężenia hamującego pexigananu w odniesieniu do analizowanych szczepów kształtowały się w zakresie 2–16 μg/ml w przypadku szczepów klinicznych i 4 μg/ml w przypadku szczepu wzorcowego. Zakres wartości MBEC wobec biofilmu 24-, 48- i 72-godzinnego wynosił odpowiednio 1–32 μg/ml, 2–32 μg/ml i 8–128 μg/ml. W przypadku szczepu wzorcowego wartość ta wyniosła odpowiednio: 32 μg/ml, 64 μg/ml i 64 μg/ml. MIC gen-tamycyny u wszystkich analizowanych szczepów klinicznych miała wartość <0,5 μg/ml i 32 μg/ml dla szczepu wzorco-wego. MBEC antybiotyku w odniesieniu do biofilmu wahała się w zakresie 8–16 μg/ml, 32–256 μg/ml i 32–256 μg/ml, odpowiednio dla biofilmu 24-, 48- i 72-godzinnego. W przypadku szczepu S. epidermidis RP 62A wartości te wyniosły

(8)

odpowiednio: 128 μg/ml, 128 μg/ml i 64 μg/ml. Wnioski Porównując wartości MIC i MBEC wykazano oporność analizo-wanych szczepów Staphylococcus spp. w biofilmie w odniesieniu do ich form planktonowych. Wartości MBEC pexigana-nu w odniesieniu do wartości MIC były 8- i 16-krotnie wyższe. Warto zaznaczyć, że w przypadku wielu szczepów klinicz-nych wartość MBEC pexigananu utrzymywała się na tym samym poziomie, niezależnie od dojrzałości biofilmu. W przy-padku gentamycyny stężenia MBEC były 32- i 64-krotnie wyższe, a w biofilmie 48- i 72-godzinnym nawet 512-krot-nie. Uzyskane wyniki pokazują, że w biofilmie szczepy gronkowców są bardziej oporne na pexiganan, w porównaniu do form planktonowych. Pomimo tego wzrost minimalnych stężeń hamujących w biofilmie dla pexigananu jest dużo niższy w stosunku do minimalnych stężeń hamujących w biofilmie dla gentamycyny. Wyniki badań wskazują na możliwość za-stosowania pexigananu w leczeniu zakażeń związanych z biofilmem.

Badania finansowane były z „Projektu dla Młodych Naukowców” nr STM.A130.18.008 Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu.

Słowa kluczowe: biofilm, gronkowce, peptydy przeciwdrobnoustrojowe

NOWOTWORY W PRZEWLEKŁYCH RANACH GOLENI

Kózka M

Oddział Kliniczny Chirurgii Naczyniowej Szpitala Uniwersyteckiego w Krakowie

Wstęp Leczenie owrzodzeń goleni jest jednym z najpoważniejszych problemów terapeutyczno-ekonomicznych w me-dycynie. Ponad 80% przypadków to owrzodzenia na tle niewydolności żylnej. Pozostałe 20% stanowią owrzodzenia o in-nym charakterze, w tym nowotworowe. Proces nowotworowy może rozwijać się na podłożu wieloletniej rany przewlekłej lub jako pierwotny, który manifestuje się w formie owrzodzenia. Z uwagi na lokalizację w okolicy goleni lub stopy, zmia-na nowotworowa zmia-nakładająca się zmia-na objawy niewydolności żylnej lub towarzysząca cukrzycy może być identyfikowazmia-na przez długi czas jako rana przewlekła, co opóźnia właściwe rozpoznanie. Cel Celem pracy była ocena częstości występo-wania nowotworu w owrzodzeniach goleni. Materiał i metody Przeanalizowano grupę 267 chorych leczonych w Szpi-talu Uniwersyteckim w Krakowie z powodu owrzodzeń zlokalizowanych w okolicy goleni i stopy. Wszyscy pacjenci byli wcześniej leczeni z powodu rany przewlekłej dłużej niż 6 miesięcy. Z badanej grupy wyłączono chorych, którzy zgłosili się z podejrzeniem lub ze zmianą zweryfikowaną histopatologicznie jako nowotwór. Wyniki W analizowanej grupie cho-rych nowotwór w ranie przewlekłej stwierdzono u 8,2% badanych. Wnioski 1. Rany przewlekłe kończyn dolnych, rozpo-znane wcześniej jako owrzodzenie w przebiegu niewydolności żylnej, tętniczej lub cukrzycy, w przypadku braku oczeki-wanego postępu w gojeniu powinny być weryfikowane histopatologicznie. 2. Każde opóźnione rozpoznanie nowotworu w ranie przewlekłej jest przyczyną niepowodzeń w leczeniu owrzodzeń goleni.

Słowa kluczowe: nowotwór, owrzodzenie, przewlekłe rany goleni

SERTRALINA  SUBSTANCJA PRZECIWDEPRESYJNA O AKTYWNOŚCI BAKTERIOBÓJCZEJ WZGLĘDEM

HELICOBACTER PYLORI

Krzyżek P1_{| Franiczek R}1_{| Krzyżanowska B}1_{| Migdał P}2_{| Gościniak G}1

2 Katedra Higieny Środowiska i Dobrostanu Zwierząt Wydziału Biologii i Hodowli Zwierząt Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu Wstęp Z powodu rosnącej oporności na antybiotyki Helicobacter pylori na całym świecie, istnieje potrzeba poszuki-wania nowych, alternatywnych substancji o aktywności skierowanej względem tej bakterii. W ostatnich latach dostrze-żono obiecujące właściwości przeciwdrobnoustrojowe sertraliny, substancji będącej antydepresantem. Cel Celem badań było określenie właściwości przeciwbakteryjnych sertraliny względem klinicznych i wzorcowych szczepów H. pylori. Ma-teriał i metody Do badania włączono 52 szczepy H. pylori (50 klinicznych należących do kolekcji mikroorganizmów Ka-tedry i Zakładu Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego oraz dwa referencyjne: Tx30a oraz J99). Aktywność przeciw-drobnoustrojowa została określona przy pomocy metody dyfuzyjno-krążkowej, metody mikrorozcieńczeń w bulionie oraz badania żywotności w czasie. Interakcja między sertraliną a klinicznie stosowanymi antybiotykami (amoksycyliną,

(9)

Szczepy H. pylori Krążki nasączone sertraliną Różnice statystyczne między szczepami 0,2 mg 1 mg 2 mg Wrażliwe 10–21,5 17,5–32,5 19,5–37 p>0,05 MTZ-oporne 10,5–21 17–30 21,5–34 CLR-oporne 11–22,5 20,5–29,5 25,5–31 MTZ+CLR-oporne 11–24,5 22–30,5 23,5–37

Ryc. 1. Indukcja zmienności morfologicznej szczepu H. pylori Tx30a. (A) Komórki bakterii nietraktowane substancją (kontrola) oraz (B) po wystawieniu na dzia-łanie minimalnych stężeń bakteriobójczych (MBC=8 μg/ml) sertraliny. Przejście form spiralnych w kokoidalne po 24-godzinnej inkubacji z badaną substancją. Wielkość stref zahamowania wzrostu [mm]; CLR – klarytromycyna; MTZ – metronidazol.

Tabela 1. Aktywność sertraliny względem antybiotykowrażliwych i antybiotykoopornych szczepów H. pylori.

klarytromycyną, tetracykliną i metronidazolem) została oznaczona metodą szachownicy. Dodatkowo badania poszerzo-no o obserwacje przy użyciu mikroskopu świetlnego, fluorescencyjnego oraz skaningowego mikroskopu elektroposzerzo-nowego. Wyniki Z zastosowaniem metody dyfuzyjno-krążkowej wykazano zależną od stężenia aktywność bakteriobójczą sertra-liny ze strefami zahamowania wzrostu w zakresie 10–25 mm, 17–33 mm i 19–37 mm, odpowiednio dla krążków nasą-czonych 0,2 mg, 1 mg i 2 mg substancji. Minimalne stężenia hamujące (ang. minimum inhibitory concentration – MIC) wynosiły 2–8 μg/ml, zaś minimalne stężenia bakteriobójcze (ang. minimum bactericidal concentration – MBC) 4–8 μg/ ml. W przypadku obu metod – dyfuzyjno-krążkowej i mikrorozcieńczeń – nie zaobserwowano korelacji między profilem oporności na antybiotyki a wrażliwością badanych szczepów na sertralinę. Badanie żywotności w czasie ukazało zależną od czasu i od zastosowanego stężenia bakteriobójczość sertraliny. Spostrzeżono, że stężenia MIC nie indukowały przej-ścia szczepów H. pylori w oporniejszą na antybiotyki formę kokoidalną, natomiast w stężeniach MBC forma ta domino-wała. Podczas obserwacji próbek barwionych przy użyciu zestawu LIVE/DEAD dostrzeżono, że komórki bakterii trakto-wane stężeniami MBC były martwe. Wykorzystując metodę szachownicy, wykazano istnienie synergistycznej/addytyw-nej interakcji sertraliny z wszystkimi czteroma testowanymi antybiotykami (amoksycyliną, klarytromycyną, tetracykliną oraz metronidazolem). Wnioski Wyniki wskazują na wysoką aktywność bakteriobójczą in vitro sertraliny względem H.

pylori. Co więcej, z powodu silnej, dodatniej interakcji sertraliny z antybiotykami istnieje możliwość zastosowania tego

związku jako adiuwanta standardowo stosowanych terapii skierowanych względem tej bakterii. Badania wykonywano w ramach projektu STM.A130.17.034.

Słowa kluczowe: aktywność przeciwbakteryjna, H. pylori, sertralina, terapia alternatywna

PIŚMIENNICTWO

1. Ayaz M, Subhan F, Ahmed J et al. Sertraline enhances the activity of antimicrobial agents against pathogens of clinical relevance. J Biol Res (Thessalon) 2015;22(1):4. 2. Krzyżek P, Franiczek R, Krzyżanowska B, Łaczmański Ł, Migdał P, Gościniak G. In vitro activity of 3-bromopyruvate, an anticancer compound,aAgainst

antibiotic-suscep-tible and antibiotic-resistant _{Helicobacter pylori strains. Cancers (Basel) 2019;11(2).}

3. Li L, Kromann S, Olsen JE, Svenningsen SW, Olsen RH. Insight into synergetic mechanisms of tetracycline and the selective serotonin reuptake inhibitor, sertraline, in a tetracycline-resistant strain of Escherichia coli. J Antibiot (Tokyo) 2017;70(9):944–953.

4. Rhein J, Morawski BM, Hullsiek KH et al. Eﬃcacy of adjunctive sertraline for the treatment of HIV-associated cryptococcal meningitis: an open-label dose-ranging stu-dy. Lancet Infect Dis 2016;16(7):809–818.

(10)

TERAPIA FOTODYNAMICZNA  SKUTECZNA BROŃ W WALCE Z BIOFILMEM

STAPHYLOCOCCUS

HAEMOLYTICUS?

Nowicka J1_{| Pajączkowska M}1_{| Wiench R}2_{| Kuropka P}3_{| Grzech-Leśniak K}4_{| Kadzewicz K}5_{| Sobolewski K}5

2 Zakład Chorób Przyzębia i Błony Śluzowej Jamy Ustnej Katedry Stomatologii Zachowawczej z Endodoncją w Zabrzu Wydziału Lekarsko-Dentystycznego Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Katowicach

3 Zakład Histologii i Embriologii Wydziału Medycyny Weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego we Wrocławiu

4 Katedra i Zakład Chirurgii Stomatologicznej Wydziału Lekarsko-Stomatologicznego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu 5 Student Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu, członek Koła Naukowego Mikrobiologów, działającego przy

Katedrze i Zakładzie Mikrobiologii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu

Wstęp Staphylococcus haemolyticus to mikroorganizm oportunistyczny. Wymieniany jest jako jeden z najczęstszych czynników etiologicznych zakażeń związanych z implantacją biomateriału i tym samym odgrywa istotną rolę w zakaże-niach w ortopedii, przebiegających z wytworzeniem struktur biofilmu. Terapia takich zakażeń jest trudna, stosowana an-tybiotykoterapia czy leczenie chirurgiczne nie zawsze są skuteczne. Wciąż poszukuje się alternatywnych – w odniesieniu do leczenia tradycyjnego – metod terapii. Alternatywą dla terapii zakażeń przewlekłych lub przebiegających z wytworze-niem struktur biofilmu może być terapia fotodynamiczna (ang. photodynamic therapy – PDT). PDT doprowadza do wy-tworzenia cytotoksycznych, reaktywnych form tlenu po zastosowaniu nietoksycznego fotouczulacza i światła o odpowied-niej, dla danego barwnika, długości fali. Doniesienia literaturowe mówią o stosowaniu PDT w dermatologii czy stomato-logii. Cel Ocena wpływu terapii fotodynamicznej na formy planktonowe oraz biofilmowe S. haemolyticus. Materiał i me-tody Badania przeprowadzono na 24 szczepach S. haemolyticus, izolowanych z wymazów z ran, oraz na szczepie wzorco-wym S. epidermidis RP 62A. Do oceny wpływu terapii fotodynamicznej na zastosowane szczepy wykorzystano błękit tolu-idyny (czas absorpcji – jedna minuta i 5 minut) oraz laser diodowy Smart MPro (długość fali – 635 nm). Zastosowano róż-ne warunki działania lasera, biorąc pod uwagę: moc, czas działania i gęstość eróż-nergii. Biomateriał stanowiły wkręty do ko-ści korowej. Do oceny wpływu fotouczulacza, lasera i fototerapii (fotuczulacz + laser) na szczepy gronkowców zastosowano metody jakościowe oraz ilościowe. Stosując metody mikroskopowe, oceniono stopień wchłaniania barwnika przez komór-ki analizowanych szczepów i zwizualizowano wpływ fototerapii na biofilm gronkowców. Oceniono wpływ fototerapii za-równo na planktonowe komórki S. haemolyticus, jak i wpływ PDT na tworzenie oraz eradykację struktur biofilmu. Wyniki Wstępna, jakościowa analiza wykazała, że zarówno sam błękit toluidyny, jak i sam laser nie wpływały na wzrost analizowa-nych szczepów. PDT z wybranymi warunkami działania lasera całkowicie hamowała wzrost szczepów Staphylococcus spp. zarówno przy jedno-, jak i 5-minutowym czasie absorpcji barwnika. Oceniając wpływ PDT na formy planktonowe anali-zowanych szczepów, wykazano wysoki poziom redukcji wartości cfu/ml – u prawie wszystkich szczepów redukcja wynosi-ła 99%, u szczepu klinicznego S. haemolyticus 42 wykazano brak wzrostu (całkowita redukcja). Tylko w przypadku dwóch szczepów klinicznych redukcja wynosiła 61% i 66%. Analizując wpływ terapii na tworzenie biofilmu, wykazano reduk-cję ilości zaadherowanych i tworzących biofilm komórek. Redukcja ta była wysoka i wynosiła 50–97%. Najniższą redukreduk-cję Ryc. 2. Obniżenie żywotności szczepu H. pylori Tx30a po 24-godzinnym wystawieniu na działanie minimalnych stężeń bakteriobójczych (MBC=8 μg/ml) sertraliny. (A) Komórki bakterii na początku przeprowadzanego doświadczenia (0 h) oraz (B) po 24 godzinach inkubacji z sertraliną. Zielony kolor wska-zuje na obecność żywych komórek, natomiast czerwony na zniszczenie bakterii. Skala, 2 μm.

(11)

odnotowano w przypadku szczepu wzorcowego S. epidermidis RP6 2A. Przy ocenie wpływu PDT na dojrzałe struktury bio-filmu poziom redukcji cfu/ml wynosił 43–99%. Wnioski Zastosowane warunki fototerapii skutecznie ograniczały zdolność tworzenia biofilmu oraz eradykowały biofilm utworzony na wkrętach do kości korowej. PDT może stać się alternatywą te-rapii zakażeń w chirurgii ortopedycznej.

Słowa kluczowe: biofilm, laser, S. haemolyticus

OPORNOŚĆ NA ANTYBIOTYKI A TWORZENIE BIOFILMU  PORÓWNANIE STRUKTURY BIOFILMOWEJ

STAPHYLOCOCCUS AUREUS OPORNEGO I WRAŻLIWEGO NA DZIAŁANIE METYCYLINY

Paleczny J | Dydak K

Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej i Parazytologii Uniwersytetu Medycznego im. Piastów Śląskich we Wrocławiu

Wstęp Narastająca oporność na antybiotyki oraz wysoka zdolność do tworzenia biofilmu przyczyniają się do sukcesu

Staphy-lococcus aureus jako czynnika chorobotwórczego w środowisku szpitalnym i pozaszpitalnym. Główną rolę w mechanizmie

two-rzenia biofilmu odgrywa u gronkowca złocistego glikan PIA (ang. polysaccharide intercellular adhesin), który wzmaga agrega-cję międzykomórkową i adhezję do powierzchni biotycznych oraz abiotycznych [1]. Badania wykazały związek pomiędzy wraż-liwością/opornością bakterii na metycylinę a tworzeniem biofilmu. Szczepy MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus

au-reus; gronkowiec złocisty oporny na metycylinę), w przeciwieństwie do szczepów MSSA (ang. methicillin-susceptible Staphy-lococcus aureus; gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę), mogą tworzyć biofilm niezależnie od produkcji glikanu [4]. Przy

braku obecności PIA ważny udział w tworzeniu biofilmu MRSA odgrywają białka powierzchniowe, autolizyna i eDNA [2, 3]. Jednak wpływ polisacharydów i adhezyn na fenotyp biofilmu MRSA i MSSA pozostaje niejasny. Nabycie oporności prawdopo-dobnie hamuje tworzenie macierzy typu polisacharydowego, a sprzyja tworzeniu macierzy białkowej [5]. Cel Określenie róż-nic pomiędzy biofilmem, który tworzą szczepy gronkowca złocistego opornego na działanie metycyliny oraz który tworzą szcze-py wrażliwe na ten antybiotyk, z wykorzystaniem podstawowych metod mikrobiologicznych. Materiał i metody Grupę bada-ną stanowiło 19 klinicznych szczepów bakterii Staphylococcus aureus pochodzących z kolekcji Katedry i Zakładu Mikrobiolo-gii Farmaceutycznej i ParazytoloMikrobiolo-gii Uniwersytetu Medycznego we Wrocławiu oraz szczepy referencyjne: ATCC 6538 (szczep MSSA) i MR-3 ATCC 33591 (szczep MRSA). Drobnoustroje hodowano na podłożu stałym Agar Columbia z 5% krwią bara-nią i płynnym bulionie tryptozowo-sojowym (ang. tryptic soy broth – TSB). Antybiogram podstawowy Zawiesiny bakteryjne o gęstości 0,5 MF (densytometr Densimat, bioMérieux) przygotowano ze świeżej hodowli na podłożu TSB. Przy użyciu jałowej wymazówki drobnoustroje posiano na podłoże Müller-Hinton agar. Następnie na agar nałożono krążki nasączone antybiotyka-mi (BD Becton, Dickinson Company) – krążek z erytromycyną (15 μg/ml) i klindamycyną (2 μg/ml) w odległości 16–20 mm i krążek z cefoksytyną (30 μg/ml). Po 24-godzinnej inkubacji w 35°C odczytano wielkości stref zahamowania wzrostu bakterii. Otrzymane wartości porównano z tabelami referencyjnymi EUCAST wersja 9.0, obowiązującymi od dnia 1 stycznia 2019 roku. Zdolność tworzenia biofilmu – barwienie fioletem krystalicznym Hodowle planktoniczne w TSB o gęstości 1 MF rozcieńczo-no 1000-krotnie. Po 100 μl zawiesiny każdego szczepu dodarozcieńczo-no do sześciu dołków na 96-dołkowej płytce polistyrerozcieńczo-nowej i inku-bowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C. Po upływie zadanego czasu zawiesinę odciągnięto przy użyciu pompy perystal-tycznej (Reglo Digital, Ismatec). Biofilm, utworzony na dnie dołków, przepłukano dwukrotnie 100 μl 0,9% NaCl. Płytkę suszono przez 10 minut w 37°C. Do każdego dołka dodano po 100 μl fioletu krystalicznego i inkubowano 10 minut w temperaturze po-kojowej. Następnie barwnik odciągnięto, a dołki przepłukano 0,9% NaCl dwukrotnie. Płytkę inkubowano 10 minut w 37°C. Do każdego dołka dodano po 100 μl 30% kwasu octowego i wytrząsano przez 15 minut na wytrząsarce (Ika-Schüttler MTS) 4500 obrotów/minutę. Roztwory przeniesiono do nowej płytki. Absorbancję zmierzono przy długości fali 550 nm na spektrofotome-trze (Multiscan GO Microplate Spectrophotometer, ThermoFisher Scientific). Zdolność tworzenia biofilmu – metoda Richard-sa Biofilm utworzono i oczyszczono analogicznie do metody z fioletem krystalicznym. Po wysuszeniu płytki do każdego doł-ka dodano po 200 μl TSB i 2 μl 1% TTC (roztwór chlorku 2,3,5-trójfenylo-tetrazoliowego). Po godzinnej inkubacji w 37°C za-wiesiny odciągnięto. Następnie do każdego dołka dodano po 100 μl podgrzanej mieszaniny (95% kwasu octowego i 5% etanolu) i wytrząsano przez 15 minut (4500 obrotów/minutę). Zawartość dołków przeniesiono do nowej płytki i zmierzono absorbancję (480 nm). Posiew ilościowy Biofilmy wybranych 10 szczepów (5 MSSA i 5 MRSA) założono odpowiednio do poprzednich eta-pów badania. Dla każdego szczepu wykonano po dwa powtórzenia. Po 24 godzinach inkubacji w 37°C zawiesinę bakteryjną od-ciągnięto, a biofilm przepłukano dwukrotnie 0,9% NaCl. Do dołka dodano 100 μl 0,5% saponiny (Sigma-Aldrich). Roztwór kil-kakrotnie wymieszano aspiracyjnie i całą objętość przeniesiono do 900 μl 0,9% NaCl, a następnie rozcieńczono do 107_metodą mikrorozcieńczeń. Rozcieńczenia 104_{do 10}7_{posiano ilościowo na podłoża stałe tryptozowo-sojowe. Po 24 godzinach inkubacji}

(12)

FOX S/I/R E S/I/R DA S/I/R MLSB 0S 30 S 31 S 29 S – 1S 28 S 25 S 25 S – 2S 31 S 27 S 28 S – 3S 27 S 30 S 27 S – 4S 29 S 30 S 26 S – 5S 28 S 27 S 27 S – 6S 26 S 6 R 26 S + 7S 26 S 6 R 27 S + 8S 25 S 6 R 29 S + 9S 28 S 31 S 29 S – 10S 26 S 6 R 29 S + 11R 17 R 28 S 28 S – 12R 18 R 6 R 6 R – 13R 19 R 6 R 30 S + 14R 13 R 6 R 6 R – 15R 18 R 6 R 28 S + 16R 18 R 6 R 31 S + 17R 13 R 26 S 27 S – 18R 7 R 0 R 0 R – 19R 0 R 0 R 0 R – 20R 20 R 0 R 0 R – i interpretacja wyników.

0S-10S – szczepy S. aureus wrażliwe na metycylinę, n=11;

11R-20R – szczepy S. aureus oporne na metycylinę, n=10;

FOX – cefoksytyna; DA – klindamycyna; E – erytromycyna;

S (ang. susceptible, standard dosing regimen) – wraż-liwy na działanie antybiotyku;

I (ang. susceptible, increased exposure) – wrażliwy, zwiększona ekspozycja;

R (ang. resistant) – oporny na działanie antybiotyku;

MLS_B – mechanizm oporności na makrolidy,

linkoza-midy i streptograminę B; „+” – mechanizm MLSB obecny; „–” – mechanizm MLSB nieobecny. 2,0 1,5 1,0 0,5 0 Ab550nm 0–10 MSSA 11–20 MSSA 1,5 1,0 0,5 0 Ab480nm 0–10 MSSA 11–20 MSSA

*

Ryc. 1. Zdolność tworzenia bioﬁlmu – barwie-nie ﬁoletem krystalicznym.

Ryc. 2. Zdolność tworzenia bioﬁlmu – metoda Richardsa.

MSSA (ang. methicillin-susceptible Staphylococcus

au-reus) – gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę;

MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus

au-reus) – gronkowiec złocisty oporny na metycylinę;

0–10MSSA – szczepy S. aureus wrażliwe na

metycy-linę, n=11;

11–20MRSA – szczepy S. aureus oporne na

metycy-linę, n=10;

Abs – absorbancja mierzona przydługości fali 550 nm.

MSSA (ang. methicillin-susceptible Staphylococcus

au-reus) – gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę;

MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus

au-reus) – gronkowiec złocisty oporny na metycylinę;

0–10MSSA – szczepy _{S. aureus wrażliwe na}

mety-cylinę, n=11;

11–20MRSA – szczepy S. aureus oporne na

metycy-linę, n=10;

(13)

Średnia Średnia +/- SE Średnia +/- 1,96*SE 6E11 5E11 4E11 3E11 2E11 1E11 0 -1E11 CFU/ml MSSA Zmn2 MRSA

MSSA (ang. methicillin susceptible Staphylococcus

au-reus) – gronkowiec złocisty wrażliwy na metycylinę, n=5;

MRSA (ang. methicillin resistant Staphylococcus aureus)

– gronkowiec złocisty oporny na metycylinę, n=5; CFU/ml (ang. colony forming unit) – jednostka two-rząca kolonię/mililitr.

w 37°C zliczono kolonie. Analiza statystyczna Analizę statystyczną przeprowadzono w programie GraphPad Prism 5 i Statisti-ca 13.0 z użyciem testów U Manna-Whitney’a i Kruskala-Wallisa z analizą post hoc Dunna. Wyniki, dla których p≤0,05, przy-jęto za istotne statystycznie. Wyniki Antybiogram podstawowy Wielkości stref zahamowania wzrostu szczepów

Staphylococ-cus aureus przez cefoksytynę (FOX), erytromycynę (E) i klindamycynę (DA), z zaznaczeniem występowania mechanizmu

opor-ności MLSB, przedstawiono w Tabeli 1. Wyniki zinterpretowano w oparciu o wytyczne EUCAST wersja 9.0, obowiązujące od dnia 1 stycznia 2019 roku. Zdolność tworzenia biofilmu – barwienie fioletem krystalicznym Na Ryc. 1 przedstawiono średnie wartości absorbancji dla 10 szczepów MRSA i 11 szczepów MSSA. W teście U-Manna Whitneya o poziomie istotności p≤0,05 porównano wartości absorbancji dla każdego szczepu w sześciu powtórzeniach. Otrzymane różnice nie są istotne statystycznie (p=0,0703). Zdolność tworzenia biofilmu – metoda Richardsa Metodą Richardsa wykazano różnice w biofilmie utworzonym przez szczepy MSSA i MRSA. Na Ryc. 2 przedstawiono średnie wartości absorbancji dla 6 powtórzeń badanych szczepów gron-kowca złocistego. Czerwona barwa powstała w wyniku redukcji bezbarwnego TTC przez żywe komórki bakteryjne do forma-zanu. W teście U-Manna Whitneya o poziomie istotności p≤0,05 otrzymano różnice istotne statystycznie (p=0,0095). Posiew ilościowy Porównano ilość komórek tworzących biofilm przez szczepy MSSA i MRSA. Wartości wyrażono w jednostce tworzą-cą kolonię (ang. colony forming unit) na mililitr CFU/ml. Na Ryc. 3 przedstawiono otrzymane różnice, jednakże test statystycz-ny U-Mann Whitneya o poziomie istotności p≤0,05 wykazał brak istotności w otrzymastatystycz-nych różnicach (p=0,1037). Wnioski 1. Szczepy MSSA i MRSA tworzą porównywalną ilość masy biofilmowej. 2. Poziom aktywności metabolicznej jest wyższy u szcze-pów MRSA niż MSSA. 3. Ilość komórek bakteryjnych tworzących biofilm przez szczepy MRSA jest większa niż MSSA. Otrzy-mane wyniki wskazują, że występowanie mechanizmu oporności na metycylinę u Staphylococcus aureus znajduje odzwiercie-dlenie w formowaniu biofilmu. Podobna ilość biomasy nie wyklucza istnienia różnic w strukturze przestrzennej. Liczba komó-rek bakteryjnych tworzących biofilm MRSA jest widocznie większa, niż w przypadku szczepów MSSA. Brak istotności staty-stycznej może być spowodowany ograniczeniami zastosowanej metody. Wyższa aktywność metaboliczna MRSA, w porówna-niu do MSSA, jest wynikiem większej liczebności żywych komórek w biofilmie tworzonym przez szczepy oporne na metycylinę.

Badania wykonano ze środków ST.D230.18.008.

Słowa kluczowe: biofilm, MRSA, MSSA, Staphylococcus aureus

PIŚMIENNICTWO

1. Cramton SE, Gerke C, Schnell NF, Nichols WW, Götz F. The intercellular adhesion (ica) locus is present in Staphylococcus aureus and is required for bioﬁlm formation. In-fecti Immun 1999;67(10):5427–5433.

2. Houston P, Rowe SE, Pozzi C, Waters EM, O’Gara JP. Essential role for the major autolysin in the ﬁbronectin-binding protein-mediated Staphylococcus aureus bioﬁlm phenotype. Infect Immun 2011;79(3):1153–1165.

3. O’Neill E, Pozzi C, Houston P et al. A novel _{Staphylococcus aureus bioﬁlm phenotype mediated by the ﬁbronectin-binding proteins, FnBPA and FnBPB. J Bacteriol} 2008;190(11):3835–3850.

4. O’Neill E, Pozzi C, Houston P et al. Association between methicillin susceptibility and bioﬁlm regulation in Staphylococcus aureus isolates from device-related infec-tions. J Clin Microbiol 2007;45(5):1379–1388.

5. Pozzi C, Waters EM, Rudkin JK et al. Methicillin resistance alters the bioﬁlm phenotype and attenuates virulence in Staphylococcus aureus device-associated infections. PLoS Pathog 2012;8(4):e1002626.

(14)

ANALIZA GENOTYPOWA I FENOTYPOWA EPIDEMICZNYCH SZCZEPÓW

KLEBSIELLA PNEUMONIAE NDM

Pruss A1_{| Kwiatkowski P}1_{| Fijałkowski K}2_{| Masiuk H}1_{| Galant K}1_{| Jursa-Kulesza J}1_{| Giedrys-Kalemba S}1_{| Dołęgowska B}1

1 Katedra Mikrobiologii, Immunologii i Medycyny Laboratoryjnej Pomorskiego Uniwersytetu Medycznego w Szczecinie

2 Katedra Immunologii, Mikrobiologii i Chemii Fizjologicznej Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie Wstęp Wielooporne szczepy Klebsiella pneumoniae należą do grupy najczęściej izolowanych czynników etiologicznych zakażeń szpitalnych. Niepokojącym mechanizmem oporności jest wytwarzanie enzymów z grupy karbapenemaz typu NDM (ang. New Delhi metallo-β-lactamase). Zdolność transferu genów blaNDM między gatunkami bakterii sprawia, że szczepy NDM(+) stanowią obecnie ogromny problem terapeutyczny i epidemiologiczny. Dodatkowo zdolność tworzenia biofilmu przez te szczepy przyspiesza kolonizację tkanek i rozwój zakażenia. Zagregowane w biofilmie bakterie okryte są zewnątrzkomórkową macierzą, która w dużej mierze odpowiada za oporność i tolerancję biofilmu na antybiotyki oraz an-tyseptyki. Komórki w macierzy biofilmowej wykazują zróżnicowaną aktywność metaboliczną: od bardzo wysokiej w war-stwach szczytowych, po całkowicie zatrzymaną w warw war-stwach podstawnych. Cel Celem badań było określenie pokrewień-stwa oraz zdolności tworzenia biofilmu wśród epidemicznych szczepów K. pneumoniae NDM-1, izolowanych z materiałów klinicznych. Materiał i metody Badaniem objęto 33 szczepy K. pneumoniae NDM-1 izolowane z ognisk epidemicznych od pacjentów różnych oddziałów Szpitala Uniwersyteckiego w Zielonej Górze. Izolaty pochodziły z: krwi, moczu, wydzieliny z drzewa oskrzelowego oraz z wymazu z odbytu. Pokrewieństwo genetyczne szczepów określono metodą PFGE z wykorzy-staniem programu FPQuest. Za punkt odcięcia przyjęto 0,90 (Sab=90%). W celu określenia występowania poszczególnych genów kodujących czynniki wirulencji posłużono się reakcją PCR (ang. polymerase chain reaction). Zdolność tworzenia biofilmu in vitro oceniano za pomocą barwienia fioletem krystalicznym, natomiast aktywność metaboliczną i liczbę komó-rek w biofilmie z wykorzystaniem testu redukcji resazuryny. Pozwoliło to wykazać, które z izolatów tworzą najwyższą, a któ-re najniższą ilość macierzy biofilmowej oraz oka któ-reślić liczbę żywych komóa któ-rek bakteryjnych w biofilmie. Wyniki Wszystkie badane szczepy zostały zakwalifikowane do jednego genotypu, jednak różniły się pod względem występowania genów zja-dliwości. U wszystkich badanych szczepów K. pneumoniae potwierdzono obecność genu zaangażowanego w syntezę rdze-nia polisacharydowego wabG oraz fimH, genu warunkującego zdolności adhezyjne bakterii. 92% szczepów posiadało gen

uge, którego produkt uczestniczy w syntezie otoczki. Najniższy odsetek (23%) odnotowano w przypadku genu

odgrywają-cego istotną rolę w procesie pobierania żelaza – kfu. Genu magA, warunkująodgrywają-cego obfite wytwarzanie śluzu, oraz genu rmpA, regulującego syntezę polisacharydu otoczkowego, nie posiadał żaden z badanych szczepów K. pneumoniae. Zaobserwowa-no także różnice ilościi wytwarzanego biofilmu – zarówZaobserwowa-no pod względem ilości macierzy, jak i żywych komórek w biofilmie. Wśród 9 szczepów wytwarzających największe ilości biofilmu, u 4 biofilm składał się przede wszystkim z macierzy i zawie-rał stosunkowo małą liczbę żywych komórek, a w przypadku 5 było odwrotnie: biofilm składał się przede wszystkim z ży-wych komórek, a macierz stanowiła niewielką jego część. Niewielką ilość biofilmu pod względem komórek oraz macierzy wytwarzało 6 izolatów, natomiast 18 pozostałych szczepów wytwarzało biofilm na porównywalnym, średnim poziomie (za-równo w ilości macierzy, jak i żywych komórek). Wnioski Przynależność epidemicznych szczepów K. pneumoniae NDM-1

Ryc. 1. Produkcja bioﬁlmu przez szczepy K. pneumoniae – test barwienia ﬁoletem krystalicznym.

Absorbancja (λ=580 nm) Numer szczepu 1 1 0 3 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

(15)

do jednego genotypu świadczy o horyzontalnym transferze tego samego klonu w oddziałach szpitalnych, co wymaga zwięk-szenia nadzoru i weryfikacji procedur. Szczepy wykazywały zróżnicowanie w zakresie występowania genów zjadliwości oraz zdolności wytwarzania biofilmu – zarówno w ilości macierzy, jak i żywych komórek w biofilmie. Ewentualny wpływ zróż-nicowanej aktywności metabolicznej biofilmu szczepu na skuteczność środków przeciwdrobnoustrojowych będzie przed-miotem dalszych badań.

Słowa kluczowe: biofilm, Klebsiella pneumoniae NDM, zakażenia szpitalne

NATURALNE EKSTRAKTY ROŚLINNE JAKO INHIBITORY GRONKOWCOWEJ SORTAZY A

Wójcik-Bojek U1_{| Polka D}2_{| Żuchowski J}3_{| Sadowska B}1

1 Pracownia Biologii Zakażeń Katedry Immunologii i Biologii Infekcyjnej Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Łódzkiego

2 Instytut Biochemii Technicznej Wydziału Biotechnologii i Nauk o Żywności Politechniki Łódzkiej

3 Zakład Biochemii i Jakości Plonów Instytutu Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa – Państwowego Instytutu Badawczego w Puławach

Wstęp Zakażenia gronkowcowe należą do najczęstszych zakażeń szpitalnych i pozaszpitalnych u ludzi, m.in. z uwagi na łatwą kolonizację przez te drobnoustroje powierzchni abiotycznych (np. biomateriały do zastosowań medycznych) oraz biotycznych (tj. skóra czy powierzchnia błon śluzowych) [3]. W procesie adhezji Staphylococcus aureus, bakterii będących głównym czynnikiem etiologicznym tych infekcji, bierze udział szeroka gama adhezyn powierzchniowych, wśród których kluczową rolę odgrywają białka powierzchniowe określane mianem MSCRAMMs (ang. microbial surface components re-cognising adhesive matrix molecules), czyli komponenty powierzchniowe drobnoustrojów rozpoznające białka macierzy zewnątrzkomórkowej gospodarza. Do MSCRAMMs S. aureus zalicza się m.in.: gronkowcowe białko A (SpA), białka wią-żące fibronektynę (FnBPA i FnBPB), białko wiąwią-żące kolagen (Cna) czy czynniki skupiania (ClfA i ClfB) [1]. W budowie tych cząsteczek można wyróżnić konserwatywny C-terminalny region, tzw. motyw LPXTG, który rozpoznaje enzym sorta-za A (SrtA), odpowiedzialny sorta-za kowalencyjne wiąsorta-zanie MSCRAMMs z peptydoglikanem ściany komórkowej bakterii. Za-blokowanie aktywności tego enzymu powinno zatem skutkować ograniczoną ekspresją powierzchniowych adhezyn na ko-mórkach S. aureus, a w efekcie obniżaniem skuteczności adhezji i tworzeniem biofilmu przez te drobnoustroje. Inhibitorów SrtA poszukuje się m.in. wśród nowo syntetyzowanych związków chemicznych oraz związków pochodzenia roślinnego [2, 4]. Cel Celem prezentowanych badań była ocena wpływu ekstraktów z owoców i kory kaliny koralowej (Viburnum opulus L.), frakcji fenolowych i hydrofobowych ekstraktów z owoców, liści i gałązek rokitnika zwyczajnego (Elaeagnus rhamnoides L.) oraz ekstraktu z ziela miodunki plamistej (Pulmonaria officinalis L.) na aktywność SrtA S. aureus w warunkach in vitro, a także określenie wpływu ekstraktów z kaliny koralowej na właściwości komórek S. aureus warunkujące tworzenie biofil-mu in vitro. Materiał i metody Ekstrakty roślinne otrzymano z Instytutu Biochemii Technicznej Politechniki Łódzkiej oraz z Instytutu Uprawy Nawożenia i Gleboznawstwa – Państwowego Instytutu Badawczego (IUNG-PIB) w Puławach w posta-ci liofilizatów, które po rozpuszczeniu stosowano w stężeniach 100 i 500 μg/ml. Aktywność SrtA oceniano z zastosowaniem testu SensoLyte® 520 Sortase A Activity Assay Kit (AnaSpec Inc.), po 30 i 60 minutach ekspozycji na dany ekstrakt. Szczepy referencyjne S. aureus (ATCC 29213 – MSSA, ATCC 43300 – MRSA), z kolekcji Pracowni Biologii Zakażeń Uniwersytetu Łódzkiego, poddawano 24-godzinnej ekspozycji na ekstrakty z kaliny koralowej, a następnie oceniano ich zdolność do two-rzenia biofilmu na powierzchni abiotycznej z wykorzystaniem testu LIVE/DEAD® BacLight™ Bacterial Viability Kit. Wyni-ki Aktywność SrtA po ekspozycji na badane ekstrakty roślinne przedstawiono na Ryc. 1 w odniesieniu do aktywności SrtA nietraktowanej ekstraktami, której aktywność uznano za 100%. Stwierdzono, iż wszystkie badane ekstrakty wykazywały zdolność hamowania aktywności SrtA S. aureus in vitro, a efekt ten zależał od stężenia i rodzaju zastosowanego ekstraktu. Najsilniejszy efekt hamujący wykazywały ekstrakty z liści rokitnika zwyczajnego, stosowane w stężeniu 500 μg/ml, zarówno po czasie 30 minut (Ryc. 1A), jak i 60 minut (Ryc. 1B). W przypadku działania tych ekstraktów odnotowano spadek aktyw-ności SrtA o ponad 92% i ponad 75%, odpowiednio dla frakcji fenolowej (LF) i hydrofobowej (LL). Ekstrakty z kaliny ko-ralowej (KO, KK; Ryc. 1) hamowały aktywność SrtA w zakresie od 21,6 do 60,5% oraz od 6,4 do 46,7%, użyte w stężeniach odpowiednio 500 oraz 100 μg/ml. Natomiast ekstrakt z ziela miodunki plamistej (POE, Ryc. 1) ograniczył aktywność SrtA o ponad 70%, gdy był użyty w wyższym stężeniu. Oceniając wpływ ekstraktów z kaliny koralowej na właściwości komórek

S. aureus, stwierdzono, iż gronkowce poddane 24-godzinnemu działaniu tych preparatów w większości układów

(16)

rodzaju użytego ekstraktu), odpowiednio dla S. aureus ATCC 29213 oraz S. aureus ATCC 43300, w porównaniu do biofilmu tworzonego przez bakterie nietraktowane ekstraktami (Ryc. 2). Jedynie w przypadku ekstraktu etanolowego z owoców ka-liny (K_eO) oraz acetonowego z kory kaliny (K_aK), stosowanych w stężeniu 100 μg/ml, stwierdzono nieznaczne ograniczenie tworzenia biofilmu przez S. aureus ATCC 29213 (Ryc. 2A). Wnioski Badane ekstrakty roślinne wykazywały zdolność znacz-nego hamowania aktywności SrtA w warunkach in vitro poza komórkami drobnoustrojów, jednak efekt ten nie ma bezpo-średniego przełożenia na zdolność gronkowców do tworzenia biofilmu. Na podstawie uzyskanych wyników można speku-lować, iż 24-godzinna ekspozycja S. aureus na działanie ekstraktów z kaliny koralowej nie wywarła istotnego wpływu na Ryc. 1. Wpływ ekstraktów roślinnych na aktywność SrtA po 30 minutach (A) oraz 60 minutach (B) ekspozycji.

Ekstrakty z rokitnika zwyczajnego: frakcje fenolowe (F) i hydrofobowe (L) z owoców (O), gałązek (G) i liści (L); Ekstrakty z kaliny koralowej: acetonowe (A), etanolowe (E), wodne (W) ekstrakty z owoców (O) i kory (K); Ekstrakt z miodunki plamistej: POE;

Związki referencyjne: kwercetyna (Q), kwas chlorogenowy (KCh).

OF GF LF OL GL LL Q

KaO KeO KwO KaK KeK KwK KCh POE

120 100 80 60 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0 120 100 80 60 40 20 0

KaO KeO KwO KaK KeK KwK KCh POE

120 100 80 60 40 20 0 Aktywność sr tA (%) Aktywność sr tA (%) Aktywność sr tA (%) Aktywność sr tA (%)

Ekstrakty z rokitnika zwyczajnego

Ekstrakty z kaliny koralowej i miodunki plamistej

100 μg/ml 500 μg/ml B 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 140 120 100 80 60 40 20 0 A B Biofilm (%) Biofilm (%)

KaO KeO KwO KaK KeK KwK KCh KaO KeO KwO KaK KeK KwK KCh

100 μg/ml 500 μg/ml

Ekstrakty z kaliny koralowej Ekstrakty z kaliny koralowej