COVID-19: potencjalne zastosowania testów serologicznych

(1)

COVID19: POTENCJALNE ZASTOSOWANIA TESTÓW SEROLOGICZNYCH

COVID19: POTENTIAL APPLICATIONS OF SEROLOGICAL TESTING

ORCID*: 0000-0002-0514-2281 | 0000-0002-4608-5316 | 0000-0002-7780-3448

Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej CSK MON Wojskowego Instytutu Medycznego w Warszawie

} AGNIESZKA WOŹNIAKKOSEK

Zakład Diagnostyki Laboratoryjnej CSK MON, Wojskowy Instytut Medyczny,

ul. Szaserów 128, 04-141 Warszawa, e-mail: wozniak-kosek@wim.mil.pl Wpłynęło: 16.09.2020

Zaakceptowano: 29.09.2020 DOI: dx.doi.org/10.15374/FZ2020027 *według kolejności na liście Autorów STRESZCZENIE: Przeciwciała przeciwko SARS-CoV-2 pojawiają się we krwi większości

zaka-żonych pacjentów w ciągu dwóch tygodni od wystąpienia objawów COVID-19. Testy serolo-giczne do wykrywania/oznaczania przeciwciał powinny mieć wysoką czułość, a nawet wyższą swoistość, aby osiągnąć co najmniej 95% dodatnią wartość predykcyjną, nawet jeśli częstość występowania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 jest niska. W związku z powyższym tylko niewiel-ka liczba testów jest akceptowana do celów diagnostycznych i epidemiologicznych. Niektó-re z testów są adaptowane do automatycznych analizatorów o dużej przepustowości, któNiektó-re umożliwiają zwiększenie liczby testów do kilkuset, a nawet kilku tysięcy dziennie. Testy serolo-giczne mają kilka potencjalnych zastosowań. Przede wszystkim służą do diagnozowania prze-bytego zakażenia SARS-CoV-2 lub ekspozycji na wirusa. Mogą być stosowane jako dodatko-wa pomoc w diagnozododatko-waniu późnego COVID-19 u pacjentów z silnym podejrzeniem choro-by i ujemnymi wynikami testów molekularnych. Inne możliwe zastosowania obejmują: ocenę przypuszczalnego statusu immunologicznego wyleczonych pacjentów, szacowanie częstości występowania COVID-19 w populacji ogólnej i wybranych grupach w celu zaplanowania środ-ków ochronnych oraz terapeutycznych, badanie potencjalnych dawców osocza pod kątem le-czenia osoczem ozdrowieńców, badanie skuteczność szczepionki przeciw COVID-19 oraz usta-lanie priorytetów w zakresie szczepień.

SŁOWA KLUCZOWE: COVID-19, odporność, przeciwciała, seroprewalencja, testy serologiczne ABSTRACT: Antibodies against SARS-CoV-2 appear in the blood of most infected patients wi-thin two weeks after the onset of COVID-19 symptoms. Serological tests for antibody detec-tion/determination should have high sensitivity and even higher speciﬁcity to achieve at le-ast 95% positive predictive value, even if the prevalence of anti-SARS-CoV-2 antibodies is low. Therefore, only a small number of the tests are accepted for diagnostic and epidemiological purposes. Some of the assays are adapted for high-throughput automatic analyzers, which al-low to scale up testing to several hundred or even several thousands of tests per day. Serolo-gic tests have several potential applications. First of all, they are used to diagnose past infection with SARS-CoV-2 or exposure to the virus. They can be used as an additional supplementary aid in diagnosing late COVID-19 in patients with a strong suspicion of the disease and negati-ve molecular tests. Other possible uses of antibody testing include: assessing the presumptinegati-ve immune status of recovered patients, estimating COVID-19 prevalence in the general popula-tion and selected groups to plan protective and treatment measures, testing prospective pla-sma donors for convalescent plapla-sma treatment, studies of COVID-19 vaccine eﬃcacy, and prio-ritizing persons for vaccination.

KEY WORDS: antibodies, COVID-19, immunity serological tests, seroprevalence

WSTĘP

COVID-19 jest ostrą chorobą zakaźną układu oddecho-wego wywołaną wirusem SARS-CoV-2 z możliwością zaję-cia innych układów i narządów.

SARS-CoV-2 jest wirusem RNA, którego genom kodu-je kodu-jego białka strukturalne: białko szczytowe (S, ang. spike protein), odpowiedzialne za reakcję z receptorem na po-wierzchni komórki, białko otoczki (E), białko błonowe (M) i białko nukleokapsydu (N) [38].

(2)

Do zakażenia wirusem SARS-CoV-2 dochodzi głównie drogą kropelkową i częściowo drogą kontaktową oraz praw-dopodobnie poprzez aerozole w przestrzeniach zamknię-tych [54]. Mediana okresu wylęgania wynosi 5 dni (zakres 2–14 dni), a u 1% pacjentów objawy mogą wystąpić po tym czasie [25]. Do najczęstszych symptomów zakażenia należą: podwyższona ciepłota ciała >38°C (88%), suchy kaszel (oko-ło 68%), zmęczenie (38%) i duszność (19%).

Rozpoznanie stawiane jest w oparciu o stwierdzenie obecności materiału genetycznego (RNA) wirusa SARS- -CoV-2 najczęściej w wymazie z gardła lub nosogardzie-li metodą opartą na łańcuchowej reakcji ponosogardzie-limerazy z od-wrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (rRT-PCR, ang. real-time reverse trancription polymerase chain reac-tion), zgodnie z zaleceniami Światowej Organizacji Zdro-wia (ang. World Health Organization – WHO) [8]. Metoda ta jest tzw. złotym standardem w diagnostyce COVID-19 ze względu na wysoką zarówno czułość analityczną, jak i swo-istość analityczną, osiągającą 100% [55]. Natomiast czułość diagnostyczna jest w praktyce niższa i może niekiedy nawet nie przekraczać 70% [60]. Oznacza to, że wynik ujemny nie zawsze wskazuje na brak zakażenia wirusem SARS-CoV-2 [59]. Może to wynikać z niewielkiej liczby cząstek wirusa w miejscu pobrania w bardzo wczesnym lub późnym okre-sie choroby, miejsca i poprawności pobrania próbki, a także z innych przedanalitycznych (np. rozkład RNA) i analitycz-nych przyczyn [28, 57, 65].

Metody molekularne wykorzystywane są głównie do dia-gnostyki pacjentów z objawami wskazującymi na COVID-19. Nie odzwierciedlają skali pandemii, gdyż znaczna liczba przy-padków jest skąpoobjawowa lub bezobjawowa. Z kolei rozwój metod immunochemicznych wykorzystywanych do oznacza-nia przeciwciał anty-SARS-CoV-2 służy przede wszystkim do oceny aspektu epidemiologicznego COVID-19, ale daje także możliwość innego ich zastosowania.

TESTY SEROLOGICZNE DO WYKRYWANIA/

OZNACZANIA PRZECIWCIAŁ PRZECIW SARS

CoV2

RODZAJE TESTÓW SEROLOGICZNYCH

Testy serologiczne służą głównie do retrospektywnej dia-gnostyki przebytego zakażenia COVID-19 lub odnotowania ekspozycji na SARS-CoV-2 poprzez wykrycie i/lub oznacze-nie swoistych przeciwciał w surowicy krwi lub osoczu. Testy te występują w praktyce najczęściej w dwóch formach jako testy jakościowe, najczęściej immunochromatograficzne, tzw. kasetkowe albo testy ELISA (ang. enzyme-linked immu-nosorbent assay), wykorzystywane do półilościowej lub ilo-ściowej oceny poziomu przeciwciał [45]. Ostatnio pojawiają

się także testy immunochemiczne jakościowe i ilościowe, z rozmaitymi sposobami detekcji (najczęściej chemilumi-nescencyjnymi), przystosowane do oznaczeń przeciwciał za pomocą analizatorów automatycznych o dużej wydajności, co umożliwia także przeprowadzanie badań populacyjnych [12]. Jeszcze inny rodzaj testów serologicznych określa obec-ność i miano przeciwciał neutralizujących wirusa SARS- -CoV-2, jednak stosowanie ich jest ograniczone do labora-toriów o trzecim stopniu bezpieczeństwa (BSL-3) z uwagi na pracę z aktywnymi wirusami. Zamiast nich w laborato-riach BSL-2 można stosować surogatowe testy służące do oznaczania przeciwciał skierowanych przeciw domenie biał-ka wirusowego wiążącego się z receptorem komórkowym, które wykazują potencjalne właściwości neutralizujące [51]. Głównymi składnikami testów serologicznych są anty-geny – białka składowe wirusa SARS-CoV-2. Często wyko-rzystuje się w testach jakościowych i niekiedy w ilościowych białko nukleokapsydu (N) lub nieco rzadziej białko szczy-towe (S) [33]. W testach wykorzystujących białko S stoso-wane są dwa antygeny: podjednostka S1 wiążąca receptor (ang. receptor binding domain – RBD) oraz podjednostka S2 łącząca się z błoną komórkową [52]. Testy serologiczne mogą wykrywać lub określać ilościowo przeciwciała całko-wite skierowane przeciw SARS-CoV-2, przeciwciała nale-żące do poszczególnych klas immunoglobulin (tj. IgM, IgA i IgG) albo jednocześnie zaliczane do dwóch klas. Szybkie testy kasetkowe najczęściej wykrywają przeciwciała w kla-sach IgM i IgG, a dzięki znakowaniu antygenu (np. koloidal-nym złotem) możliwy jest wizualny odczyt wyniku po oko-ło 15 minutach od naniesienia próbki. Rynek diagnostycz-ny oferuje obecnie ponad trzysta różdiagnostycz-nych testów serologicz-nych [17]. Ich jakość jest zróżnicowana i nie wszystkie gwa-rantują wymaganą czułość oraz swoistość. W celu zagwa-rantowania jakości testów przydatnych w diagnostyce CO-VID-19 i w badaniach nad tą chorobą w obliczu pilnych po-trzeb Agencja ds. Żywności i Leków (ang. Food and Drug Administration) w Stanach Zjednoczonych objęła ich ocenę przyspieszoną procedurą i tymczasowo dopuściła je do sto-sowania w ramach przepisów określanych jako (ang.) emer-gency use authorizations (EUA) [12]. Inną organizacją oce-niającą jakość testów diagnostycznych jest FIND (ang. Fo-undation for Innovative New Diagnostics) [17]. Testy opa-trzone znakiem CE/IVD (ang. Conformite Europeen/In

Vi-tro Diagnostics) mogą być stosowane w Unii Europejskiej

do celów diagnostycznych in vitro, a testy oznaczone RUO (ang. esearch use only) wyłącznie do badań naukowych.

CZUŁOŚĆ I SWOISTOŚĆ TESTÓW SEROLOGICZNYCH

Czułość testów serologicznych wykrywających swoiste przeciwciała przeciw SARS-CoV-2 zależy od czasu pojawie-nia się ich mierzalnych poziomów we krwi (serokonwersji). Zao i wsp. wykazali, że mediana dla serokonwersji wynosi

(3)

od 11 do 14 dni w zależności od klasy wykrywanych im-munoglobulin i użytego testu ELISA (11 dni dla ciał całkowitych, 12 dla przeciwciał IgM i 14 dla przeciw-ciał IgG) [64]. Ponadto stwierdzili oni, że największą czułość uzyskuje się, oznaczając sumę przeciwciał, tj. przeciwciała całkowite. Czułość ta wyniosła odpowiednio: w przedziale czasu 1–7 dni – 38,3%, w przedziale 8–14 dni – 89,6% oraz między 15. a 39. dniem – 100% [64]. Podobną dynamikę na-rastania seropozytywności u chorych z potwierdzonym CO-VID-19 wykazali Liu i wsp. [30]. Towarzyszył temu spadek częstości dodatnich wyników badania molekularnego po 10 dniach od początku objawów (Ryc. 1).

W innym badaniu określono czułość dziesięciu jakościo-wych testów immunochromatograficznych pochodzących od różnych producentów, która wahała się od 81,82% do 100%, z wartością modalną około 90% przy oznaczaniu przeciwciał w obu klasach (IgM i/lub IgG) po 20 dniach od pojawienia się objawów COVID-19 [58]. ]. Jednakże istnieją także immuno-chromatograficzne testy kasetkowe, których czułość zawiera się w przedziale 65–85% a więc jest zbyt niska [2].

Niezwykle ważną charakterystyką testów serologicznych jest ich swoistość wobec antygenów SARS-CoV-2. Wyni-ki fałszywie dodatnie mogą prowadzić do nieuzasadnio-nego przypuszczenia o zmniejszonym ryzyku COVID-19 w związku z możliwą wcześniejszą ekspozycją na SARS- -CoV-2. Innym niekorzystnym efektem braku wystarcza-jącej swoistości może być zbyt duży odsetek wyników fał-szywie dodatnich w badaniach seroprewalencji COVID-19 w populacji, co prowadzi do jej przeszacowania, szczegól-nie w sytuacji, gdy jest niska. Daje to wówczas szczegól- nieprawdzi-wy obraz rozpowszechnienia zakażenia w populacji. Główną przyczyną wyników fałszywie dodatnich są reagujące krzy-żowo z antygenami SARS-CoV-2 przeciwciała występują-ce u osób, które uprzednio przebyły zakażenia jednym z in-nych czterech koronawirusów, zwłaszcza podtypami HCo-V-229E i HCoV-HKU1, wywołującymi najczęściej łagodne

zakażenia górnych dróg oddechowych (do około 12% tych infekcji u pacjentów hospitalizowanych) [26]. Pojawianie się reakcji krzyżowych i swoistość testów zależy także od rodza-ju zastosowanych antygenów, ponieważ białko N jest bardziej konserwatywne w przypadku koronawirusów niż białko S, a w obrębie białka S domena wiążąca receptor (RBD) jest bardziej konserwatywna niż całe białko S. Swoistość testów serologicznych (badana z wykorzystaniem próbek sprzed pandemii COVID-19) może być także częściowo zależna od częstości występowania infekcji wywołanych innymi koro-nawirusami w populacji o określonej lokalizacji geograficz-nej, np. w Polsce wynosiła 25% i była wyższa niż w szeregu innych państw [1]. Stwierdzono, że jakościowe testy immu-nochromatograficzne w formie kasetkowej zapewniają zróż-nicowaną, nie zawsze zadowalającą, deklarowaną swoistość od około 84% do 100% [58]. Istnieją jednak również dane, zgodnie z którymi niektóre testy immunochromatograficz-ne wykonywaimmunochromatograficz-ne po 14 dniach od wystąpienia objawów wy-kazują swoistość i czułość ekwiwalentną do testów labora-toryjnych wykorzystujących technikę ELISA lub CLIA (te-sty immunochemiluminescencyjne) [37]. Rolę wagi wyma-gań co do swoistości i czułości testów w kontekście prewa-lencji danej choroby ilustrują następujące przykłady zawar-te w tymczasowych wytycznych Centrum Kontroli i Prewen-cji Chorób (ang. Center of Disease Control – CDC), dotyczą-cych badania przeciwciał przeciw SARS-CoV-2: w populacji, w której częstość występowania przeciwciał wynosi 5%, test z czułością 90% i swoistością 95%, uzyska się dodatnią war-tość predykcyjną 49%. Innymi słowy: mniej niż połowa osób z dodatnim wynikiem testu będzie naprawdę miała przeciw-ciała, natomiast w przypadku tego samego testu, w populacji z częstością występowania przeciwciał przekraczającą 52%, pozytywna wartość predykcyjna przekroczy 95%, co ozna-cza, że wynik fałszywie dodatni będzie stwierdzany rzadziej niż u jednej na 20 osób z wynikiem pozytywnym [20]. Przy-pominanie o tym zjawisku jest istotne w obliczu możliwości

0–5 6–10 11–12

Liczba dni od początku objawów

Odsetek dodatnich wyników (%)

13–15 ≥16 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

% RNA wirusa + % IgM+ i/lub IgG+

Ryc. 1. Czułość wykrywania materiału gene-tycznego SARS-CoV-2 i przeciwciał przeciw wirusowi w różnym czasie od pojawienia się początku objawów zakażenia. Opracowano na podstawie [30].

(4)

badania większych grup ludzi czy wręcz dużych prób z po-pulacji ogólnej. Umożliwiają to niedawno wprowadzone przez duże firmy diagnostyczne metody pozwalające za po-mocą analizatorów automatycznych oznaczać przeciwciała w setkach, a nawet tysiącach próbek dziennie. Najważniejsze z tych testów przedstawiono w Tabeli 1.

Wykrywanie lub oznaczanie przeciwciał całkowitych wy-nika z dążenia do maksymalnego zwiększenia czułości testu. Test umożliwiający wykrywanie zarówno przeciwciał IgM, jak i IgG pozwala na wcześniejszą identyfikację osób zakażo-nych wirusem. Stwierdzono, że wprowadzony ostatnio przez CDC (Stany Zjednoczone) test serologiczny ELISA wykorzy-stujący białko S wirusa SARS-CoV-2, o swoistości przekra-czającej 99% i czułości 96% (po 10 dniach od pojawienia się objawów), może być stosowany m.in. do identyfikacji osób, które przebyły zakażenie SARS-CoV-2 w ciągu uprzednich co najmniej 1–3 tygodni oraz do śledzenia kontaktów i nadzo-ru epidemiologicznego [18]. Nie wszystkie testy serologiczne odznaczają się tak wysoką swoistością oraz czułością i jeśli nie są stosowane u osób z wysokim przedtestowym prawdopodo-bieństwem posiadania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 (takich jak osoby z podejrzeniem przebytego COVID-19), mogą ge-nerować zbyt wiele wyników fałszywie dodatnich. Inną zale-caną przez CDC metodą zwiększania dodatniej wartości pre-dykcyjnej nieco mniej doskonałych testów serologicznych jest zastosowanie algorytmu zwanego testowaniem ortogo-nalnym, w którym osoby, które w pierwszym teście uzyska-ły wynik dodatni, badane są za pomocą drugiego testu. Sku-teczne algorytmy ortogonalne są zasadniczo oparte na bada-niu próbki pacjenta za pomocą dwóch testów, z których każdy ma unikalne cechy konstrukcyjne (np. antygeny lub forma-ty). Efektywność tego podejścia zaprezentowano w Tabeli 2.

Obliczenia dodatniej wartości predykcyjnej dla pary te-stów o znanych wartościach czułości i swoistości w zależno-ści od prewalencji można przeprowadzić za pomocą goto-wych wzorów [44]. Jakość pojedynczego testu lub ich kom-binacji powinna zapewniać pozytywną wartość predykcyjną na poziomie co najmniej 95%.

MOŻLIWE ZASTOSOWANIA TESTÓW

SEROLOGICZNYCH

Zastosowanie testów serologicznych do wykrywania/ oznaczania przeciwciał anty-SARS-CoV-2 można podzielić na kilka obszarów [6]. Jednym z nich jest identyfikacja osób z obecnością przeciwciał, co ma przypuszczalnie zapewnić im odporność na ponowne zakażenie.

Obecność swoistych przeciwciał jest dowodem odpowie-dzi immunologicznej na niedawną lub przebytą wcześniej ekspozycję/zakażenie wirusem SARS-CoV-2 bez względu na to, czy towarzyszyły temu objawy, czy też nie. Przeciw-ciała anty-SARS-CoV-2 wykrywano u 93,1–98,8% pacjen-tów po czasie przekraczającym 14 dni od początku objawów choroby [35, 64].

OCENA PRZYPUSZCZALNEJ ODPORNOŚCI

NA SARSCoV2

Z obecnością swoistych przeciwciał wiążą się nadzie-je i oczekiwania, że osoby, u których one występują, mogą być odporne na ponowne zakażenie. Wynikają one z za-łożenia pewnych analogii dotyczących badań serologicz-nych nad innymi koronawirusami wywołującymi zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej (ang. severe acu-te respiratory syndrome – tj. SARS CoV, 2003) – i MERS CoV (ang. middle east respiratory syndrome, bliskow-schodni zespół niewydolności oddechowej, 2012). Po prze-byciu SARS i MERS odporność utrzymywała się odpo-wiednio przez około 1–2 lata oraz 34 miesiące [27, 32, 42]. Z kolei po zakażeniu innymi koronawirusami (OC43 oraz NL63) utrzymującą się odporność oceniano na 45 tygodni [11]. Istnieją pewne wątpliwości, czy takie analogie można w pełni przenieść na rozwój odpowiedzi immunologicznej i jej trwałość w przypadku zakażenia SARS-CoV-2. Niektó-re fakty wskazują na możliwość wczesnej odporności, np. Robbiani i wsp. wykazali zróżnicowane i skuteczne, ale na

Nazwa testu Producent/ metoda

Przeciwciała Czułość* Swoistość* PPV# _NPV#

Architect SARS- -CoV-2 IgG Abbott/CMIA IgG 100% 99,6% 92,9% 100% LIAISON® SARS- -CoV-2 S1/S2 IgG DiaSorin/CMIA IgG 97,6% 99,3% 88% 99,3% Elecsys® Anti-SARS- -CoV-2 Roche/ECLIA Całkowite 100% 99,8% 96,5% 100% Atellica® IM SARS- -CoV-2 Total (COV2T) Siemens Healthcare Diagnostics/CMIA Całkowite 100% 99,8% 96,7% 100%

Tabela 1. Przykłady testów wykrywających przeciwciała anty-SARS-CoV-2 wykonywanych za pomocą automatycznych analizatorów. Opraco-wano na podstawie [12].

* – wartości średnie; PPV – pozytywna wartość predykcyjna; NPV – negatywna wartość predykcyjna; # _{– przy 5% częstości występowania; CMIA – ang.} chemilumine-scence immuno-assay (metoda immunochemiluminescencyjna); ECLIA – ang. electro-chemiluminechemilumine-scence immuno-assay (metoda elektrochemiluminescencyjna).

(5)

ogół niewysokie miana przeciwciał neutralizujących wiru-sa SARS-CoV-2 u 149 ozdrowieńców COVID-19 po śred-nio 39 dniach od pojawienia się objawów [47]. Szczegól-nie wysoką aktywność antywirusową wykazywały przeciw-ciała skierowane przeciw domenie wiążącej receptor (RBD) białka S wirusa SARS-CoV-2. Podobne obserwacje poczy-nili Wu i wsp., wykazując zróżnicowane, ale na ogół nie-wysokie miana przeciwciał neutralizujących, których po-ziom skorelowany był z przeciwciałami skierowanymi prze-ciw trzem różnym epitopom białka S wirusa SARS-CoV-2 [62]. Wysoką korelację (R2 >0,9) przeciwciał IgG skierowa-nym przeciw białkom wirusa SARS-CoV-2 – nukleokapsy-du i RBD – z przeciwciałami neutralizującymi u chorych z laboratoryjnie potwierdzonym COVID-19 wykazali tak-że To i wsp. [53]. Tego typu korelacje przekonują do twier-dzącej odpowiedzi na pytanie, czy sama obecność przeciw-ciał jest równoznaczna z odpornością. Na wczesną odpor-ność na SARS-CoV-2 wskazuje nieskuteczodpor-ność wywołania powtórnego zakażenia u makaków Rhesus w fazie zdrowie-nia (28 dni po infekcji) [4]. Mimo doniesień o wykrywaniu materiału genetycznego wirusa SARS-CoV-2 u osób, które wyzdrowiały po infekcji COVID-19, nie potwierdzono do tej pory w recenzowanym piśmiennictwie przypadków re-infekcji po przebyciu tej choroby [22, 24]. Wykrywanie nie-wielkich ilości materiału genetycznego wirusa po przeby-ciu zakażenia nie jest jednoznaczne ze stwierdzeniem jego aktywności, gdyż nie potwierdzają tego metody hodowla-ne (są to niereplikujące się fragmenty gehodowla-netyczhodowla-ne SARS- -CoV-2). Nie można także całkowicie wykluczyć wyników fałszywie dodatnich w takiej sytuacji. Innym aspektem do-tyczącym odporności na SARS-CoV-2 może być zróżnico-wany obraz zakażenia – według Long i wsp. w przypadku 37 osób z infekcjami bezobjawowymi odpowiedź immuno-logiczna była słabsza niż u osób z zakażeniem objawowym, a poziom przeciwciał IgG i neutralizujących obniżał się już we wczesnym okresie rekonwalescencji [34]. Obserwacja ta wymaga jednak potwierdzenia w badaniach na większej grupie takich osób. Z kolei badanie Liu i wsp. było próbą określenia czasu utrzymywania się odporności humoralnej po przebyciu zakażenia wirusem SARS-CoV-2. W grupie 1470 pacjentów z potwierdzonym COVID-19 oznaczono przeciwciała anty-SARS-CoV-2 w czasie 33–50 dni (zakres międzykwartylowy) od pojawienia się objawów, uzyskując wyniki dodatnie w przypadku 89,8% pacjentów [31]. Bio-rąc pod uwagę wyniki innych autorów badacze założyli, że

serokonwersja miała miejsce u wszystkich osób, ale w przy-padku około 10% z nich z czasem doszło do zaniku IgG, co świadczy o tym, że mało prawdopodobne jest długo-trwałe wytwarzanie ochronnych przeciwciał po zakaże-niu SARS-CoV-2. Kolejne dokładniejsze metodycznie ba-danie z udziałem 65 pacjentów z potwierdzonym RT-PCR rozpoznaniem COVID-19, u których wielokrotnie mierzo-no przeciwciała neutralizujące, wykazało spadek ich pozio-mów w czasie 94 dni od początku występowania sympto-mów [49]. Konieczne są dalsze badania w celu ustalenia po-ziomu przeciwciał wymaganych do ochrony przed infekcją. Przy rozważaniach dotyczących odporności nie sposób pominąć mechanizmów odpowiedzi komórkowej, która za-znacza się również wyraźnie w zakażeniach SARS-CoV-2 wzrostem liczby swoistych dla tego wirusa limfocytów T u osób w okresie rekonwalescencji [39]. Zjawisko to doty-czy zarówno rekonwalescentów z brakiem przeciwciał, jak i z ich obecnością, z przebiegiem choroby bezobjawowym oraz łagodnym [48].

Na podstawie dotychczasowego piśmiennictwa można przyjąć, że idea tzw. paszportu immunologicznego gwaran-tującego odporność na zakażenie osób posiadających prze-ciwciała anty-SARS-CoV-2 i będąca przepustką do bez-piecznego powrotu do pracy nie jest jeszcze w pełni uza-sadniona [61]. Wydaje się jednak, że już teraz można przy-jąć z wysokim prawdopodobieństwem, że osoby z dodat-nim wynikiem przeciwciał anty-SARS-CoV-2 są obecnie w niewielkim stopniu narażone na ponowne zakażenie. Jeśli jednak po pewnym, niezbyt znanym czasie (np. kilku mie-sięcy), doszłoby do reinfekcji, to przypuszczalnie jej prze-bieg nie byłby ciężki. Pilnie potrzebne są serologiczne ba-dania longitudinalne z udziałem osób z objawowym CO-VID-19 i bezobjawowych, aby określić czas trwania odpor-ności humoralnej. Istotne jest przy tym określenie serolo-gicznych korelatów odporności, w tym rodzajów przeciw-ciał (np. obecność przeciwprzeciw-ciał neutralizujących) i ich po-ziomów/mian. Wydaje się, że na razie potencjał mutacyj-ny SARS-CoV-2 jest nieduży i nie skomplikuje tak przepro-wadzonych badań. Jak dotąd zmiany genetyczne kumulują-ce się w miarę rozprzestrzeniania wirusa nie doprowadzi-ły do powstania różnych jego szczepów. Dwa częste warian-ty D614 oraz G614 różniące się składem aminokwasów biał-ka S1 są w podobnym stopniu neutralizowane przez poliklo-nalne przeciwciała ozdrowieńców po COVID-19 z różnych okresów pandemii [23].

Prewalencja PPV dla jednego testu (czułość=90%, swoistość=95%)

PPV dla dwóch ortogonalnych testów (czułość=90%, swoistość=95%)

2% 26,9% 86,9%

5% 48,6% 94,5%

10% 66,7% 97,3%

30% 88,5% 99,3%

Tabela 2. Dodatnia wartość predykcyjna (PPV) uzyskana za pomocą jednego testu lub dwóch testów (algorytm ortogonalny) w za-leżności od częstości występowania przeciw-ciał w populacji. Opracowano według [20].

(6)

UZUPEŁNIENIE DIAGNOSTYKI PÓŹNEGO

COVID19

Testy serologiczne mogą również stanowić uzupełnie-nie metod molekularnych w diagnostyce COVID-19 w uzupełnie-nie- w nie-których sytuacjach klinicznych. Mogą być pomocne szcze-gólnie w przypadkach podejrzenia koronawirusa, gdy wy-niki badania molekularnego są ujemne, a badania obrazo-we płuc wskazują na możliwość obecności tej choroby [63]. Oznaczanie przeciwciał może poprawić ogólną czułość dia-gnostyczną [30]. Dotyczy to przede wszystkim pacjentów w późniejszym okresie choroby lub jej poinfekcyjnym okre-sie, kiedy ładunek wirusa jest niski [6]. Ograniczeniem te-stów serologicznych w takim zastosowaniu jest oczywi-ście mała przydatność we wczesnym okresie infekcji (<7 dni) oraz możliwe niewykrycie niektórych bezobjawowych przypadków. Ujemny wynik nie wyklucza definitywnie za-każenia. We wspomaganiu diagnostyki COVID-19 najbar-dziej optymalne są testy obejmujące oznaczanie całkowitych przeciwciał ze względu na najwyższą czułość. Przeciwciała przeciw SARS-CoV-2 w klasie IgM, chociaż pojawiają się nieco wcześniej, są mniej swoiste. Serokonwersja z wyraź-nie narastającymi mianami może poprawiać czułość i swo-istość kliniczną. Dodatni wynik powinien zostać potwier-dzony badaniem PCR (pierwszym lub ponownym), jeśli jest to możliwe. Testy serologiczne mogą być także pomoc-ne w diagnostyce COVID-19 u pacjentów z dłużej utrzymu-jącymi się objawami klinicznymi w sytuacji zupełnego bra-ku lub ograniczonej dostępności badań molebra-kularnych pod warunkiem starannego opracowania wytycznych interpre-tacyjnych.

BADANIA NAD SZCZEPIONKAMI PRZECIW

COVID19

Testy serologiczne są także niezbędne do oceny odpo-wiedzi immunologicznej w badaniach nad szczepionkami przeciw COVID-19. W przypadku jednej z wielu obiecu-jących szczepionek z ekspresją białka S koronawirusa po-ziom swoistych przeciwciał w klasie IgG mierzonych te-stem ELISA wzrastał do 28. dnia od pierwszej dawki szcze-pionki. Pełniejsza laboratoryjna ocena wymaga oznacze-nia przeciwciał neutralizujących oraz swoistej odpowie-dzi komórkowej. Oba te elementy odpowieodpowie-dzi immuno-logicznej wystąpiły i były wyraźnie zaznaczone w tym ba-daniu [16]. Oznaczanie przeciwciał przeciw SARS-CoV-2 powinno także poprzedzać rekrutację osób do badania szczepionek, gdyż włączenie pacjentów z dodatnimi prze-ciwciałami może wpływać na rzetelność wyników [29]. Po opracowaniu skutecznych szczepionek osoby z grup wy-sokiego ryzyka, u których nie stwierdzono przeciwciał, powinny być szczepione w pierwszej kolejności. Testy

serologiczne pozwolą także ustalić (w przyszłości), jaki poziom przeciwciał zapewnia ochronę przed zakażeniem oraz jak długo po szczepieniu utrzymywać się będą prze-ciwciała w krążeniu, co może decydować o podaniu daw-ki przypominającej.

KWALIFIKACJA OZDROWIEŃCÓW

JAKO DAWCÓW OSOCZA DO CELÓW

TERAPEUTYCZNYCH

Oznaczanie przeciwciał anty-SARS-CoV-2 ma znaczenie przy wyborze ozdrowieńców do donacji krwi w celu wyko-rzystania osocza do celów terapeutycznych. Dodatni test se-rologiczny po 14 dniach od wystąpienia objawów jest ko-niecznym warunkiem donacji (o ile wcześniej nie stwier-dzono obecności przeciwciał). Pożądane są, w przypadku dostępności, oznaczenia miana przeciwciał neutralizują-cych, które według rekomendacji powinny wynosić co naj-mniej 1:160 [46]. Europejskie zalecenia jako standardowy czas donacji ustaliły na 28 dni po ustąpieniu objawów i wa-runkowo po 14 dniach (m.in. ujemny test RT-PCR w wy-mazie z górnych dróg oddechowych) [3]. Testy serologicz-ne do oznaczania przeciwciał przeciw SARS-CoV-2 powin-ny być opatrzone znakiem CE. Optymalną sytuacją, chociaż na razie formalnie niewymaganą, byłoby wstępne oznacza-nie przeciwciał testami ilościowymi ELISA lub innymi ilo-ściowymi i późniejsze korelowanie ich wyników z mianem przeciwciał neutralizujących. Nie zawsze występuje bowiem wysoka i przewidywalna korelacja między wynikami obu rodzajów tych testów [21]. Istotny zatem jest dobór takich testów serologicznych, których poziom oznaczanych prze-ciwciał skorelowany jest z mianem przeprze-ciwciał neutralizują-cych [36]. Oznaczenia ilościowe miałyby znaczenie przy po-wtórnych donacjach od tych samych ozdrowieńców. Na ra-zie rekomendacje europejskie nie zalecają w takich okolicz-nościach pobierania krwi po upływie 3 miesięcy, gdyż po-ziom przeciwciał może się obniżać. Mimo że przetaczanie osocza ozdrowieńców jest nadal terapią eksperymentalną COVID-19, ale dopuszczoną przez FDA w sytuacjach awa-ryjnych (EUA), w siłach zbrojnych Stanów Zjednoczonych w celu utrzymania gotowości operacyjnej zaplanowano 10 000 pobrań krwi od ozdrowieńców do końca września 2020 roku [7].

BADANIE SEROPREWALENCJI COVID19

Jednym z ważniejszych zastosowań testów serolo-gicznych jest określenie stopnia rozpowszechnienia CO-VID-19 w populacji poprzez oszacowanie seroprewa-lencji. Badanie dużych reprezentatywnych prób z popu-lacji dostarcza pełniejszych informacji na temat zakażeń

(7)

SARS-CoV-2, gdyż obejmuje także przypadki bezobjawo-we i skąpoobjawobezobjawo-we, które nie są uwzględniane w statysty-kach obejmujących najczęściej przypadki kliniczne [9]. Ba-dania seroprewalencji w Stanach Zjednoczonych i Europie wykazały, że częstość wcześniejszej ekspozycji na SARS- -CoV-2 (odzwierciedlonej dodatnimi wynikami na obec-ność przeciwciał) przekracza częstość zgłaszanych przy-padków około 10-krotnie lub nawet więcej [19, 50]. Ba-dania takie wykonywane w różnych momentach czaso-wych obrazują dynamikę rozwoju epidemii i pozwala-ją oszacować czas utrzymywania się poziomu przeciw-ciał w krążeniu oraz dokonywać korekt związanych z ich możliwymi zmianami. Populacyjne badania serologiczne mogą uwzględniać wiek i inne czynniki ryzyka zakażenia SARS-CoV-2, w tym choroby współistniejące oraz zróż-nicowanie ze względu na narażenie zakażeniem (np. pra-cownicy służby zdrowia), lokalizację geograficzną i inne. Na podstawie badań prewalencji przeciwciał anty-SARS- -CoV-2 w populacji można realniej oszacować współczyn-nik umieralności z powodu COVID-19. W szczególno-ści szacowanie współczynnika umieralnoszczególno-ści wśród ogółu osób zakażonych (ang. infection fatality rate – IFR) oraz wśród chorych z objawami i potwierdzonym rozpozna-niem (ang. case fatality rate – CFR) opiera się na dokład-nym określeniu rzeczywistych rozmiarów epidemii [56]. Włączenie danych z badań seroprewalencji do matema-tycznego modelowania transmisji może znacznie zmniej-szyć niepewność szacowania parametrów ciężkości kli-nicznej oraz dynamiki transmisji tych zakażeń.

Testy serologiczne przeprowadzone na szeroką skalę po-zwolą oszacować jak odległy jest cel osiągnięcia progu od-porności stadnej w populacji. Jest to kluczowa informacja wskazująca na to, w jaki sposób i jak długo należy stoso-wać środki prewencyjne, np.: dystans fizyczny, higienę, izo-lację grup wysokiego ryzyka i zakrojone na szeroką ska-lę testowanie [41]. Szacuje się, że do osiągnięcia odpor-ności stadnej niezbędna jest immunizacja (wskutek prze-bycia COVID-19 lub szczepienia) od 50% do 75% popula-cji [15]. W tej chwili częstość występowania dodatnich wy-ników przeciwciał anty-SARS-CoV-2 w populacji general-nej w państwach Unii Europejskiej jest na ogół jednocyfro-wa (poniżej 10%, stan na koniec lipca 2020 roku) – z wy-jątkiem rejonu Ischgl w Austrii, co wskazuje, że osiągnię-cie odporności stadnej przed dostępnością szczepionki jest mało prawdopodobne [14]. Istotną rolę odgrywa tu jed-nak lokalizacja geograficzna, a nawet topografia, ponieważ są enklawy, gdzie seroprewalencja jest wysoka – np. nawet na terenie Nowego Jorku, gdzie średnio wynosi ona około 21%, są obszary, na których zbliża się nawet do 50% [40]. Na uwagę zasługuje również fakt, że w badaniu przepro-wadzonym w Hiszpanii u około ⅓ osób z dodatnimi wyni-kami wskazującymi na obecność swoistych przeciwciał nie występowały żadne objawy choroby [43].

POTENCJALNA DODATKOWA OCENA

SKUTECZNOŚCI LECZENIA PRZED

WYPISANIEM ZE SZPITALA

Kolejnym potencjalnym zastosowaniem testów serolo-gicznych jest pomoc w podejmowaniu decyzji o wypisie ze szpitala pacjentów, którzy wyzdrowieli po zakażeniu SARS- -CoV-2, ale mają dodatnie wyniki wirusowego RNA ozna-czanego metodą RT-PCR przez długi czas po ustąpieniu ob-jawów [13]. W tej sytuacji WHO zaleca używanie testów oznaczających przeciwciała neutralizujące lub testów o udo-wodnionej ekwiwalentności [10]. Takie zalecenie może za-chęcić do dodatkowego, szerszego wykorzystywania testów serologicznych w obliczu rezygnacji przez Światową Organi-zację Zdrowia z obligatoryjnego wymogu dwukrotnego uzy-skania ujemnego wyniku badania molekularnego, na rzecz kryterium czasu od pojawienia się objawów połączonego z czasem po ich ustąpieniu. To ostatnie kryterium przyję-to także w Polsce, jest ono wynikiem dotychczasowych do-świadczeń dotyczących przebiegu objawowych zakażeń wy-wołanych wirusem SARS-CoV-2, jak również częściowo jest związane z niedoborem rynkowym odczynników do meto-dy RT-PCR. Państwa, w których te niedobory nie są dotkli-we, mogą stosować kryterium objawodotkli-we, nie wykluczając w pewnych sytuacjach kryteriów laboratoryjnych [5].

PODSUMOWANIE

Testy serologiczne, dzięki możliwości zróżnicowanego zastosowania, mogą być pomocne w opanowywaniu epide-mii zarówno w wymiarze zbiorowym – populacyjnym, jak i indywidualnym. Znajomość zalet i ograniczeń testów sero-logicznych umożliwi ich optymalne i racjonalne wykorzy-stanie w wielotestowej strategii zwalczania COVID-19.

KONFLIKT INTERESÓW: nie zgłoszono.

PIŚMIENNICTWO

1. Abramczuk E, Pancer K, Gut W, Litwińska B. Niepandemiczne koronawirusy człowieka – charakterystyka i diagnostyka. Post Mikrobiol 2017;56(2):205–213. 2. Adams E, Ainsworth M, Anand R et al. Antibody testing for COVID-19: a report

from the National COVID Scientiﬁc Advisory Panel. medRxiv 2020.

3. An EU programme of COVID-19 convalescent plasma collection and transfusion. Ref. Ares(2020)3256185. European Commission (online); https://ec.europa.eu/health/si-tes/health/ﬁles/blood_tissues_organs/docs/guidance_plasma_covid19_en.pdf 4. Bao L, Deng W, Gao H et al. Lack of reinfection in rhesus macaques infected

with SARS-CoV-2. bioRxiv 2020.

5. Centers for Disease Control and Prevention. Discontinuation of transmission-based precautions and disposition of patients with COVID-19 in healthcare settings (interim guidance). CDC (online) 2020; https://www.cdc.gov/corona-virus/2019-ncov/hcp/disposition-hospitalized-patients.html

6. Cheng MP, Yansouni CP, Basta NE et al. Serodiagnostics for severe acute respiratory syndrome-related coronavirus-2: a narrative review. Ann Intern Med 2020;M20-2854. 7. Convalescent Plasma Collection Program. Health.mil (online); https://health.

mil/Military-Health-Topics/Combat-Support/Public-Health/Coronavirus/CO-VID-19-Convalescent-Plasma-Collection-Program

(8)

(2019-nCoV) by real-time RT-PCR. Euro Surveill 2020;25(3):2000045. 9. COVID-19 Serology Surveillance Strategy. CDC (online) 2020; https://www.cdc.

gov/coronavirus/2019-ncov/covid-data/serology-surveillance/index.html 10. Criteria for releasing COVID-19 patients from isolation. Scientiﬁc Brief. WHO

(online) 2020; https://www.who.int/news-room/commentaries/detail/ criteria-for-releasing-covid-19-patients-from-isolation

11. Dijkman R, Jebbink MF, Gaunt E et al. The dominance of human coronavirus OC43 and NL63 infections in infants. J Clin Virol 2012;53(2):135–139. 12. EUA Authorized Serology Test Performance. Food and Drug Administration (online);

https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-disease-2019-covid-19-emergency-use-authorizations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance 13. European Centre for Disease Prevention and Control. Diagnostic testing and

screening for SARS-CoV-2. ECDC (online); https://www.ecdc.europa.eu/en/ covid-19/latest-evidence/diagnostic-testing

14. European Centre for Disease Prevention and Control. Immune responses and immunity to SARS-CoV-2. ECDC (online); https://www.ecdc.europa.eu/en/co-vid-19/latest-evidence/immune-responses

15. Flaxman S, Mishra S, Gandy A et al. Report 13 – estimating the number of infec-tions and the impact of non-pharmaceutical interveninfec-tions on COVID-19 in 11 European countries. Imperial College (online) 2020; https://www.imperial.ac.uk/ mrc-global-infectious-disease-analysis/covid-19/report-13-europe-npi-impact/ 16. Folegatti PM, Ewer KJ, Aley PK et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1

nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, sin-gle-blind, randomised controlled trial. Lancet 2020;396(10249):467–478. 17. Foundation for Innovative New Diagnostics. SARS-CoV-2 diagnostic pipeline.

FIND (online); https://www.ﬁnddx.org/covid19/pipeline/?avance=all&type=al-l&test_target=Antibody&status=all&section=immunoassays&action=default 18. Freeman B, Lester S, Mills L et al. Validation of a SARS-CoV-2 spike protein ELISA

for use in contact investigations and serosurveillance. bioRxiv 2020. 19. Havers FP, Reed C, Lim T et al. Seroprevalence of antibodies to SARS-CoV-2 in

10 sites in the United States, March 23-May 12, 2020. JAMA Intern Med 2020 [Epub ahead of print].

20. Interim Guidelines for COVID-19. Antibody testing in clinical and public health settings. CDC (online) 2020; https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/ lab/resources/antibody-tests-guidelines.html

21. Kadkhoda K. COVID-19: are neutralizing antibodies neutralizing enough? Transfusion 2020;60(6):1602–1603.

22. Kirkcaldy RD, King BA, Brooks JT. COVID-19 and postinfection immunity: limi-ted evidence, many remaining questions. JAMA 2020;323(22):2245–2246. 23. Korber B, Fischer WM, Gnanakaran S et al. Tracking changes in SARS-CoV-2

spike: evidence that D614G increases infectivity of the COVID-19 virus. Cell 2020;S0092-8674(20):30820–30825.

24. Lan L, Xu D, Ye G et al. Positive RT-PCR test results in patients recovered from COVID-19. JAMA 2020;323(15):1502–1503.

25. Lauer SA, Grantz KH, Bi Q et al. The Incubation period of coronavirus disease 2019 (COVID-19) from publicly reported conﬁrmed cases: estimation and ap-plication. Ann Intern Med 2020;172(9):577–582.

26. Lepiller Q, Barth H, Lefebvre F et al. High incidence but low burden of coronavi-ruses and preferential associations between respiratory vicoronavi-ruses. J Clin Microbiol 2013;51(9):3039–3046.

27. Lin Q, Zhu L, Ni Z, Meng H, You L. Duration of serum neutralizing antibodies for SARS-CoV-2: lessons from SARS-CoV infection. J Microbiol Immunol Infect 2020;53(5):821–822.

28. Lippi G, Simundic AM, Plebani M. Potential preanalytical and analytical vulne-rabilities in the laboratory diagnosis of coronavirus disease 2019 (COVID-19). Clin Chem Lab Med 2020;58(7):1070–1076.

29. Lipsitch M, Kahn R, Mina MJ. Antibody testing will enhance the power and ac-curacy of COVID-19-prevention trials. Nat Med 2020;26(6):818–819. 30. Liu L, Liu W, Zheng Y et al. A preliminary study on serological assay for severe

acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in 238 admitted ho-spital patients. Microbes Infect 2020;22(4–5):206–211.

31. Liu T, Wu S, Tao H et al. Prevalence of IgG antibodies to SARS-CoV-2 in Wu-han – implications for the ability to produce long-lasting protective antibo-dies against SARS-CoV-2. medRxiv 2020.

32. Liu W, Fontanet A, Zhang PH et al. Two-year prospective study of the humoral im-mune response of patients with severe acute respiratory syndrome. J Infect Dis 2006;193(6):792–795.

33. Loeﬀelholz MJ, Tang YW. Laboratory diagnosis of emerging human coronavi-rus infections – the state of the art. Emerg Microbes Infect 2020;9(1):747–756. 34. Long Q, Tang X, Shi Q et al. Clinical and immunological assessment of

asymp-tomatic SARS-CoV-2 infections. Nat Med 2020;26(8):1200–1204.

35. Lou B, Li TD, Zheng SF et al. Serology characteristics of SARS-CoV-2 infection since exposure and post symptom onset. Eur Respir J 2020;56(2):2000763.

COVID19 convalescent plasma donors. medRxiv 2020.

37. Montesinos I, Gruson D, Kabamba B et al. Evaluation of two automated and three rapid lateral ﬂow immunoassays for the detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies. J Clin Virol 2020;128:104413.

38. Mousavizadeh L, Ghasemi S. Genotype and phenotype of COVID-19: their ro-les in pathogenesis. J Microbiol Immunol Infect 2020 [Epub ahead of print]. 39. Ni L, Ye F, Cheng ML et al. Detection of SARS-CoV-2-speciﬁc humoral and cellular

immunity in COVID-19 convalescent individuals. Immunity 2020;52(6):971–977.e3. 40. NYC health, COVID-19 data, antibody testing by ZIP code of residence. NYC He-alth (online); https://www1.nyc.gov/site/doh/covid/covid-19-data-testing.page 41. OECD Policy Responses to Coronavirus (COVID-19). Testing for COVID-19:

a way to lift conﬁnement restrictions. OECD (online); https://www.oecd. org/coronavirus/policy-responses/testing-for-covid-19-a-way-to-lift-conﬁnement-restrictions-89756248/#section-d1e1080

42. Payne DC, Iblan I, Rha B et al. Persistence of antibodies against middle east respiratory syndrome coronavirus. Emerg Infect Dis 2016;22(10):1824–1826. 43. Pollán M, Pérez-Gómez B, Pastor-Barriuso R et al. Prevalence of SARS-CoV-2 in

Spain (ENE-COVID): a nationwide, population-based seroepidemiological stu-dy. Lancet 2020;396(10250):535–544.

44. Predictive Value calculator; http://tools.westgard.com/predictive.shtml 45. Rastawicki W, Rokosz-Chudziak N. Characteristics and assessment of the

use-fulness of serological tests in the diagnostic of infections caused by coronavi-rus SARS-CoV-2 on the basis of available manufacturer's data and literature re-view. Prz Epidemiol 2020;74(1):113–132.

46. Recommendations for Investigational COVID-19 Convalescent Plasma. US Food and Drug Administration (online) 2020; https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/investigational-new-drug-ind-or-device-exemption-ide-process-cber/recommendations-investigational-covid-19-convalescent-plasma 47. Robbiani DF, Gaebler C, Muecksch F et al. Convergent antibody responses to

SARS-CoV-2 in convalescent individuals. Nature 2020;584(7821):437–442. 48. Sekine T, Perez-Potti A, Rivera-Ballesteros O et al. Robust T cell immunity in

co-nvalescent individuals with asymptomatic or mild COVID-19. Cell 2020. 49. Seow J, Graham C, Merrick B et al. Longitudinal evaluation and decline of

anti-body responses in SARS-CoV-2 infection. medRxiv 2020.

50. Stringhini S, Wisniak A, Piumatti G et al. Seroprevalence of anti-SARS-CoV-2 IgG antibodies in Geneva, Switzerland (SEROCoV-POP): a population-based study. Lancet 2020;396(10247):313–319.

51. Tan CW, Chia WN, Qin X et al. A SARS-CoV-2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated blockage of ACE2-spike protein – protein inte-raction. Nat Biotechnol 2020;38(9):1073–1078.

52. The fully automated serology test to detect IgG antibodies against SARS-CoV-2; www.diasorin.com/en/immunodiagnostic-solutions/clinical-areas/infectious-diseases/covid-19

53. To KK, Tsang OT, Leung WS et al. Temporal proﬁles of viral load in posterior oropha-ryngeal saliva samples and serum antibody responses during infection by SARS- -CoV-2: an observational cohort study. Lancet Infect Dis 2020;20(5):565–574. 54. Transmission of SARS-CoV-2: implications for infection prevention

precau-tions. Scientiﬁc Brief 9, July 2020. World Health Organization (online) 2020; https://www.who.int/news-room/commentaries/detail/transmission-of-sars-cov-2-implications-for-infection-prevention-precautions

55. Udugama B, Kadhiresan P, Kozlowski et al. Diagnosing COVID-19: the disease and tools for detection. ACS Nano 2020;14(4):3822–3835.

56. Vespignani A, Tian H, Dye C et al. Modelling COVID-19. Nat Rev Phys 2020;2(6):279–281.

57. Wang W, Xu Y, Gao R et al. Detection of SARS-CoV-2 in diﬀerent types of clini-cal specimens. JAMA 2020;323(18):1843–1844.

58. Whitman JD, Hiatt J, Mowery CT et al. Test performance evaluation of SARS- -CoV-2 serological assays. medRxiv 2020.

59. Winichakoon P, Chaiwarith R, Liwsrisakun C et al. Negative nasopharyngeal and oro-pharyngeal swabs do not rule out COVID-19. J Clin Microbiol 2020;58(5):e00297-20. 60. Woloshin S, Patel N, Kesselheim AS. False negative tests for SARS-CoV-2

infec-tion – challenges and implicainfec-tions. N Engl J Med 2020;383(6):e38. 61. World Health Organization. ”Immunity passports” in the context of COVID-19:

scienti-ﬁc brief, 24 April 2020. WHO (online); https://apps.who.int/iris/handle/10665/331866 62. Wu F, Wang A, Liu M et al. Neutralizing antibody responses to SARS-CoV-2 in

a COVID-19 recovered patient cohort and their implications. medRxiv 2020. 63. Xia N, Wang G, Gong W. Serological test is an eﬃcient supplement of RNA

de-tection for conﬁrmation of SARS-CoV-2 infection. Preprints.org (online) 2020; https://www.preprints.org/manuscript/202003.0184/v1

64. Zhao J, Yuan Q, Wang H et al. Antibody responses to SARS-CoV-2 in patients of novel coronavirus disease 2019. Clin Infect Dis 2020;ciaa344 [Epb ahead of print]. 65. Zou L, Ruan F, Huang M et al. SARS-CoV-2 viral load in upper respiratory