K
osmos
PROBLEMY NAUK BIOLOGICZNYCH_____________ Polskie T ow arzystw o P rzyrod n ik ów im. Kopernika
Numer 2 (243) Strony 215-224
Bo ż e n a Ka m iń s k a
Pracownia Regulacji Transkrypcji, Zakład Biochemii Komórki, Instytut Biologii Doświadczalnej PAN im. M. Nenckiego Pasteura 3, 02-093 Warszawa
e-mail: bozenakk@nencki.gov.pl
MOLEKULARNE MECHANIZMY ŚMIERCI KOMÓREK NERWOWYCH
SMIERC KOMÓREK NERWOWYCH W PROCESACH NEURODEGENERACYJNYCH — APOPTOZA CZY NEKROZA?
Choroby neurodegeneracyjne (zwyrodnie niowe mózgu) są heterogenną grupą przewle kłych schorzeń o zróżnicowanym obrazie klini cznym i odmiennym podłożu (Ha r d y i Gw i n n- Ha r d y 1998). Niektóre z nich, na przykład cho
roby Alzheimera i Parkinsona, są wyraźnie sko relowane z wiekiem i mają cechy kliniczne po dobne do obrazu starzenia, przy czym różnice wydają się mieć charakter głównie ilościowy (Fr i e d m a n 1993). Cechą charakterystyczną
chorób neurodegeneracyjnych są zmiany mor fologii bądź zanik komórek nerwowych. Przez długi czas sądzono, że w poszczególnych scho rzeniach uszkadzane są określone typy komó rek nerwowych, co sugerowało selektywną wra żliwość komórek na czynniki uszkadzające. Stwierdzono bowiem, że w chorobie Parkinsona zanikają komórki istoty czarnej śródmózgowia, w chorobie Huntingtona komórki jądra, zaś w chorobie Alzheimera uszkodzenia komórek lokalizowane są w hipokampie i korze czołowej. W zaawansowanych stanach chorobowych nie zawsze mamy do czynienia ze zjawiskiem sele ktywności: u pacjentów z chorobą Alzheimera często rozwija się choroba Parkinsona, z kolei u osób z zaawansowaną chorobą Alzheimera, Parkinsona, czy stwardnieniem zanikowym bo cznym (ALS) pojawia się często demencja, której towarzyszą rozległe zmiany w korze mózgowej. Jest to świadectwem uogólnionej śmierci komó rek w mózgu.
Szereg danych wskazuje na to, że choć przy czyny pojawiania się chorób są bardzo różne,
podłoże zarówno przewlekłych chorób zwyrod nieniowych mózgu, jak też zmian neurodegene racyjnych wywołanych niedotlenieniem bądź epilepsją, może być podobne. We wszystkich wymienionych schorzeniach stwierdzono zanik komórek nerwowych spowodowany śmiercią o cechach apoptozy ( Th o m p s o n 1995, Ch a r r i a u t- Ma r l a n q u e i współaut. 1996).
Stwierdzenie, czy w danej sytuacji patologi cznej występuje aktywna czy też pasywna śmierć komórek ma niezwykle istotne znacze nie. Śmierć pasywna zwana nekrozą komórek ma szybki przebieg, wiąże się z całkowitym rozpadem komórki i wylaniem się jej zawartości na zewnątrz; w tej sytuacji nie ma wielkiej szansy na interwencje farmakologiczne. Jeżeli jednak komórki umierają aktywnie, w wyniku programowanej śmierci komórek (zwanej też apoptozą), proces śmierci komórkowej przebie ga znacznie wolniej, gdyż musi dojść do urucho mienia pewnego programu genetycznego i syn tezy lub aktywacji nowych enzymów, które wy konują „egzekucję”. Aktywna śmierć komórek przypomina lawinę, która raz uruchomiona to czy się początkowo wolno, a potem nabiera tempa stając się kataklizmem nie do zatrzyma nia. Do niedawno sądzono, że komórki nerwowe umierają biernie na drodze nekrozy. Obecnie wiadomo, że chorobom neurodegeneracyjnym towarzyszy indukcja programowanej śmierci komórek i to właśnie opóźniona śmierć komó rek nerwowych, może być odpowiedzialna za rozległe zmiany neurodegeneracyjne.
ksji. Przyczynił się do tego między innymi po stęp w tworzeniu genetycznie zmodyfikowanych zwierząt. Stwierdzono, że u myszy transgenicz- nych będących nosicielami określonych defe któw genetycznych, występują zmiany morfolo giczne i zanik komórek nerwowych, podobnie jak ma to miejsce w schorzeniach neurodegene- racyjnych (D a l C a n to i G u rn ey 1994, P r ic e i współaut. 1998). Tabela 1 przedstawia zesta wienie defektów genetycznych zidentyfikowa nych w chorobach zwyrodnieniowych mózgu u człowieka i u zwierząt genetycznie zmodyfiko wanych.
obrębie zaznaczonej sekwencji A(3 i uwalniają fragmenty białka. Zwykle ~90% wydzielanego A(3 występuje w formie rozpuszczalnego pepty- du A(340, a -10% jako słabo rozpuszczalne pep- tydy A(142 i A[343, łatwo tworzące agregaty i struktury włókienkowe. Peptydy A(342 i A(343 są neurotoksyczne i gromadzą się selektywnie w blaszkach starczych. Mutacje w genie APP, ta kie jak mutacja szwedzka, Hendriksa i niemie cka, powodują cięcie APP głównie na peptydy A(342 i Ap43 (Lan sb u ry 1997, P r ic e i współaut. 1998). Wyniki badań zwierząt transgenicznych z tego typu mutancjami w genie APP wskazują,
Tabela 1. Defekty genetyczne w dziedzicznych formach chorób neurodegeneracyjnych.
Choroba Gen Patologia Zwierzę transgen
ch. Alzheimera APP * złogi amyloidu (A) złogi amyloidu (A)
blaszki neurofibrylarne blaszki neurofibrylarne
(NT) (NT)
Presenilina 1,2* A + NT A + NT
ch. Parkinsona a-synukleina* ciałka Lewiego brak danych
stwardnienie Dysmutaza ciałka Lewiego zaburzenia neuronów
zanikowe boczne ponadtlenkowa* ruchowych, złogi,
zanik komórek
ch. Huntingtona Huntingtina** złogi jądrowe zaburzenia ruchowe,
zanik komórek, złogi
Ataksja móżdżkowo- Ataksyna 1** złogi jądrowe ataksja, złogi jądrowe,
rdzeniowa (SCA1) zanik komórek,
Ataksja móżdżkowo- Ataksyna 3** złogi jądrowe ataksja, atrofia
rdzeniowa (SCA3) móżdżku
♦Oznaczono mutacje typu missense, zmieniające sens odczytu; ** oznaczono mutacje trzynukleotydowych powtórzeń kodujących glutaminę (ang. CAG repeats)
Wyniki badań choroby Alzheimera wskazu ją, że pierwotną przyczyną zwyrodnienia neuro nów może być powstawanie złogów ^-amyloidu (A(3) i wtórne procesy neurodegeneracyjne na skutek neurotoksyczności A(3 (B a rc ik o w s k a
1998). (3-amyloid o długości 42-43 aminokwa sów jest fragmentem większego białka prekur- sorowego (f-amyloidu (APP, ang. amyloid prę
żę w ich mózgach gromadzą się szybko złogi A(3, powstają blaszki starcze, a neurony degeneru ją. Podobne zmiany neurodegeneracyjne
stwierdzono w mózgach myszy z defektami w genach kodujących presenilinę 1 i 2 oraz apo- poliproteinę E (ApoE). Preseniliny są białkami błonowymi, których funkcja nie jeszcze dobrze poznana. Prawdopodobnie biorą udział w ob
Ryc. 1. Schemat obróbki białka prekursorowego (3-amyloidu (APP).
róbce APP oraz w regulacji homeostazy wapnio wej w komórce (P r ic e i współaut. 1998). Eks presja zmutowanych wariantów presenilin w komórkach zwiększała powstawanie neuroto- ksycznych form A(3. Apopoliproteina E jest głównym białkiem w surowicy krwi zaangażo wanym w transport i metabolizm cholesterolu. Nie wiadomo dokładnie, jaka jest rola ApoE w regulacji obróbki APP. Postuluje się, że białko ApoE może regulować agregację wydzielanego Ap lub usuwanie agregatów (P r ic e i współaut.
1998).
Około 10% przypadków stwardnienia zani kowego bocznego (ALS) ma charakter dziedzicz ny i w grupie tej często wykrywa się mutacje w genie kodującym dysmutazę ponadtlenkową (SOD) (W on g i B o r c h e l t 1995). Jest to enzym, który eliminuje groźne dla komórki wolne rod niki tlenowe. Defekty tego enzymu powodują wzrost poziomu wolnych rodników, co uszka
dza zwłaszcza funkcje mitochondriów. U myszy transgenicznych ze zmutowanym genem SOD dochodzi do degeneracji neuronów ruchowych, której towarzyszą zaburzenia cytoszkieletu ko
mórek i ich wakuolizacja (G u rn ey 1994, W o n g
i B o r c h e l t 1995, W o n g i współaut. 1997). W chorobie Huntingtona i kilku zespołach ataksji rdzeniowo-móżdżkowych stwierdza się degenerację komórek nerwowych w określo nych strukturach mózgu. Wspomnianym cho robom towarzyszy obecność agregatów zawiera jących białka o zaburzonej strukturze (ang. mi-
sfolded) oraz ubikwitynę. Zwykle agregaty bia łek występują w jądrze komórkowym uszkodzo nych neuronów. Przyczyną takich zmian są defekty genetyczne polegające na powieleniu trójki nukleotydów CAG kodujących glutaminę
(K lo c k g e t h e r i E v e r t 1998). Na przykładzie zwierząt transgenicznych wykazano, że poja wienie się wielokrotnych powtórzeń glutaminy w białku huntingtina sprawia, że białko to na gromadza się w cytoplazmie i jądrze komórko wym w formie agregatów (inkluzji) z białkiem ubikwityny. Podobne jądrowe agregaty obser wowano w tkankach pacjentów z chorobą Hun tingtona i różnymi zespołami ataksji (K o sh y i
Z o g h b i 1997). Sugeruje się, że zmutowane biał ka lub ich agregaty mogą być toksyczne dla komórek nerwowych (P r ic e i współaut. 1998).
EKSCYTOTOKSYCZNOŚĆ A METABOLIZM ENERGETYCZNY W KOMÓRKACH NERWOWYCH
GLUTAMINIAN JAKO INDUKTOR APOPTOZY
Glutaminian jest głównym neuroprzekaźni kiem w centralnym układzie nerwowym, pobu
dzającym neurony za pośrednictwem specyficz
nych receptorów. W 1969 roku O ln e y przedsta
wił dane świadczące o cytotoksycznym działa niu glutaminianu (GLU). Powstała wówczas hi poteza ekscytoksyczności wiążąca degenerację
rek nerwowych dochodzi do wypływu ich zawar tości do otoczenia oraz uwolnienia zmagazy nowanego w pęcherzykach synaptycznych ami nokwasów pobudzających glutaminianu i aspa- raginianu. Stwierdzono, że nadmierna stymu lacja receptorów GLU może prowadzić do śmier ci dalszych komórek na zasadzie reakcji łańcu chowej . Wzrost ilości neuroprzekaźnika i w kon- sekwencji nadmierne pobudzenie receptora GLU prowadzi do napływu jonów wapnia i akty wacji syntazy tlenku azotu (NO) oraz aktywacji
fosfolipazy A2 w komórkach nerwowych (Ryc 2).
Pobudzenie fosfolipazy A2 powoduje powstanie
między innymi wolnych rodników tlenowych, które uszkadzają funkcje mitochondriów, a zwłaszcza zaburzają działanie łańcucha odde
wych i dalszy napływ jonów wapnia do komó rek. W badaniach przeprowadzonych na neuro nach hodowanych in vitro wykazano, że w za leżności od stopnia pobudzenia komórek przez glutaminian może dojść do nekrozy lub apopto- zy (An k a r c r o n ai współaut. 1995). W przypadku
drastycznego pobudzenia receptorów NMDA dochodzi do napływu jonów wapnia, czemu to warzyszy napływ jonów sodowych i chlorko wych. To pociąga za sobą napływ wody, pęcz nienie i lizę komórek. Śmierć ma wówczas cha rakter nekrotyczny i powoduje tworzenie ogni ska zapalnego i liczne wtórne uszkodzenia ko mórek. Jeżeli bodziec negatywny był słabszy i nie dochodzi do tak drastycznego zaburzenia metabolizmu energetycznego, podwyższenie
Ryc. 2. Postulowany mechanizm ekscytotoksyczności.
Nadmierna stymulacja receptorów NMDA przez glutaminian prowadzi do napływu jonów wapnia i aktywacji syntazy tlenku
azotu (NO) i fosfolipazy A2. Powoduje to powstanie wolnych rodników tlenowych, które uszkadzają funkcje mitochondriów.
Powstający równolegle NO tworzy z tlenem toksyczne pochodne, które także upośledzają metabolizm energetyczny mitochondriów. NO może też oddziaływać na komórkę presynaptyczną i pobudzać uwalnianie glutaminianu.
poziomu wapnia w cy to plazmie indukuje proces programowanej śmierci komórek. Dochodzi wówczas do aktywacji swoistych endonukleaz (enzymów degradujących DNA) oraz proteaz (enzymów degradujących białka), których wspólne działanie powoduje fragmentację jąder komórkowych i całych komórek (S c h w a r tz i
M illig a n 1996, S t e l l e r 1995). Fragmenty ko mórki pozostają otoczone błoną, dzięki czemu nie dochodzi do uszkadzania komórek sąsiadu jących i powstania reakcji zapalnej (L e is t i Nl-
COTERA 1998).
W ten sposób stopień zaburzenia metabo lizmu energetycznego w wyniku nadmiernego pobudzenia komórek przez GLU determinuje stopień i sposób śmierci komórek nerwowych. Niezależnie od tego, czy komórki nerwowe umie rają na drodze nekrozy lub apoptozy, konse kwencją jest zanik komórek nerwowych i zabu rzenie funkcjonowania mózgu. Badania in vitro nad śmiercią neuronów pod wpływem GLU do wodzą, że wstępny etap obu procesów może być podobny, a rodzaj śmierci zależy od dawki GLU i od stopnia zaburzenia metabolizmu energety cznego. Jeżeli dochodzi do trwałego zahamowa nia funkcji mitochondriów, w konsekwencji ko mórka umiera na drodze nekrozy. Jeżeli komór ki powracają do stanu równowagi energetycz nej, dochodzi do indukcji swoistego programu apoptozy: aktywacji endonukleaz i swoistych proteaz (A n k a rc ro n a i współaut. 1995, B o n fo -
co i współaut. 1995).
ROLA MITOCHONDRIÓW w AKTYWACJI KASKADY KASPAZ
Mitochondria wydają się pełnić istotną rolę w regulacji apoptozy (K r o e m e r 1997, E l l e r b y i współaut. 1997, G r e e n i R e e d 1998). Jedną z najwcześniej obserwowanych zmian zachodzą cych w mitochondriach po stymulacji komórek do śmierci, jest spadek potencjału A\j/m na we wnętrznej błonie mitochondrialnej. Następuje on na długo przedtem zanim pojawi się frag- mentacja DNA i wszystkie morfologiczne zmia ny wyróżniające komórkę apoptotyczną. Uważa się, że krótkotrwały spadek potencjału nieod wracalnie prowadzi do apoptozy (G re e n i R e e d
1998).
Przepływ elektronów w łańcuchu oddecho wym powoduje wypompowanie protonów z ma- triks mitochondrialnej i prowadzi do tworzenia się potencjału błonowego, który stanowi siłę napędową do syntezy ATP. Wewnętrzna błona mitochondrialna jest w normalnych warunkach nieprzepuszczalna dla jonów. Uprzepuszczal- nienie błony powoduje spadek potencjału bło nowego A\|/m. Przyczyn tego zjawiska upatruje się w otwarciu megakanału (ang. PT pore, per
meability transition pore). Megakanał jest kom pleksem białek, na który składa się: transloka- za nukleotydów adeninowych (AdNT), poryna zewnętrznej błony mitochondrialnej oraz inne białka (Z o r a t t i i S za b o 1995). Konsekwencją otwarcia megakanału jest przerwanie łańcucha oddechowego, zaprzestanie syntezy ATP, wy pływ jonów wapnia, uwolnienie zapasów zre
dukowanego glutationu i NAD(P)H2. Ponadto,
otwarcie megakanału umożliwia swobodny wy pływ z przestrzeni międzybłonowej mitochon driów białek, które w normalnych warunkach nie mają możliwości znalezienia się na terenie cytoplazmy ( S c a r l e t t i M u rph y 1997, G r e e n i
R e e d 1998, Kamińska i S ta ń c zy k 1998). Opisano dwa białka uwalniane przez mito chondria w trakcie otwarcia megakanału i bę dące induktorami apoptozy— AIF (ang. apopto- sis inducing factor) i cytochrom c (Liu i współ aut. 1996, Li i współaut. 1997). Białko AIF (czynnik indukujący apoptozę) jest uwalniane przez mitochondria komórek apoptycznych i wywołuje fragmentację DNA w izolowanych ją drach komórkowych w czasie krótszym niż 15 minut (K r o e m e r 1997). AIF jest flawoproteiną, która przemieszcza się z mitochondriów do ją dra komórkowego po indukcji apoptozy i bezpo średnio powoduje zmiany chromatyny oraz cię
cie DNA na duże fragmenty (Suzin i współaut.
1999). Działanie AIF na chromatynę jest nieza leżne od aktywacji kaspaz. Obok AIF uwalniany jest z mitochondriów cytochrom c — białko będące jednym ze składników łańcucha odde chowego. Li i współautorzy (1997) wykazali udział cytochromu c w aktywacji kaskady ka spaz (zob. niżej), która prowadzi do fragmentacji DNA i śmierci komórki. Potencjalny przebieg zdarzeń polega na tym, że cytochrom c, uwal niany przez mitochondria komórek pobudzonych do apoptozy, wiąże się z białkiem Apaf 1 zmienia jąc jego konformację. Następnie w procesie zależ nym od dATP powstaje kompleks białka Apaf-1 z kaspazą 9. Powstanie kompleksu cyt.c/ Apafl/kaspaza9 pozwala na indukcję proteolity
cznych właściwości kaspazy 9, która aktywuje kaspazę 3 i prowadzi do fragmentacji DNA i hy drolizy białek (Li i współaut. 1997).
Inne hipotezy na temat udziału mitochon driów w procesie apoptozy dotyczą sposobu uwalniania przez mitochondria cytochromu c
(R e ed 1997). Jedna z nich zakłada udział w tym procesie innego kanału, tworzonego przez biał ko Bax (białko z rodziny Bcl-2) w zewnętrznej błonie mitochondrialnej (Van d e r H eid en i współaut. 1997). Uwolnienie cytochromu c w takich warunkach nie wiązałoby się ze spad kiem potencjału na wewnętrznej błonie mito chondrialnej.
PROTEAZY ZAANGAŻOWANE W APOPTOZĘ I ICH SUBSTRATY
Czynniki indukujące apoptozę prowadzą do aktywacji białek z rodziny proteaz cysterno wych, zwanych kaspazami (Sc h w a r t z i Mi l l i
g a n 1996, Al n e m r i 1997). Nazwa pochodząca
od ang. caspases (cysteine aspases) określa ich właściwości, gdyż są to proteazy cysteinowe trawiące białka swoiście obok reszty kwasu asparaginowego. Proteazy z rodziny ICE wystę pują w komórkach w formie nieaktywnych pro- enzymów, które ulegają aktywacji proteolitycz nej przez proteazy z tej samej rodziny bądź na drodze autokatalitycznej proteolizy. Mogą też aktywować inne proteazy włączając kaskadę sekwencyjnie uruchamianych proteaz (Ryc. 3). Aktywne kaspazy uczestniczą w degradacji sze regu białek takich jak: polimeraza poli[ADP-ry- bozy] (PARP), kinazy białkowe PAK, FAK, białko
retinoblastoma-RB, laminy jądrowe (Or t h i
współaut. 1996 a, b), zależna od DNA kinaza białkową i duża podjednostka replisomu (Ubę
do powstania ich stale aktywnych form i zabu rzonej fosforylacji białek komórkowych. Wydaje się, że prowadzi to do procesów takich jak fał dowanie się błon komórkowych (ang. membra ne blebbing), cofanie się wypustek i rozpad połączeń międzykomórkowych, które należą do pierwszych objawów apoptozy (Ru d e l i Bo k o c h
1997, Le v k a u i współaut. 1998). Z kolei degra dacja aktyny i lamin jądrowych przez kaspazy, występująca na wczesnym etapie apoptozy, bądź bezpośrednie działanie kaspaz, może akty wować endonukleazę, która uczestniczy we fragmentacji jądrowego DNA na fragmenty wiel
kości nukleosomu i jego wielokrotności (Ub e d a
i Ha b e n e r 1997, Ta n g i Ki d d 1998).
Wraz z pojawieniem się syntetycznych pep- tydów hamujących specyficzne proteazy możli wa stała się identyfikacja swoistych dla danego procesu proteaz. Proteazy z rodziny ICE uczest niczą w apoptozie motoneuronów w czasie roz woju rdzenia kręgowego kurczęcia (Sc h w a r t z i
Mi l l i g a n 1996), z kolei proteaza CPP-32 (kaspa-
za 3) odgrywa ważną rolę w śmierci komórek
Ryc. 3 Mechanizm aktywacji kaskady kaspaz.
Połączenie się trimerów liganda Fas (FasL) lub TNF ze swoistym receptorem wywołuje agregację cząsteczek receptorów i ich łącze nie się z białkami adapterowymi FADD (ang. Fas associated death domains) lub TRADD (ang. TNF receptor associated death doma ins). W wyniku tego dochodzi do aktywacji kaspazy Mch5 (kaspazy 8), która aktywuje kaskadę kaspaz: ICE i CPP32 (kaspaza 3) degradujących liczne substraty komórkowe.
ziarnistych móżdżku indukowanej przez usu nięcie z pożywki surowicy i jonów potasu (E ld a- dah i współaut. 1997), a obie grupy proteaz uczestniczą w uśmiercaniu oligodendrocytów
przez TNF-czynnik nekrozy nowotworu (Hisaha-
r a i współaut. 1997). Oprócz proteaz z rodziny ICE i CPP-32, także inne proteazy, takie jak kalpainy, mogą odgrywać istotną rolę w apopto- zie komórek nerwowych. Kalpainy są enzymami proteolitycznymi występującymi w cytoplazmie komórek w formie nieaktywnej i ulegają akty
wacji po znacznym wzroście stężenia wapnia. Wśród substratów kalpain wymienia się szereg białek cytoszkieletalnych i błonowych oraz biał ka regulatorowe takie jak kinaza C, fosfolipaza
C, receptor rianodynowy i N M D A . Znaczny
wzrost aktywności kalpain towarzyszy zmia nom neurodegeneracyjnym w ischemii. Poda wanie inhibitorów kalpain hamuje śmierć neu
ronów i ogranicza uszkodzenia mózgu (B a rtu ś
i współaut. 1995).
„WŁĄCZANIE” PROGRAMU APOPTOZY PRZEZ CZYNNIK TRANSKRYPCYJNY AP-1 JAKO PRZYCZYNA OPÓŹNIONEJ ŚMIERCI KOMÓREK NERWOWYCH
Zgodnie z przyjętym poglądem, w zjawi skach ekscytotoksyczności takich jak ischemia śmierć neuronów spowodowana jest przedłużo nym i nadmiernym pobudzeniem receptorów GLU. Jednakże podwyższony poziom GLU utrzymuje się przez kilka-kilkanaście godzin, gdy tymczasem neurony umierają często tygo dnie lub miesiące od momentu zadziałania bodźca (D a va lo s i współaut. 1997). Zjawisko opóźnionej i długotrwałej śmierci neuronów może prawdopodobnie wyjaśnić hipoteza o „włączeniu” nowego programu genetycznego, który odpowiada za śmierć apoptotyczną i prze programowanie funkcji komórek.
Programowana śmierć komórek, zgodnie z przyjętymi kryteriami, jest procesem wymaga jącym syntezy nowych białek i aktywacji genów. W większości przypadków obserwuje się opóźnienie lub znaczne zahamowanie samobój czej śmierci komórek przez inhibitory biosynte zy RNA lub białek. Wśród zidentyfikowanych do tej pory białek pełniących funkcję regulacyjną w procesie programowanej śmierci są także
czynniki transkrypcyjne (Evan i współaut.
1992, E stu s i współaut. 1994, Ham i współaut. 1995). Indukowalne czynniki transkrypcyjne to białka pojawiające się w komórkach tylko w określonych sytuacjach, wiążące się w obsza rach regulatorowych swoistych genów i uru chamiające syntezę konkretnego mRNA. Szereg danych wskazuje, że jednym z czynników regu lujących proces apoptozy jest kompleks trans- krypcyjny AP-1 (ang. activator protein-1). W skład kompleksu wchodzą białka należące do rodziny Fos i Jun. Rola kompleksu AP-1 polega na stymulacji programu genetycznego dosto sowującego komórkę do określonej sytuacji fi zjologicznej w odpowiedzi na bodźce zewną- trzkomórkowe. Prowadząc badania nad mecha nizmem aktywacji genomu podczas pobudzenia komórek nerwowych przez kainian stwierdzili śmy, że w mózgu zwierząt dochodziło do poja
wiania się kompleksu AP-1 w kilka godzin po wywołaniu drgawek i po przejściowym zaniku kompleksu, nagromadzał się on ponownie w kilka dni później (Kamińska i współaut. 1994). Ponadto wykazaliśmy, że drgawki indukowane przez kainian wywołują śmierć komórek nerwo
wych na drodze apoptozy (F ilipkow ski i współ
aut. 1994). Tak więc indukcję kompleksu AP-1 można było powiazać z zainicjowaniem apopto- tycznej śmierci komórek nerwowych. W zrozu mieniu roli czynnika AP-1 w apoptozie znacznie przeszkadzał fakt, że wielokrotnie wykazaliśmy jego indukcję w korze mózgowej w procesach niezwiązanych ze śmiercią komórek: w rozwoju kory mózgowej oraz po pobudzeniu sensorycz
nym przez bodziec wzrokowy (Kamińska i współ
aut. 1995, 1996). Rozwiązanie przyniosły do piero wyniki badań nad składem białkowym czynnika AP-1 i jego zdolnością do aktywowania transkrypcji.
Wyniki naszych dalszych badań sugerują, że w trakcie apoptozy komórek glejaka dochodzi do aktywacji kinaz JNK (ang. c-Jun N-terminal kinases). Indukcja kinaz z tej rodziny prowadzi do nagromadzanie się w komórkach umierają cych ufosforylowanych białek c-Jun i ATF-2. Pojawienie się tak nietypowego kompleksu sprawia, że kompleks AP-1 ma zmienioną zdol ność do regulacji transkrypcji różnych genów, między innymi zyskuje zdolność do aktywowa nia ekspresji genu JasL (ang. fas ligand) (Ryc. 4). Białko FasL należy do rodziny białek TNF (czynnik nekrozy nowotworu) i podobnie jak TNF jest czynnikiem indukującym apoptozę w wielu typach komórek mających na swojej powierzchni receptor, białko Fas (zwane też CD95, APO). Białko Fas w części cytoplazmaty- cznej ma domeny zwane „death domains”, które są odpowiedzialne za wiązanie białek adaptero wych uruchamiających proces śmierci. Wiąza nie się FasL występującego jako trimer, indu kuje trimeryzację błonowych białek Fas, co z
kolei pobudza białka adaptorowe FADD (ang. Fas Associated Death Domain) i aktywuje ka-
spazę 8. Aktywacja tej kaspazy uruchamia ka
skadę proteaz z rodziny ICE, które degradują różne substraty komórkowe. Ostatnio wykaza no, że w trzech modelach apoptozy komórek nerwowych nadmierna i przedłużona aktywacja kinaz JNK powoduje wzrost ekspresji FasL i jego receptora białka Fas w umierających ko
mórkach (L e -N ik o le s c u i współaut. 1999). Wyniki badań przebiegu śmierci komórek nerwowych po usunięciu czynnika wzrostu ner wu (NGF), potwierdzają bezpośrednio rolę bia łek c-Jun i kompleksu AJP-1 oraz kinaz JNK w
apoptozie komórek nerwowych (Kamińska i Py-
rzyń ska 1999). Jeżeli metodami inżynierii gene tycznej wyłączy się w tych komórkach czynnik AP-1 w trakcie procesu apoptozy (poprzez wpro wadzenie dominującego negatywnego mutanta
Ryc. 4. Aktywacja kinaz JNK i p38 w proce sach apoptozy. Udokumentowane szlaki akty wacji kinaz i ich potencjalne substraty w komórkach oraz rola w indukcji ekspresji FasL.
c-Jun) nie dochodzi do śmierci komórek nerwo wych (E stu s i współaut. 1994, Ham i współaut. 1995). Aktywacja czynnika AP-1, a zwłaszcza akumulacja w komórkach apoptotycznych biał ka c-Jun, nie jest zjawiskiem ograniczonym do wymienionych sytuacji modelowych, towarzy szy również śmierci komórek nerwowych po niedokrwieniu mózgu, w chorobie Alzheimera i Huntingtona (A n d e rs o n i współaut. 1996, D ra- g u n o w i współaut. 1993, D ra g u n o w i Preston
1995). Stwierdzono, że w niektórych stanach patologicznych ekspresja białka c-Jun i jego ufosforylowanej formy koreluje z podwyższoną ekspresją białka FasL (H e r d e g e n i współaut.
1998). Wyniki te wskazują, że procesy śmierci komórek in vitro odzwierciedlają procesy i me chanizmy molekularne leżące u podstaw śmier ci komórek nerwowych w mózgu.
PODSUMOWANIE
Poznanie molekularnego podłoża zjawisk neurodegeneracyjnych jest niezbędnym warun kiem podejmowania działań prewencyjnych bądź leczniczych. Fakt, że apoptoza, w przeciw ieństwie do nekrozy, jest procesem czasochłon nym, wymagającym często ekpresji nowych ge nów i białek, stwarza szereg możliwości tera peutycznych. Chociaż nie we wszystkich scho rzeniach neurodegeneracyjnych śmierć komó rek ma charakter wyłącznie apoptotyczny, wię kszość badaczy zgadza się, że właśnie ten pro ces ma znaczenie dominujące w zjawiskach ekscytotoksyczności oraz chorobach Alzheime
ra, Parkinsona, stwardnieniu rozsianym bocz nym, demencjach skojarzonych z AIDS i być może w starzeniu mózgu. Choroby neurodege neracyjne są heterogenną grupą przewlekłych schorzeń, których występowanie zwiększa się wraz z postępującym wydłużaniem długości ży cia społeczeństwa. Niektóre z tych chorób, na przykład chorobę Alzheimera, wykrywa się u 5 do 10% ludzi powyżej 65 roku życia i przewi duje się, że liczba chorych może się jeszcze zwiększać. Niektórzy badacze postrzegają cho robę Alzheimera jako chorobę przyśpieszonego starzenia mózgu i mają nadzieję, że zbadanie
patogenezy tej choroby pozwoli lepiej zrozumieć procesy starzenia się komórek w mózgu.
Wydaje się, że już wkrótce poznanie mole kularnego podłoża i przebiegu apoptozy, przy czyni się do opracowania skutecznych terapii blokujących śmierć komórek, zwłaszcza w zja wiskach związanych z ekscytotoksycznością. Podejmuje się próby protekcji komórek nerwo wych przed śmiercią przez stosowanie blokerów
uwalniania GLU, blokerów receptorów NMDA i kanałów wapniowych. Doświadczalnie testuje się substancje blokujące powstawanie wolnych rodników tlenowych. Zidentyfikowano kilka białek wirusowych, które są naturalnymi inhi bitorami proteaz apoptotycznych z grupy ICE i obecnie przeprowadzane są próby ich wykorzy stania w blokowaniu apoptozy.
MOLECULAR MECHANISMS OF NEURONAL CELL DEATH S u m m a ry
Loss of the nervous system cells from the adult brain underlies the pathology of many neurodegenerative dis eases. The question whether programmed cell death, i.e. apoptosis, underlies those processes is discussed. Some of the genetic causes of many of the primary neurodegenera tive diseases are known. These diseases have many patho logical mechanisms in common, but only a few pathways leading to neuronal death have been described. Specific death mechanisms based on unique neuronal features such as excitability and the occurrence of specific channels and
enzymes, have been unraveled in the brain. While multiple signals can initiate cell death, such as the removal of essential growth factors or damage by endogenous or exogenous toxins, the mechanisms of execution of cell death have a lot in common. Evolutionary conserved mech anisms involving proteases, Bcl-2-related proteins, and mitochondrial factors participate in the modulation and execution of cell death. The possible involvement of some nuclear proteins in regulation o f the apoptosis related genes is discussed.
LITERATURA Ad a m sJ. M., Co r yS., 1998. The Bcl-2 proteinfamily: arbiters
o f cell survival. Science 281, 1322-1325.
Al n e m r i E. S., 1997. Mammalian cell death proteases: a
fam ily o f highly conserved aspartate specific cysteine proteases. J. Cell. Biochem. 64, 33-42 .
An d e r s o n A . J., SuJ. H ., Co t m a n C . W ., 1996. DNA damage
and apoptosis in Alzheimer’s disease: colocalization with c-Jun immunoreactivity, relationship to brain area, and effect o f postmortem delay. J. Neurosci. 16, 1710-
1719.
An k a r c r o n aM., Dy p b u k tJ. M., Bo n f o c oE., Zh iv o t o v s k yB.,
Or r e n iu sS., Lip t o nS. A., Ni c o t e r aP., 1995. Glutamate-
induced neuronal cell death: A succession o f necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. Neuron
15, 961-973.
As h k e n a z i A ., Dix itV. M., 1998. Death receptors: signaling
and modulation. Science 281, 1305-1308.
Ba r c ik o w s k a M., 1998. Choroba Alzheimera ja k o przykład
schorzenia neurodeqeneracyjneqo. Post. Biol. Kom. 25
(Suppi.), 5-14.
Ba r t u ś R. T ., El l io t t P. J., Ha y w a r d N. J., De a n R. L ., Ha r b e s o n S., St r a u bJ. A., L i Z., Po w e r s J. C . , 1995.
Calpain as a novel target fo r treating acute neurode generative disorders. Neurol. Res. 17, 249-258.
Bo n f o c o E., An k a r c r o n aM., Nic o t e r aP., Lip t o n S. A ., 1995.
Apoptosis and necrosis: Two distinct events induced respectively by mild and intense insults with NMDA or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures. Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 162-973.
Br ic e A ., 1998. Unstable mutations and neurodegenerative
disorders. J. Neurol. 245, 505-510.
Ch a r r l a u t- Ma r l a n q u e C ., Ag g o u n-Zo u a o u i D ., Re p r e s a A ., B e n - A r i Y., 1996. Apoptotic features o f selective neuro
nal death in ischemia, epilepsy and g p l2 0 toxicity.
T r e n d s N e u r o s c i. 19, 109-114.
Da l Ca n t o M . C ., Gu r n e yM . E ., 1994. Development o f central
nervous system pathology in a murine transgenic model o f human amyotrophic lateral sclerosis. Am. J. Pathol.
145, 1271-1279.
Da v a l o sA ., Ca s t il l o J., Se r e n aJ., No y aM ., 1997. Duration
o f glutamate release after acute ischemic stroke. Stroke
28, 708-710.
Dr a g u n o w M., Pr e s t o nK., 1995. The role o f inducible tran-
scriptionf actors in apoptotic nerve cell death. Brain Res.
Rev. 21, 1-28.
Dr a g u n o w M., Yo u n g D., Hu g h e s w D., MacGibbon G., La w-
l o r P., Sin g l e t o n K., Sir im a n n e E., Be il h a r z E., Gl u c a n
P., 1993. Is c-Jun involved in nerve cell death following
status epilepticus and hypoxic-ischemic brain injury?
Mol. Brain Res. 18, 347-52.
El d a d a hB. A ., Ya c o v l e vA . G ., Fa d e n A . I., 1997. The role o f
CED-3-related cysteine proteases in apoptosis o f cere bellar granule cells. J. Neurosci. 17, 6105-6113.
El l e r b y H. M., Ma r t i n S . J., El l e r b y L. M., Naiem S . S, Ra b iz a d e h S ., Sa l v e s e n G . S ., Ca s ia n o C . A ., Ca s h m a nN.
R., Gr e e n D. R, Br e d e s e n D. E. , 1997. Establishment
o f a cell-free system o f neuronal apoptosis: comparison o f premitochondrial, mitochondrial, and postmitochon- drial phases. J. Neurosci. 17, 6165-6178.
Es t u s S ., Za k sW. J., Fr e e m a n R. S ., Gr u d a M., Br a v o R.,
Jo h n s o n E. M., 1994. Altered gene expression in neu
rons during programmed cell death: identification o f c-jun as necessary fo r neuronal apoptosis. J. Biol.
Chem. 127, 1717-27.
Fil ip k o w s k i R. K., He t m a n M., Ka m iń s k a B., Ka c z m a r e k L.
1994 DNA fragmentation in rat brain after intraperito-
neal administration ofkainate. NeuroReport 5, 1538-
1540.
Fr ie d m a n A ., 1993. Choroba Parkinsona — fakty, opinie,
hipotezy. Kosmos 42, 487-494.
Gr e e n D. R., Re e dJ. C., 1998. Mitochondria and apoptosis. Science 281, 1309-1311.
Gu r n e y M. E., 1994. Transgenic-mouse model o f amyotro
phic lateral sclerosis. N . Engl. J. Med. 331, 1721-1722.
Ha m J., Ba b ij C., Wh it f ie l d J., Pf a r r C. M., La l l e m a n d D.,
Ya n i v M., Ru b in L . L ., 1995. A c-Jun dominant negative mutant protects sympathetic neurons against pro grammed cell death Neuron 14, 927-39.
m a r e k L ., 1995. Elevated AP-1 transcription factor DNA
binding activity at the onset o f functional plasticity during development o f rat sensory cortical areas. Mol.
Brain Res. 33, 295-304.
Ka m iń s k a B., Ka c z m a r e k L., Ch a u d h u r i A., 1996. Visual
stimulation regulates the expression o f transcription factors and modulates the composition o f AP-1 in rat
visual cortex. J. Neurosci. 16, 3968-3978.
Ka m iń s k a B., St a ń c z y k M., 1998. Molekularne mechanizmy
neurodegeneracji. Post. Biol. Kom. 25 (Suppl.), 15-28.
Ka m iń s k a B ., Py r z y ń s k a B ., 1999. Rola kinaz MAP i induko-
walnych czynników transkrypcyjnych w regulacji pro liferacja śmierci komórek. Post. Hig. Med. Doświadczał,
(w druku).
Kl o c k g e t h e rT., Ev e r tB., 1998. Genes involved in hered
itary ataxias. Trends Neurosci. 21, 413-418.
Kl u c k R . M ., Bo s s y- We t z e l E ., Gr e e n D. R ., Ne w m e y e r D.
D., 1997. The release ofcytochrome cfrom mitochondria:
a primary site fo r Bcl-2 regulation o f apoptosis. Science
275, 1132-1136.
Ko s h y B. T., Zo g h b i H. Y., 1997. The CAG/polyglutamine
tract diseases: gene products and molecular pathogen esis. Brain Pathol. 7, 927-942.
Kr o e m e r G., 1997. The proto-oncogene Bcl-2 and its role in
regulating apoptosis. Nat. Med. 3, 614-620.
La n s b u r y P. T. Jr, 1997. Structural neurology: are seeds at
the root o f neuronal degeneration? Neuron 19, 1151—
1154.
Leis t M., Nic o t e r a P., 1998. Apoptosis, excitotoxicity, and
neuropathology. Exp. Cell Res. 239, 183-201.
Le- Nic il e s c uH., Bo n f o c oE., Ka s u y aY., Cl a r e tF. -X, Gr e e n
D. R., Ka r in M., 1999. Withdrawal o f survival factors
results in activation o f the JNK pathway in neuronal cells leading to Fas ligand induction and cell death Mol. Cell.
Biol. 19, 751-763.
Le v k a u B., He r r e n B., Ko y a m a H ., Ro s s R ., Ra in e s E. W .,
1998. Caspase-mediated cleavage o f focal adhesion
kinase p p l2 5 FAK and disassembly o f foca l adhesions in human endothelial cell apoptosis. J. Exp. Med. 187,
579-586.
Li P., Nij h a w a n D ., Bu d ih a r d j o I., Sr in iv a s u l a S . M ., Ah m a d
M ., Al n e m r i E . S ., Wa n g X ., 1997. Cytochrome c and
dATP-dependent form ation o f Apaf-1 /caspase-9 com plex initiates an apoptotic protease cascade. Cell 91,
479-489.
Liu X., Kim C. N., Ya n g J., Je m m e r s o n R., Wa n g X., 1996.
Induction o f apoptotic program in cell-free extracts: re
quirement/or dATP and cytochrome c. Cell 86, 147-157.
Ro z e n g u r t E., 1995. Convergent signalling in the action o f
integrins, neuropeptides, growthfactors and oncogenes.
Cancer Surv. 24, 81-96.
Ru d e lT ., Bo k o c hG. M., 1997. Membrane and morphological
changes in apoptotic cells regulated by caspase-medi ated activation ofPAK2. Science 276, 1571-1574.
Sc a r l e t tJ. L., Mu r p h yM. P., 1997. Release o f apoptogenic
proteins fro m the mitochondrial intermembrane space during the mitochondrial permeability transition. FEBS
Lett. 418, 282-286.
Sc h w a r t zL. M., Mil l ig a nC. E., 1996. Cold thoughts o f death:
the role o f ICE proteases in neuronal cell death. Trends
Neurosci. 19, 555-561.
St e l l e rH . , 1995. Mechanisms and genes o f cellular suicide.
Science 267, 1445-1462.
Su s inS. A., Lo r e n z oH. K., Za m z a m iN., Ma r z o I., Sn o w B. E.,
Br o t h e r s G. M., Ma n g io n J., Ja c o t o tE., Co s t a n t in iP.,
Lo e f f l e rM., La r p c h e t t eN., Go o d l e t tD. R., Ae b e r s o l d
R., Sid e r o v s k iD. P., Pe n n in g e rJ. M., Kr o e m e rG., 1999.
Molecular characterization o f mitochondrial apoptosis- inducingfactor. Nature 397, 441-446.
Ta n g D., Kid d V. J., 1998. Cleavage o f DFF-45/ICAD by
multiple caspases is essential fo r its function during apoptosis. J. Biol. Chem. 273, 28549-28552.
Th o m p s o n C. B., 1995. Apoptosis in the pathogenesis and
treatment o f disease. Science 267, 1456-1462.
Ub e d aM ., Ha b e n e rJ. F., 1997. The large subunit o f the DNA
replication complex C (DSEB/RF-C140) cleaved and inactivated by caspase-3 (CPP32/YAMA) during Fas-in- duced apoptosis. J Biol Chem. 272, 19562-19568.
Va n De r He id e n M. G., Ch a n d e l N. S., Wil l ia m s o n E. K ., Sc h u m a c k e r P. T., Th o m p s o n C. B., 1997. Bcl-xL regu
lates the membrane potential and volume homeostasis o f mitochondria. Cell 91, 627-637.
Wo n g P. C., Bo r c h e l t D. R., 1995. M otor neuron disease
caused by mutations in superoxide dismutase 1. Curr
Opin Neurol. 8, 294-301.
Wo n g P. C., Ro t h s t e inJ. D., Pr ic e D. L., 1998. The genetic
and molecular mechanisms o f motor neuron disease.
Curr. Opin. Neurobiol. 8, 791-799.
Ya n g J., Liu X . , Bh a l l a K., Kim C . N., Ib r a d o A . M., Ca iJ.,
Pe n g T . I., Jo n e s D . P, Wa n g X . , 1997. Prevention o f
apoptosis by Bcl-2: release o f cytochrome c fro m mito chondria blocked. Science 275, 1129-1132.
Zo r a t t i M., Sz a b o I., 1995. The mitochondrial permeability
