•
ONDERZOEK .
VAN AMYLOID
UIT ZADEN
PROEFSCHRIFT
TER VERKRIJGING VAN DE GRAAD VAN oocrOR IN DE TECHNISCHE WETENSCHAP. AAN DE TECHNISCHE HOGESCHOOL 'TE DELfT OP GEZAG VAN DE RECTOR MAGNIFICUS, DR. 0, BOTTEMA, HOOGLERAAR IN DE AFDELING DER ALGEMENE WETENSeHAPPEN, VOOR EEN COMMISSIE UIT DE SENAAT TE VERDEDIGEN OP WOENSDAG 15 APRIL 1959
DES NAMIDDAGS TE 2 UUR DOOR
PIETERKOOIMAN SCHEIKUNDIG INGENIEUR GEBOREN TE GORINCHEM
INHOUD
Inleiding en Literatuuroverzicht 7
Hoofdstuk I. Het voorkomen van amylóidin het plantenrijk 12 Hoofdstuk II.
Hoofdstuk III. Hoofdstuk IV.
Hoofdstuk V. Hoofdstuk VI.
De localisatie van amyldid in het zaad Overeenkomst tussen amyldid-soorten Ontstaan en verdwijnen van amyldid in het zaad
Bereiding en zuivering van amyldid De bepaling van amyldid
Hoofdstuk VII. De structuur van tamarindus-amylold Hoofdstuk VIII. Het moleculairgewicht. van amylctld Hoofdstuk IX. Vergelijking van eigenschappen van
tama-rindus-amyldid met die van andere amyldid-24 25 29 31 34 38 66 preparaten 69
Hoofdstuk X. Mogelijkheden voor economische
toepassin-gen van amyldid 72
Samenvatting Summary Literatuur 75 78 80
Sommige plantensoorten bezitten zaden, waarvan een coupe door een zaadlob of door het endosperm een blauwe kleur ver-toont, wanneer deze coupe in een JKJ -oplossing wordt gelegd. Bii microscopisch onderzoek blijkt dan de celwand blauw gekleurd te zijn. Naar analogie met de blauwkleuring van· zetmeel met JKJ heeft men (VOGE L en SCHLEIDEN, zie verder) de blauwkleurende celwandstof amyloiä genoemd; de reactie wordt genoemd de amy-lDiä -reactie.
Over het voorkomen van de amylord-reactie bestaat weinig li-teratuur; hiervan is het belangrijkste gepubliceerd in de negen-tiende eeuw. Een korte bespreking van deze oudere literatuur vindt men bij VAN WISSELINGH in LINSBAUER (1925).
SCHLEIDEN (1838) en VOGEL en SCHLEIDEN (1839) hebben rep.nR waargenomen, dat de, çelwanden van cotylen van Schotia latifolid, Schotia speciosa, Hymenaea courbaril, Mucuna urens
en Tamarindus indica door een JKJ-oplossing worden
blauwkleurd. De hiervoor verantwoordelijke stof, door hen amylord ge-noemd, werd - althans voorlopig - tot de hemicellulosen gere-kend. De genoemde onderzoekers konden het amylord met kokend water extraheren, waarbij viskeuze oplossingen werden verkre-gen. Het gemakkelijkst loste het amylord van Schotia op, het
moeilijkst dat van Tamarindus .
FRANK (1866) nam waar dat de verdikte celwanden in cotylen van Tropaeolum majus-zaden de amylord-reactie vertonen. Bo-vendien toonde hij amylord aan in de zaden van Primula officina:-lis, Androsace septentrionalis, Anagallis arvensis, Glaux mari-tima en Samolus valerandi; hij opperde de mogelijkheid, dat alle Primulaceae amylo1"d in de zaden zouden bevatten.
HEINRICHER (1888) vond in de celwanden van de zaden van enige Impatiens -soorten amylotd, waarvan hij dacht, dat het
wel-licht identiek zou zijn met het amylo1"d van SCHLEIDEN.
Volgens REISS (1889) bevatten de zaadlobben, respectievelijk het endosperm van zaden der volgende plantensoorten amylord:
Impatiens balsamina, Tropaeolum majus, Primula officinalis , Cyclamen europaeum en Paeonia officinalis . Het amylord bleek
gelocaliseerd te zijn in de celwand-verdikkingen.
NADELMANN (1890) onderzocht de zaden van ruim 70 ver-verschillende Leguminosae op het voorkomen van amylord en vond het bij Mucuna urens en Goodia lotifolia (abusievelijklatifolia
ge-noemd). Hij vermeldt evenmin als de andere onderzoekers de concentratie van het gebruikte reagens. Wel vermeldt hij, dat de c.elwanden bruin-oranje kleurden met geconcentreerde JKJ-op-lossing, en dat de kleur blauw werd bij toevoeging van water; bij reactie met jodium in verdunde kaliumjodide-oplossing werden de celwanden donkerblauw.
WINTERSTEIN (1893) verrichtte als eerste een chemisch on-derzoek aan het amylo1"d van Tropaeolum majus, Paeonia offici-nalis enlm/Jatiens balsamina. HU isoleerde de stof uit de ontvette
zaden door extractie met kokend water en precipitatie van de stof door toevoeging van alkohol. De oplossing van het product in wa-ter kleurde met JKJ-oplossing blauw. WINTERSTEIN consta-teerde, dat diastase niet op amylotd inwerkt. Hij toonde aan, dat amylord glucose, galactose en xylose bevat, en vond, dat Paeonia-amylofd bij hydrolyse en oxydatie evenveel slijmzuur (uit galac-tose) opleverde alsTropaeolu~amylord. Ook leverde Paeonia-amylord bij de destillatie met zoutzuur evenveel furfural (uit xylose) als Tropaeolum-amylord.
VAN WISSELINGH (1898) verrichtte de amylord-reactie met als reagens een JKJ-oplossing, welke 0.04% JZ1 0.4% KJ en 10% HZS04
bevatte. Hij vond amylord in zaden van Paeonia officinalis en van Tamarindus indica. Bij Tamarindus bleek hem, dat de secundaire wand praktisch geheel uit amylord bestond, terwijl de primaire wand cellulose en amylord bevatte. VAN WISSELINGH consta-teerde, dat ook de celwanden van Fucus vesiculosus de amylord-reactie gaven; hij schreef dit toe aan fucine.
Hier raken wij een punt, dat door MITCHELL (1930) is onder-zocht. De blauwkleuring van de celwandbestanddelen hangt name-lijk sterk af van de samenstelling van het reagens.
MITCHELL verrichtte de reactie met een JKJ-oplossing, be-vattende 0.3 g Jz en 1.6 g KJ per 100 mI water, waarna HZS04 van verschillende concentraties werd toegevoegd.
Met het reagens zonder HZS04 - toevoeging trad blauwkleuring op bij zaden van Tamarindus indica. Werd na het reagens 26 vol.
%
HzS04 toegevoegd, dan kleurden violet: zaden van Impatiens bal-samina, Primula officinalis en Tropaeolum majus. Deze resul-taten zijn niet in overeenstemming met die van FRANK; op de verklaring van deze tegenstelling kom ik later terug. De zaden van genoemde plantensoorten bevatten volgens de oudere litera-tuur amylofd, en MITCHELL stelt dan ook voor om dit reagens (dus JKJ-oplossing gevolgd door 26 vol. % HZS04) als amyloltl-re-agens te gebruiken.Werd na het reagens 50 vol.
%
HzSÜ4 toegevoegd, dan werdenblauw gekleurd: endosperm van Coffea arabica, Diospyros virgi-niana, Phoenix dactylifera en Strychnos nux-vomica, en zaad-lobben van Lupinus hirsutus. Deze kleuren niet blauw bij lagere zuurconcentratie .
Voor al deze soorten is wel eens geponeerd, dat ze amylo1"d bevatten; vermoedelijk heeft men in die gevallen een JKJ-oplos-sing gebruikt, die zeer veel HzS04 bevatte.
Waarschijnlijk was dit het geval bij TRECUL (1858), die in een aantal zaden van Monocotylen amylord vond. Ook bij TSCHIRCH (1889) vindt men enige Monocotylen vermeld; deze auteur noemt verder Hymenaea courbaril, Schotia latifolia, Mucuna Tamarindus urens, indica, een Lupinus-soort ~ Paeonia- en Impatiens-soorten, Tropaeolum majus, enige Primulaceae, waaronder Cy-clamen neapolitanum. Tenslotte noemt TSCHIRCH ook cambium-membranen van talrijke loof- en vooral naaldbomen, en ook liche-nine.
Amylord in andere Qrganen dan zaden wordt door verscheidene onderzoekers vermeld. PRINGSHEIM (1924) toonde aan, dat een polysaccharide-fractie uit ruwe lichenine, isolichenine genaamd, blauw kleurde met JKJ -oplossin~. . .
MEYER en GtJRTLER (1947) fractioneerden deze isolichenine en vonden, dat twee van de fracties de amylol'd-reactie gaven. Een daarvan was vermoedelijk zetmeel. De andere fractie, welke zeer klein was, was niet homogeen; een deel ervan vormde een neer-slag met Fehling' sJ?roefvocht.
HOPMANN (1930) toonde amylol'd aan in de zeefvaten van de stengel van Lycopodium clavatum;dit amylord loste, in
tegenstel-ling tot amylol'd uit Tropaeolum, Paeonia en Impatiens, niet op in
Cuoxam. Een dergelijk amylol'd vond HOPMANN in de celwanden van zeef- en melkvaten van verschillende cormophyten, in de cel-wanden van verscheidene thallophyten, in celcel-wanden van wortel-toppen en wortelharen, en in stempelpapillen van grassen. Vol-gens HOPMANN hebben lamellen, die later verhouten, vaak vóór de verhouting zeer duidelijk amyloi'd. Nergens wordt in deze pu-blicatie de samenstelling van het JKJ-reagens genoemd.
Dit was wél het .geval in de publicaties van (j DWYER (1931, 1934). Hier werd gevonden, dat he>nicellulose A van spinthout van de Engelse eik met JKJ-oplossing (2 g J2 en 6 g KJ per 100 mI water) blauw kleurde, terwijl kernhout-hemicellulose deze reac-tie niet gaf. Daar spinthout, in tegenstelling tot kernhout zetmeel bevat, lag het voor de hand te veronderstellen, dat de hemicellu-lose zetmeel bevatte. (j DWYER constateerde, dat takadiastase de blauwkleurende stof aantastte, zij het veel langzamer dan zet-meel; bij de aantasting kwam een weinig glucose vrij. Deze hemi-cellulose-fractie bleek grotendeels uit xylose-eenheden te zijn opgebouwd. WeUicht is hier de blauwkleuring met JKJ-:oplossing door een geringe hoeveelheid zetmeel veroorzaakt. Dit onderzoek is door (j DWYER (1939) herhaald, waarbij de hemicellulose-fractie enige malen met takadiastase werd gelhcubeerd. De hemi-cellulose loste bijna geheel op en in de oplossingwerdenxylose en een polysaccharide (bestaande uit xylose- en monomethyluron-zuur-eenheden) gevonden. Glucose kon niet worden aangetoond.
Dergelijk onderzoek met hemicellulose van Citrus limonia, Populus macdougali en Robinia pseudoacacia werd verricht door
ANDERSON et al (1940,1942). Nadat zetmeel uit het hout was ver-wijderd, werd een hemicellulose -fractie ge~xtraheerd (dus vóór de chlorering); deze kleurde met JKJ-oplossing blauw. Hemicel-lulose, ge~xtraheerd na de chlorering, kleurde niet met JKJ-op-lossing. Takadiastase, speekselamylase en moutamylase werkten langzaam in op de blauwkleurende hemicellulose, terwijl de amy-lord-reactie tijdens de inwerking negatief werd. ANDERSON et al stelden vast, dat alleen hemicellulose, waarin glucose voorkwam, met JKJ-oplossing blauw kleurde, Vermoedelijk moet men de
blauwkleuring ook in dit geval wijten aan de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid zetmeel in de hemicellulose.
CARBON en MACLAY (1948) isoleerden hemicellulose via ho-locellulose uit zaden van Phaseolus lunatus. 'Zowel de hemicel-lulosefractie, die met 5% KOH, als die met 24 % KOH werd ge-extraheerd, kleurde blauw met JKJ-oplossing. Wanneer zij deze hemicellulose extraheerden met kokende CaCl2-oplossing ( s. g.
1.3) (waarmee men volgens STEINER en GUTHRIE (1944) zetmeel extraheert), kregen zij een residu (hemicellulose), dat de amy-lord-reactie nog vertoonde. De samenstelling van het reagens werd echter in deze publicaties niet vermeld. Het is overigens zeer goed mogelijk, dat de laatste sporen zetmeel uit het hemi-cellulose-preparaat, dat afkomstig was uit zeer zetmeelrijk ma-teriaal, moeilijk zijn te verwijderen, en daardoor aanleiding ge-ven tot misvattingen. Hetzelfde geldt voor de reeds besproken hemicellulose -preparaten van 0' DWYER en van ANDERSON et al. Bij het onderzoek over de amylofd-reactie heb ik mij bepaald bij celwand-bestanddelen van zaden.
De aanleiding tot dit onderzoek was een reeks publicaties van Indische onderzoekers over het polysaccharide van Tamarindus indica. Dit polysaccharide is identiek met het amylord van Tama-rindus indica en werd in India feitelijk herontdekt ruim 100 jaar
na de eerste publicaties van Westerse onderzoekers.
Volgens RAOenDICKEY (1953) werd in1942-1943 door KRISH-NA en GHOSE de aandacht gevestigd op het polysaccharide van
Tamarindus indica-zaden, waarbij de samenstelling van het
poly-saccharide werd vermeld. Deze publicaties zijn weinig opgevallen: in publicaties van omstreeks 1946 leest men over de "pectine" van
Tamarindus -zaden. In hetzelfde jaar corrigeren SAVUR en
SREENIVASAN (1946) deze opvatting met hun analyse (glucose, xylose en galactose in de verhouding 3:2:1;geen uronzuur).
In dezelfde tijd bleek het Tamarindus -polysaccharide, dat met
water zeer viskeuze oplossingen geeft, uitstekend bruikbaar voor verscheidene toepassingen, in het bijzonder als apprêt in de jute-industrie~ In feite is het zo, dat de Indische jute-industrie, die voorheen jaarlijks ca 10.000 ton zetmeel voor apprêl verwerkte, thans uitsluitend Tamarindus -zaden hiervoor gebruikt (SARKAR
en MAZUMDAR (1952».
In de hierboven genoemde publicatie van RAO en DICKEY wordt becijferd, dat de opbrengst aan Tamarindus -vruchten in India per
jaar ruim 220.000 ton bedraagt; hiervan bestaat 60% uit zaden. Van de zaden bestaat 70% uit zaadlobben ( die het polysaccharide bevatten). Er zou, wanneer men het gehalte aan ruw polysaccha-ride in de zaadlobben op 50% stelt, jaarlijks 46.000 ton poly-saccharide opgebracht kunnen worden door India. Het grootste deel van de zaden wordt echter nog niet benut.
Aan de technologie van de verwerking der Tamarindus -zaden
belangrijk probleem is de verwijdering van de zaadhuid; er be-staan enige octrooien op dit punt (bijv. DEODHAR, 1954).
Het polysaccharide van Tamarindus -zaden heeft in potentie naar mijn verwachting vrijwel hetzelfde toepassingsgebi~d als het polysaccharide van Ceratonia-zaden (Johannesbrood-pitten) en verwante galactomannanen. Daar aan Tamarindus-polysaccharide nauw verwante stoffen in een aantal andere Caesalpinioideae voor-komen., lijkt het van belang, met deze slecht onderzochte groep van polysacchariden nader kennis te maken. Van enkele soorten zijn de zaden wellicht op economische wijze in aanzienlijke hoe-veelheden te winnen; ze bezitten een hoog gehalte aan amylord, waardoor ze economisch waardevol kunnen zijn.
In de eerste plaats leek het mij gewenst te onderzoeken, of er, behalve de bekende amylord-houdende, nog andere amyloid-hou-dende zaadsoorten te vinden zouden zijn.
In de tweede plaats diende inzicht verworven te worden omtrent de wijze, waarop het amylord in sommige soorten in de celwanden van de zaadlobben of van het endosperm is afgezet.
Ten derde werd een begin gemaakt met het chemisch onderzoek naar het wezen van amylord uit zaden van verschillende planten-soorten, en werd getracht enige aanvullende gegevens te ver-krijgen over de structuur van Tamarindus-polysaccharide.
Tenslotte volgt hier een opmerking over de term amylord. In
de aanvang van de inleiding is de oorsprong van deze term ge-noemd. Men heeft het woord amylord echter gebruikt voor allerlei met jodium blauw kleurende stoffen. Zo kent men deze term voor een met zuur gëdeelte~ijk afgebroken cellulose, voor slijmmem-branen bij verscheidene schimmels en lichenen, en ook voor een glycoprotelhe, dat onder pathologische omstandigheden in milt, hersenen, nier, lever en long voorkomt. In deze laatste zin is de benaming amylord nog het meest bekend. Inae oudere literàtuur komt men de term amylord wel tegen voor de zetmeelcomponent, die thans amylose heet.
Om verwarring tegen te gaan verdient het aanbeveling om voor de met JKJ-oplossing blauwkleurende celwandbestanddelen van zaden niet de benaming amylol~ zonder meer te gebruiken, doch zaad-amylot"d en, ter onderlinge onderscheiding, dit woord te kop-pelen aan de naam van de plant, waarin het voorkomt: bijvoor-beeld Tamarindus-zaad-amylord, Tropaeolum-zaad-amyloid, en-zovoorts.
In het vervolg van deze publicatie is gemakshalve . sprake van Tamarindus-am;ylord, 1'ropaeolum-amylord, enzovoorts. Tevens is een afspraak nodig omtrent de samenstelling van het reagens. Als reagens werd steeds-gebruikt de door MITCHELL beschre-ven; niet-aangezuurde JKJ-oplossing (per 100 mI water bevat-tende 0.3 g J2 en 1.6 g KJ). De celwandbestanddelen, die met dit reagens blauw, violet of bruin-violet kleuren, beschouw ik als amylord.
Hoofdstuk I.
HET VOORKOMEN VAN AMYLOID IN HET PLAN-TENRIJK
Uit de inleiding is gebleken, dat amylord in zaden (in de zin van celwandbestanddelen, die blauw kleuren met een JKJ-oplos-sing waaraan geen zuur is toegevoegd) weinig algemeen in het plan{enrijk voorkomt. Het leek mij waarschijnlijkt dat bij enig zoeken wel meer plantensoorten met amylord-houaende zaden te vinden zouden zijn, dan er tot dusverre bekend waren.
In de eerste plaats dacht ik aan soorten, die in systematisch opzicht verwant zijn met soorten, waarvan reeds bekend was, dat deze amylord bevatten. Bij verwante soorten kan men immers vaak verwante stoffen vinden.
Doordat in de literatuur gewag wordt gemaakt van vier leden van de Caesalpinioideae (een onderfamilie van de Leguminosae)
ben ik begonnen met zoveel mogelijk vertegenwoordigers van deze onderfamilie te onderzoeken op. aanwezigheid van amylord in de zaden.
Vervolgens heb ik de leden van andere families,. waarin amy-lord-houdende soorten voorkomen, onderzocht, voorzover wij daarvan representanten in de zadenverzameling van het Laborato-rium voor Algemene en Technische Biologie bezitten.
Hierna heb ik de rest van de zadenverzameling getest, waarbij nog enige famIlies werden gevonden, waarin amylord-houdende soorten voorkomen. In totaal werden ruim 1500 soorten onder-zocht.
Voor het beschikbaar stellen van zaden ben ik vooral de volgende personen en instellingen in hoge mate dankbaar:
Dr. J . Léonard. Brussel Prof. P. Duvigneaud. Brussel
Botanisch Museum en Herbarium van de RijkSUniversiteit te Utrecht Rijksherbarium te Leiden
1 ardin Botanique de l'Etat. Brussel Jardim Botanico do Rio de Janeiro
The Conservators of Forests·of Uganda, Nyasaland, Nigeria, Tanganyika. Gold Coast and Kenya.
Dr.H.S.McKee. Noumea, New Caledonia
Mr. Felipe Gonzalez. Atkins Garden, Cienfuegos. Cuba Dr.A.D.J.Meeuse. Pretoria. Zuid Afrika
Dr. B. Bergeroo-Campagne. Abidjan. COte d 'Ivoire Universitetets Botaniska Have, K_benhavn. Denemarken
13
Het onderzoek geschiedde door coupes van een cotyl of van endosperm (of bij kleine zaden door het platgedrukte en uit elkaar gewreven zaad) te leggen in een druppel JKJ-oplossing, welke per 100 mI water bevatte 0.3 gJ2
en 1.6 g KJ. De preparaten werden vervolgens met behulp van het microscoop onderzocht op de aanwezigheid van blauw gekleurde celwanden.Resultaten.
Voor het voorkomen van de amylol"d-reactie bij de Legumi-nosae-Caesalpinioideae wordt verwezen naar de tabellen II en
m.
voor de amylofd-houdende soorten van de andere plantenfamilies naar tabel IV.A. Leguminosae-Caesalpinioideae
Behalve de vier in de literatuur als amyloi'd-houdend genoemde soorten (zie tabel I) bleek een groot aantal vertegenwoordigers (nI. 91) van een aanzienlijk aantal geslachten (nI. 45) amylol"d in . de zaadlobben. te bezitten, terwijl 100 soorten (uit 60 geslachten)
een negatieve amylo1"d-reactie vertoonden. .
Bij beschouwing van het resultaat van de reactie tesamenmet het systematisch verband in de Caesalpinioideae valt het op, dat; behoudens enkele uitzonderingen, de amylofd-houdende leden van deze onderfamilie zich bevinden in de tribae 1 en 2 (Cynometreae-Amherstieae).
In de andere tribae van de Caesalpinioideae komt geen amylord voor, behalve in tribus 3 (Sclerolobieae), waar het bij de ge-slachten Dicymbe en Phyllocaypus werd gevonden. Opgemerkt dient hier te worden, dat de Sc1erolobieae uit oogpunt vanplan-tensystematiek dicht bij de Amherstieae staan (zie bijv. DWYER .
(1954». Ik heb dan ook in tabel Ua deze drie tribae tesamen geno-men en de geslachten alfabetisch gerangschikt. Deze concentratie in bepaalde tr.ibae van plantengeslachten met een bepaald reserve -.
polysaccharide in de zaden treffen we in deze subfamilie ook nog op andere wijze aan.
Zo vindt men zetmeel bij de vertegenwoordigers van tribus 9
(Swartzieae). Galactomannan komt veelVuldig voor in de tribae 5
(Cassieae)en 7 (Eucaesalpinieae). Bij de soorten van .deze laatste tribae bevindt zichde koolhydraatreserve, in tegenstelling tot de amylol'd-houdende soorten van de Caesalpinioideae, in het goèd ontwikkelde endosperm (ANDERSON (1949».
Misschien kan men het type van het reserve-polysaccharide der zaden als een fysiologisch kenmerk beschouwen. In elk ge-val zien we met de gegevens, die ons uit dit onderzOek ten dienste staan, paralleliteit tussen het type van het reserve-polysaccha-ride enerzijds en de morfologische kenmerken, waarop de
inde-ling der Caesalpinioideae is gebaseerd. De in tabel
n
weergege-ven indeling is die van DE DAL LA TORRE en HARMS (1900-1907), door mij aangevuld met behulp van gegevens uit denieuwe-re literatuur, voornamelijk uit nieuwe-recente publicaties van LEONARD (1957).
Een betere indeling zal, nu er zoveel meer Caesalpinioideae
goed bekend zijn, thans zeker mogelijk zijn. Stappen in deze rich-ting zijn in de laatste jaren ondernomen door DWYER, LEONARD en DE WIT. Misschien zouden bij een herindeling de genoemde fysiologische kenmerken vollediger met de indeling in tribae samenvallen.
B. Acanthaceae.
De amyloi"d-houdende soorten van deze plantenfamilie bleken voor te komen in de subfamilie Thunbergioideae en in de tribus Imbrieatae van de subfamilie Aeanthoideae. Het amylol"d komt
voor in de zaadlobben.
Onderzocht werden 65 soorten, behorende tot 50 verschillende geslachten.
C. Anonaceae.
Het endosperm van alle onderzochte Anonaeeae vertoonde de
amyloi"d-reactie. De kleuring met het JKJ-reagens was evenwel niet blauw, doch bruinviolet.
D. Balsaminaceae
Van 7 soorten Jmpatiens werd alleen bij Impatiens balsamina
amyloi"d gevonden in de zaadlobben. E. Leguminosae-Papilionatae.
Goodia lotifolia heeft, in tegenstelling tot Goodia pubes eens ,
amylol"d in de zaadlobben. .
Mueuna urens was de enige van de vier onderzochte
Mueuna-soorten, die amylord bevat.
Onderzocht werden 126 soorten van 104 verschillende geslach-ten der Papilionatae.
F. Limnanthaceae.
De enige onderzochte vertegenwoordiger van deze kleine fa-milie, Limnanthes douglasii, bleek amylol"d-houdende zaadlobben
te hebben.
G. Linaceae.
Van 11 onderzochte Linum -soorten bleken 3 soorten amyloi"d in
het endosperm te bevatten. Deze soorten behoren tot de sectie
Eulinum.
H. Melianthaceae.
-soor-ten getest. Beide hebben amylofd in het endosperm. I. Myrsinaceae.
Alle onderzochte soorten bevatten amylofd in het endosperm. De Maesa-soorten evenwel vertoonden slechts een zeer zwak po-sitieve reactie.
J. Pedaliaceae.
De zaadlobben van alle 6 onderzochte soorten van deze familie
vertoonden een uiterst zwakke amylol"d-reactie. K. Primulaceae.
Het was reeds lang bekend, dat verscheidene soorten van deze familie amylord in het endosperm bevatten. Uit tabel IV blijkt, dat alle onderzochte soorten positief reageren met JKJ.
L. Ranunculaceae.
Alleen van leden van het geslacht Paeonia is het endosperm
amylol"d-houdend. Paeonia-soorten zonder amyloid werden niet gevonden.
M. Sapindaceae.
Van 28 soorten (behorende tot 18 verschillende geslachten) bleken alleen Cardiospermum halicacabum en, in zeer zwakke mate, Cardiospermum hirsutum amylol"d in de zaadlobben te
be-zitten. .
N. Sapotaceae.
Onderzocht werden 23 soorten (behorende tot 11 verschillende
geslachten). Twaalf hiervan (behorende tot 6 geslachten) bevatten
amylord. Van een taxonomisch verband blijkt niets: de amylofd-houdende geslachten lijken willekeurig verdeeld over de gehele familie.
O. Theophrastaceae.
Van deze kleine familie was slechts één soort beschikbaar; hiervan bevatte het endosperm amylol"d.
P. Tropaeolaceae.
Alle onderzochte Tropaeolum-soorten hebben
amylol"d-houden-de zaadlobben.
Uit het voorgaande ziet men, dat amyloi"d in 16 families der Dicotylen werd aangetroffen, daarentegen bij geen enkele familie der Monocotvlen.
Bij enkele families werden geen niet-amylol"d-houdende plan-tensoorten gevonden: Anonaceae, Tropaeolaceae, Melianthaceae, Myrsinaceae, Primulaceae, Theophrastaceae. De laatste drie families vormen de orde Primulales . Hoewel van de Myrsinaceae en de Theophrastaceae slechts weinig soorten konden worden on-derzocht, is het verleidelijk om een positieve amylotd-reactie als fysiologisch kenmerk voor de Primulales te veronderstellen. Tussen andere families, welke amylol"d-houdende soorten bezit-ten, zijn dergelijke verwantschappen nauwelijks aan te wijzen; trouwens reeds binnen de meeste families is het, mede door be-perktheid van het onderzochte materiaal, moeilijk parallellen te zien met de taxonomie. Wat het laatste betreft, vormen de Le-guminosae-Caesalpinioideae een uitzondering.
Een aanzienlijk aantal plantensoorten, dat volgens de litera-tuur amylofd in de zaden zou bevatten, bleek bij mij de amylol"d-reactie in het geheel niette geven. Vele onderzoekers vermelden niet de samenstelling van hun JKJ-reagens. Ik vermoed, dat de-genen, die soorten als Phoenix dactylifera, Narcissus poeticus, Allium cepa, Iris sibirica e. a. amylofd-houdend vondenleen JKJ-reagens hebben gebruikt, dat een belangrijke hoeveelneid zuur bevatte. In elk geval kleuren de celwanden van cotylen of endo-sperm der zo juist genoemde soorten niet blauw met het door mij gebruikte reagens volgens MITCHELL, wél echter met dit rea-gens, wanneer daaraan een grote hoeveelheid zwavelzuur is toe-gevoegd (MITCHELL, 1. c. ).
Hier zij vermeld, dat ik, in tegenstelling tot MITCHELL, de zaden van Impatiens balsamina, van Primula officinalis en v~n
Tropaeolum ma jus amylot'd-houdend vond. Dit verschil in bevin-dingen kan worden verklaard door de omstandigheid, dat MIT-CHELL de zaden tevoren liet zwellen, terwijl ik de zaden zonder voorbehandeling gebruikte. Bij de proeven van MITCHELL drong het reagens dus in de cellen onder verdunning: hierdoor trad geen blauwkleur~ op. Deze verklaring kon ik door proeven bevesti-·gen.
Vergeleken met het aantal plantensoorten, waarvan vroeger reeds bekend was, dat deze amylol"d bevatten (zie tabel 1), is het aantal bekende amylotd-houdende soorten door dit onderzoek sterk vergroot, namelijk van 23 soorten (21 geslachten) vroeger, tot 230 soorten (109 geslachten) thans.
Onder de Anonaceae, Limnanthaceae, Melianthaceae, Peda-liaceae, Sapindaceae en Theophras taceae waren tot dusverre geen amylol'd-houdende soorten bekend.
Het aantal plantensoorten~ dat amylofd in de zaden heeft, is in werkelijkheid stellig veel groter. Behalve de mogelijkheid, dat er nog andere families zijn, die amylofd-houdende soorten bezitten, zijn er in de families waarin amylofd-houdende soorten werden gevonden, vele geslachten niet onderzocht, die naar verwachting
17
waarschijnlijk amylotd bevatten (bijvoorbeeld geslachten vanPrimulaceae, Myrsinaceae, Theophrastaceae, Leguminosae-Caesalpinioideae). Bovendien werden vele soorten, behorende tot geslacJ;lten, waarin amylofd-houdende soorten voorkomen, niet onderzocht; hierbij zijn zeer grote geslachten (bijvoorbeeld
Pri-mula, Lysimachia ·en vele andere), waarvan we op grond van dit onderzoek als vrijwel zeker kunnen aannemen, dat alle soorten amylotd in het zaad hebben.
Ondanks dit alles komt amylofd niet veel voor als celwandstof in het zaad. Als we een ruwe schatting zouden maken, zouden we het aantal amylotd-houdende soorten niet boven 1% van het aantal Phanerogamen -soorten stellen.
Tabel I
Soorten, welke volgens de literatuur amylo1"d bevatten en welke
dit ook bij het onderhavige onderzoek bleken te bevatten (zie .
NE-TOLITZKY (1926».
Acanthaceae. Primulaceae.
Thunbergia alata Anagallis arvensis
Schwabea Androsace septentrionalis
Balsaminaceae. Cyclamen europaeum
Impatiens balsamina "neapolitanum
Glaux maritima
Leguminosae-Papilionatae. Primula oUicinalis
Goodia lottlolia Samolus valerandi
Mucuna urens
, , . , . Ranunculaceae.
Legumznosae-CaesalPinzozdeae. P . U" l'
Hymenaea courbaril aeoma oulcma IS
Schotia lattlolia " speciosa Tamarindus indica Linaceae. Linum usitatissimum Myrsinaceae. Ardisia Sapotaceae. Dipholis Mimusops balata Sideroxylon Tropaeolaceae. Tropaeolum majus
19
TabellIA
Caesalpinioideae - Tribae Cynometreae - Amherstieae - Sclero-bieae
*
(alfabetisch)Afzelia 4+ Eperua 1.+ Paramacrolobium 1+
Amherstia 1+ Eurypetalum Pellegriniodendron
Amphimas 1- Gilbertiodendron 1+ Peltogyne 3+
Anthonotha 3+ Gilletiodendron 1+ Phyllocarpus 1+
Apaloxylon Goniorrhachis Plagiosiphon 1+
Aphanocalyx 2+ Gossweilerodendron 1- Poeppigia
1-Augouardia Guibourtia 1+ Polystemonanthus
Baikiaea 2+ Hardwickia 1- Prioria
Batesia 1- Heterosternon Pterogyne
1-Bathiaea' Humboldtia 1+ Pseudocopaiva
Berlinia 3+ Hylodendron 1+ Pseudomacrolobium
Brachystegia 2+ Hymenaea 4+ Pseudosindora
Brownea 1+ Hymenostegia 2+ Recordoxylon
Browneopsis Intsia 2+ Saraca 1+
Campsiandra 1- Isoberlinia 3+ Schotia 4+
Cenostigma Julbernardia 3+ Sclerolobium
3-Colophospermum1-Kingiodendron 1- Scorodophloeus 1+
Copaifera 8+ Lebruniodendron Sindora 4+
Crudia 2+ Librevillea Sindoropsis
Cryptosepalum 2+ Loesenera Stahlia
1-Cymbosepalum Lysidice Stemonocoleus
Cynometra 4+, 8? Macrolobium 2+ Tachigalia
2-Daniellia 2+ Maniltoa 1+ Talbotiella
Detarium 1+ Melanoxylon 1- Tamarindus 1+
Dicymbe 2+ Michelsonia Tessmannia 1+
Dicymbopsis Microberlinia Tetraberlinia
Diptychandra Monopetalanthus 1+ Thylacanthus
Didelotia Neochevalierodendron Trachylobium 1+ Elizabetha 1+ Oddoniodendron Vouacapoua
Endertia 1+ Oxystigma 2- Zenkerella
Englerodendron Palovea 1+
• 4+ betekent: alle vier onderzochte soorten vertonen positieve amyloltl-reactie.
TabellIB
Caesalpinioideae (exclusief Cynometreae, Amherstieae en Sclero· lobieae)* 4. Bauhinieae.
7.
Eucaesalpinieae . Bandeiraea 2- Acrocarpus Bauhinia 3- Aprevalia Cercis 2- Bussea Gigasiphon Caesalpinia Cercidium 5. Cassieae. Colvillea Apuleia 2- G Oelonix Baudouinia Gleditschia Cassia 3- G Gymnocladus Ceratonia 1- G Haematoxylon Danser.~ Hoffmanseggia Dialium 4- Jacqueshuberia Dicorynia 2- Mezoneurum Distemonanthus 1- Moldenhawera Koompassia 2- Parkinsonia Labichea 1- Peltophorum Martia 1- G Pogocybe Oligostemon 1- Z pterolobium Petalostylis 1- Schizolobium Storekiella 1- Stachyothyrsus Stuhlmannia Wagatea Uittienia Zuccagnia 6. Dimorphandreae. 8. Kramerieae. Brandzeia Krameria Burkea 1-Chidlowia 1- Z 9. Swartzieae. Dimorphandra 3- Aldina Erythrophloeum 1- Baphiopsis Kaoue Cordyla Mora Exostyles Pachyelasma 1- Holocalyx Sympetalandra Lecointea Mildbr aediodendr on Swartzia Zollernia• 2- betekent: beide onderzochte soorten vertonen negatieve amylolti-reactie. G betekent: galactomannan in het zaad aanwezig.
Z betekent: zetmeel in het zaad aanwezig.
2-1- Z 4- G 2- G 1- G 1- G 1- G 1- G 1- G 2- 1-1- G 1-1- G 1- 2- 1-1- Z. 1- Z 1- Z 1- Z 10- Z 2- ·Z
TabelllI
Leguminosae -Caesalpinioideae Amyloi'd-houdende soorten Mzelia africana (Sm.) Pers.
" beHa Harms " bipindensis Harms
" javanica (Miq.) J. Léonard " quanzensis Welw.
Amherstia nobilis Wall.
Anthonotha gilletii (De Wild. ) J. Léonard " macrophylla P. Beauv. " pynaertii (De Wild. ) Exell
et Hillcoat Aphanocalyx cynometroides Oliv.
" spec. (Flora Congo m,440) Baikiaea insignis Benth. subspec.
" "
insignis J. Léonard Benth. subspec. minor (Oliv. ) J. Léonard " eminii Taub.
Berlinia giorgii De WEd.
" " " " var. gilletii (De Wild. ) Hauman grandiflora (Vahl) Hutch. et
Dalz.
"
" viridicans Bak. f.
Brachystegia stipulata De Wild. var. lufirensis (De Wild. ) Hoyle " spec.
Brownea spec.
Copaifera baumiana Harms " coriacea Mart. " duckei Dwyer epunctata Amshoff " guianensis Desf. " mildbraedii Harms " officinalis L. " reticulata Ducke
Crudia glaberrima (Steud.) Macbr. " harmsiana De Wild.
Cryptosepalum maraviense Oliv. " spec.
Cynometra alexandri C. H. Wright " ananta Hutch. et Dalz. " hostmannii Tul.
*
" leonensis Hutch. et Dalz. " longicuspis Ducke*
" marginata Benth.*
" megalophylla Harms*
" parvifolia Tul.*
" pedicellata De Wild.*
" schlechteri Harms .. " sessiliflora Harms " vogelii Hook. f ... Daniellia alsteeniana Duvign." oliveri (Rolfe) Hutch. et Dalz. Detarium senegalense J. F. Gmel. Dicymbe altsoni Sandw.
" corymbosa Spruce
Elizabetha speciosa Ducke
Endertia spectabilis Van Steenis et De Wit Eperua bijuga Mart.
. Gilbertiodendron demeusei (De Wild. ) J.Léonard Gilletiodendron mildbraedii (Harms)
Verm. Guibourtia coleosperma J. Léonard Humboldtia laurifolia Vahl
Hylodendron gabunense Taub. Hymenaea altissima Ducke
" courbaril L. " oblongifolia Huber " parvifolia Huber Hymenostegia afzelii Harms
" laxiflora (Benth. ) Harms Intsia amboinensis A.D. C.
" bijuga
o.
KuntzeIsoberlinia angolensis (Welw. ) Hoyle et Brenan scheffleri (Harms)
Greenway tomentosa (Harms) Craib et Stapf Julbernardia baumii (Harms) Troupin
" paniculata (Benth. ) "
"
"
Troupin seretii (De Wild. )
Troupin Macrolobium bifolium (AubI.) Pers.
" multijugum Benth. Maniltoa gemmipara Scheff.
Monopetalanthus pteridophyllus Harms palovea guianensis Aubl.
Paramacrolobium coeruleum (Taub.) J. Léonard Peltogyne densiflora Spruce
" pubeseens Benth. " venosa (Vahl) Benth. Phyllocarpus riedelii Tul.
Plagiosiphon emarginatus (Hutch. et Dalz.) J. Léonard Saraca indica L.
Schotia bequaertii (De Wild. ) De Wild. " brachypetala Sond.
" latüolia Jacq. " speciosa Jacq.
Scorodophloeus zenkeri Harms Sindora cochinchinensis Baill.
" irpicina De Wit
" klaineana Pierre et Pellegr. " sumatrana Miq.
Tamarindus indica L. Tessmannia africana Harms Trachylobium verrucosum Oliv. • de zaden waren zeer oud. De uitslag van de reactie was daardoor onduidelijk.
Tabel IV
Amylofd-houdende soorten (exclusief Caesalpinioideae) Acanthaceae
Anisacanthus virgularis Nees " wrightii Nees Beloperone calüornica Benth.
" guttata T. S. Brandegee Hypoestes phyllostachya Bak.
" sanguinolenta Hook. Peristrophe bicalyculata Nees Ruspolia seticalyx Milne-Redhead Schaueria calycotricha Nees Schwabea ciliaris Nees Thunbergia alata Boj.
" fragrans Roxb. " reticulata Hochst.
Anonaceae
Anona cherimolia Mill. montana Macfad. muricata L. reticulata L. " squamosa L.
Artobotrys brachypetalus Benth. " un.:inatus Merrill. Asimina triloba Dun.
Cananga odorata Hook. f. et Th. Hexalobus glabrescens Hutch. et Mezzettia parvülora Becc. Monodor.a ctispilta EI}gl..
" myristica Dun. " tenuüolia Benth. Polyalthia littoralis Boerl.
Dalz.
" suberosa B. et H. Popowia caffra Hook. f. Rollinia emarginata Schlecht. Stelechocarpus schefferi Boer!. Unona discolor Vahl
Uvaria macrophylla Roxb. var. microcarpa Finet et Gagn. Uvariá rufa Blume
Xylopia aethiopica A. Rich. " mendoncae Exell. " villosa Chipp. Balsaminaceae Impatiens balsamina L. Limnanthaceae Limnanthes douglasii R. Br. Linaceae
Linum bienne Mill. " grandülorum Desf. " perenne L. " usitatissimum L. Melianthaceae Melianthus major L. " minor L. Myrsinaceae
Ardisia acuminata Willd. " crenata Sims " humilis Vahl " polycèphala Wall. " wallichii D. C. Maesa alnüolia Harv.
" argentea Wall. " indica (Roxb. ) Wall. " lanceolata Forsk. " perlarius (Lour. ) ·Merr. Myrsine africana L.
Rapanea neriüolia Mez. " urvillei Mez. Papilionaceae
Goodia lotüolia Salisb. Mucuna urens Medic Pedaliaceae
Ceratotheca triloba E. Mey. Harpagophytum peglerae Stapf Josephinia imperatricis Vent. Sesamum indicum L. " orientale Sieber " radiatum Schum. Primulaceae Anagallis arvensis L. " foemina Mill. Androsace maxima L.
Ardisiandra wettsteinii J:Wagner Asterolinum stellatum (L.) Link et Centunculus m1nimus L.
Coris monspeliensis L. Cortusa matthioli L.
Hoffm.
Cyclamen cilicium Boiss. et Heldz. " europaeum L.
Primulaceae (vervolg) Cyclamen graecum Linle
" neapolitanum Tenore " persicum Mill. " hybr.
Dodecatheon meadia L. Douglasia laevigata A. Gray
" vitaliana Rox. Glaux maritima L. Rottonia palustris L.
Lysimachia lichiagensis Forrest. " mauritiana Lam. " punctata L. " thyrsülora L. Primula officinalis Jacq.
" sinensis Lindl. " uralensis Fisch. Samolus valerandi L. Soldanella alpina L. " carpatica Vierh. " montana Willd. Steironema ciliatum (L.) Raf. Trientalis europaea L. Ranunculaceae
Paeonia albülora Pal!.
" anomala L. " beresowskii Komarov. " corallina Retz. " coriacea Boiss. " decora Anders. delavayi Franch. lusitanica Mill. " lutea Del.
" macrophylla (Alb.) Lomak " mlokosewitschi Lomak " mollis Anders. " moutan Sims. " obovata Maxim. " officinalis L. Ranunculaceae
Paeonia paradoxa Anders. " peregrina Mill. " potanini Komarov. " tenuüolia L. " triternata Pal!. " trollioides Stap!. " veitchii Lynch. " wittmanniana Hartw. " woodwardii Cox. Sapindaceae Cardiospermum halicacabum L. " hirsutum Willd. Sapotaceae Achras sapota L.
Dipholis montana Griseb. " salicifolia A.D. C. Illipe spec.
Mimusops balata Miq. " elengi L. " hexandra Roxb. Omphalocarpum ahia A. Chev.
" anocentrum Pierre Sideroxylon australe Benth.
" !oetidissimum Jacq. " inerme L.
quadriloculare Pierre Theophrastaceae
Jacquinia pungens A. Gray Tropaeolaceae Tropaeolum majus L. " minus L. " peltophorum Benth. " peregrinum L.
Hoofdstuk II
DE LOCALISATIE VAN AMYLOID IN HET ZAAD
-Amylot"d komt steeds voor als celwandverdikking van endo-sperm of van zaadlobben; amyloid-houdend periendo-sperm werd niet gevonden. Het wordt afgezet als binnenste celwandlaag. De amy-lord-laag is op vele plaatsen onderbroken, n.l. waar zich de po-ril:!n of stippels bevinden.
Verwijdert men het amylofd uit coupes, bijvoorbeeld van een zaadlob van Tamarindus indica , door de coupes met water uit te
koken, dan houdt men een weefsel over met dunne celwanden. De opgeloste stof bestaat grotendeels uit amylot"d. De celwanden van dit overblijvende weefsel vertonen cellulose-reactie en kleuren niet met JKJ-oplossing; ze hebben een zwakke dubbele breking. Onbehandelde coupes daarentegen vertonen intensieve blauwkleu-ring met JKJ-oplossing en hebben een sterke dubbele breking. De kortste as van de index-ellipsot"de van de amylot"d-houdende celwanden ligt zoals ook bij cellulose loodrecht op het vlak van de celwand. Bij het vezelige, gei"soleerde amylord ligt de kortste as loodrecht op de vezel-richting (positieve dubbele breking).
Men kan hieruit besluiten, dat de amylot"d-moleculen evenwij-dig aan de celwanden zijn afgezet.
De dubbele breking der amylorct-vezels werd ook onderzocht bij Hymenaea courbaril, Tropaeolum majus en Cyclamen hybr.,
terwijl ook coupes door de zaden van deze plantensoorten werden gemaakt en bestudeerd in gepolariseerd licht met en zonder "plaatje gips rood I". Alle vertoonden dezelfde optische ver-schijnselen als Tamarindus indica. De celwanden bij Tropaeolum
en Cyclamen blijken minder verdikt te zijn dan bij Tamarindus en Hymenaea. Dit blijkt in nog sterker mate het geval te zijn bij de
meeste andere amylot"d-houdende zaadsoorten, behalve bij de
Hoofdstuk 111
OVEREENKOMST TUSSEN AMYLOID -SOORTEN Vrijwel algemeen heeft men tot dusverre aangenomen, dat amylord een verzamelnaam is voor celwandbestanddelen, welke met JKJ-oplossing blauw kleuren. Hoewel dit niet uitdrukkelijk wordt vermeld, krijgt men bij het bestuderen van de literatuur over dit onderwerp de indruk, dat de meeste onderzoekers het amylofd van verschillende plantensoorten niet als chemisch ver-wante stoffen dachten.
Toch heeft reeds WINTERSTEIN (1. c. )in 1893 amylorct uit
Tropaeolum-, Paeonia- en Impatiens-zaden gefsole~rd en enige eigenschappen van de preparaten bestudeerd en aan elkaar gelilk bevonden (zie inleiding). WINTERSTEIN toonde, zoals reeds
ver-meld, in hethydrolysaat van Paeonia- en van Tropaeolum-amylötd
de drie suikers glucose, galactose en xylose aan.
GHOSE, KRISHNA en RAO (1945-6) en ook SAVUR en
SREENI-V ASAN (1946) bewezen, dat het polysaccharide (= amylofd) van
Tamarindus indica bestaat uit de genoemde drie suikers. Boven-dien vonden eerstgenoemde Indische onderzoekers, dat het poly-saccharide met alkalische kopersulfaat-oplossing (Fehling' s proefvocht) een gelatineus precipitaat geeft, waaruit het poly-saccharide kan worden teruggewonnen door aanzuren en preèipi-teren met behulp van een overmaat alkohol. Ook vonden zij, dat het polysaccharide een gelei vormt met boraat.
Er zijn nog meer argumenten voor de opvatting, dat
Tamarin-dus-amylord een enkelvoudige stof is; deze komen naderhand ter
sprake.
Tamarindus-amylord moet een hoge polymerisatiegraad
heb-ben: het vormt in water zeer viskeuze oplossingen (2%-ige
oplos-singen zijn reeds zeer stroperig), welke bij toevoeging van 0.5 - 1 volumedeel alkohol een draderig gelatineus neerslag geven, sterk
gelijkend op een op overeenkomstige wijze bereid pectine-neerslag.
Het met alkohol gewassen en vervolgens gedroogde product is
zeer vezelig en lijkt uiterlijk veel op pectine, welke op dezelfde
wijze is gewonnen.
Hetzelfde geldt voor alle tot dusverre door mij uit zaden van verschillende plantensoorten gersoleerde amylord -preparaten. Deze preparaten bleken nog meer eigenschappen gemeen te heb-ben, namelijk:
a) Alle amylofd-preparaten kleuren blauw of paars met JKJ-op-lossing.
b) oplossingen van amylofd vormen met Fehling' s proefvocht ge-leien Illet gelijke eigenschappen: sterke synerese; lichtblauw.e
doàrzichtige gel; na in brokjes te zijn verdeeld, groeien deze weer spoedig aaneen; de gel is, ook na goed met water tezUn uitgewassen, zeer weinig in water oplosbaar; de uitgewassen gel lost snel op in zeer verdund zoutzuur.
c) bij hydrolyse leveren ze alle glucose, xylose en galactose. d) alle worden gemakkelijk tot de onder c. genoemde suikers
ge-hydrolyseerd door het schimmelenzympreparaat "Pektölyt" . e) alle worden aangetast door ongekookte en öok.door verhitte
cel-lulase van Myrothecium verrucaria (zie voor eigenschappen van dit enzym KOOIMAN, ROELOFSEN en SWEERIS (1953»; de viscositeit van de oplossing daalt daarbij zeer snel tot die van water en er ontstaan een aantal oligosacchariden, waarvan er enige als hoofdproduct voorkomen; hierbij worden geen of prak-tisch geen monosacchariden gevormd.
De bovengenoemde eigenschappen werden gevonden bij de spe-cimina, vermeld in tabel V.
In tabel V treft men vertegenwoordigers aan van alle planten-familiesJ waarin amylofd-houdende soorten werden gevonden. Uit
de opgesomde eigenschappen, en uit de ruime monsterneming uit het aantal soorten met amylofd blijkt, dat amylofd, in de zin, die door mij hieraan is gegeven, een groep nauw verwante polysac-chariden is, die alle opgebouwd zijn uit hetzelfde drietal mono-sacchariden.
Met een aanzienlijk kleiner aantal amylofd-preparaten is deze verwantschap nog op meer specifieke wijze gedemonstreerd. 1. Van amylo1"d van Tamarindus indica, Hymenaea courbaril,
Schotia latifolia, Tropaeolum majus en Cyclamen hybr. wer-den drawer-den gesponnen door een zeer viskeuze oplossing van de preparaten in water (ca. 3%-ige oplossingen) te verspuiten in een bad met alkohol. De draden werden gerekt (ca. 50%) en vervolgens gedroogd. Van de verkregen vezels werden Rönt-gen-opnamen gemaakt. De Röntgenogrammen toonden alle oril'!ntatie en de interferentiebogen lagen bij alle vijf prepara-ten op dezelfde afstanden (KOOIMAN en KREGER 1957). 2. Van dezelfde amylofd-preparaten als genoemd onder 1 werd
eenzuur-h~drolysaat bereid~ zoals voor Tamarindus is be-schreven (VII A.); uit het parti~el gehydrolyseerde product werden de mono- en oligosacchariden verwijderd, waardoor men een gedeeltelijk afgebroken amylo1"d overhoudt. Bij alle vijf preparaten gaf dit product een poeder-Röntgenogram, dat karakteristiek is voor geregenereerde cellulose. Behalve de conclusie, dat ook in dit opzicht de vijf amylotd-preparaten zich gelijk gedragen, kan men hieruit ook afleiden, dat amy-lord een polysaccharide is met een hoofdketen, die opgebouwd is op de wijze van cellulose.
3. Van het gedeeltelijk afgebroken amylo1"d (genoemd onder 2) van Tamarindus indica, Tropaeolum majus, Hymenaea courbaril en Cyclamen hybr. werd papierchromatografisch onderzocht,
of er verschillen waren in de ligging en het aantal van de oligo-sacchariden, die bij incuberen met tlPektolyttl en metMyro-thecium-cellulase ontstaan. Zowel de hydrolysaten met
"Pek-tolyt" onderling als de hydrolysaten met cellulase onderling vertoonden volkomen hetzelfde beeld.
4. Amylo1"d van negen amylo1"d-preparaten (namelijk van Tama-rindus indica, Tropaeolum majus, Cyclamen hybr., Hyme-naea courbaril, Impatiens balsamina, . Anona muricata, Thun-bergia alata, Linum usitatissimum en Paeonia delavayi) werd
onderzocht op aantasting door het enzym-preparaat" Luizvm': . In alle gevallen leverde het papierchromatogram kwalitatief het-zelfde beeld: de eindproducten van de hydrolyse zijn glucose, galactose, geen xylose, en een grote hoeveelheid van een, ,naar later zal blijken, disaccharide.
Het is waarschijnlijk, dat de onder 1,2,3 en 4 gevonden eigen-schappen ook bij alle andere amylo1"d-soorten zijn te vinden. De Röntgen-opnamen van de amylo1"d-vezels wijzen erop, dat de ke:.. tenmoleculen op dezelfde wijze zijn georH!nteerd en dit kan alleen, wanneer ze op gelijke wijze zijn opgebouwd. Het beeld van gere-genereerde cellulose, dat .werd verkregen bij de Röntgen-opnamen van de gedeeltelijk afgebroken amylo1"d-preparaten,wijst ook sterk in deze richting. Vermoedelijk zijn alle amylol"den opgebouwd uit
~ 1, 4-glucosidische hoofdketens met zijgroepen van galactose en
xylose. .
Men kan amylol"d noemen galacto-xylo-glucan (en niet gluco-galacto-xylan, zoals voorgesteld door SAVUR en SREENIVASAN (1948». Ter onderscheiding van de amylo1"den van verschillende herkomst dient dan de naam van de betrokken plant daaraan vooraf te gaan, bijv. Tamarindus -zaad-galacto-xylo-glucan. Zoals reeds
in de inleiding is vermeld, wordt hier voortaan de term amy.lo1"d gebruikt, voorafgegaan door de naam van de plant, dus bij v .
Tabel V
Amylol'd-houdende soorten, waarvan werd bewezen, dat het poly-saccharide bestaat uit glucose, xylose en galactose. Acanthaceae
Thunbergia alata Boj.
Anonaceae
Anona muricata L. Asimina triloba Dun. Xylopia villosa Chipp.
Leguminosae-Caesalpinioideae Afzëlia airicana (Sm.) Pers. Brachystegia spec.
Copaifera officinalis L.
Crudia glaberrima (Steud. )Macbr. Cynometra ananta Hutch. et Dalz. Daniellia oliveri (Rolfe) Hutch. et
Dalz. Detarium senegalense J. F. Gmel. Eperua bijuga Mart.
Hymenaea courbaril L. " oblongifolia Huber Intsia bijuga O. Ktze.
Macrolobium bifolium (Aubl. )Pers. " multijugum Benth. Palovea guianensis Aubl.
Peltogyne venosa (Vahl) Benth. Phyllocarpus riedelii Tul. Schotia latifolia Jacq. Tamarindus indica L.
Trachylobium verrucosum Oliv. Balsaminaceae Impatiens balsamina L. Linaceae Linum usitatissimum L. Melianthaceae Melianthus major L. Myrsinaceae
Ardisia crenata Sims. Leguminosae - PaPilionatae
Goodia lotifolia Salisb. Pedaliaceae
Sesamum indicum L. Primulaceae
Cyclamen hybr.
Primula officinalis Jacq. Ranunculaceae
paeonia delavayi Franch. " officinalis L. Sapindaceae Cardiospermum halicacabun Sapotaceae Sideroxylon inerme L. Theophrastaceae
Jacquinia pungens A. Gray Tropaeolaceae
29
Hoofdstuk IV
ONTSTAAN EN VERDWIJNEN VAN AMYLOID IN HET ZAAD
FRANK (1866) nam waar, dat de uit amylot"d bestaande cel-wandverdikkingen in de zaadlobben van Tropaeolum majus ver-dwenen tijdens de kieming van het zaad; hierbij trad tijdelijk vor-ming van zetmeelkorrels op. Bij het rijpen der zaden zag hij, dat de amylot"d-houdende wandverdikkingen pas worden gevormd, wanneer de cellen hun definitieve vorm en grootte hebben bereikt. Het zetmeel, dat tijdens de rijping aanwezig is, verdwijnt gelei-delijk, naar alle waarschijnlijkheid ten behoeve van het amylot"d~
GODFRIN (1884) bestudeerde het verschijnen van amylot"d bij het rijpen en het verdwijnen van amylot"d tijdens de -kieming bij zaden van Schotia latifolia. Hij vond in onrijpe zaden zetmeel, dat gedurende het rijpen verdween; tegelijkertijd ontstonden de amylot"d-houdende celwandverdikkingen. Door deze waarneming kwam hij tot de overtuiging, dat het zetmeel wordt omgezet in amylot"d; dit gebeurt pas, wanneer de cellen van de zaadlobben hun definitieve grootte hebben bereikt en er geen celdelingspro-cessen meer plaats vinden.
Bij de kieming lost amylot"d op door "corrosie": van het in-wendige van de cel uit vormen zich kanaaltjes in de dikke wanden, die steeds verder doordringen tot de middenlamel. Wanneer het proces vergevorderd is, ziet men in een coupe door een zaadlob de celwand als kammetjes (met de tanden van de kam naar de bin-nenzijde van de cel gericht). Uit het amylot"d vormen zich zet-meelkorrels , die op hun beurt worden verbruikt ten behoeve van het jonge plantje. Wanneer tenslotte de zaadlobben gaan ver-schrompelen, is nog niet alle amylord verbruikt; het ontstane zet-meel is dan echter praktisch verdwenen.
HEINRICHER (1888) deed dergelijke waarnemingen aan de za-den van Impatiens balsamina. Ook hij vond, dat bij het r.i.iPender zaden de aanvankelijk dunne celwanden der zaadlobben snel wor-den verdikt, terwijl het aanwezige zetmeel geheel verdwijnt. De celwandverdikkingen vertonen dadelijk de amylot"d-reactie; hieruit besluit hij, dat amylot"d niet wordt gevormd door omzetting van cellulose, doch uit zetmeel.
Bij het kiemen worden ook bij Impatiens balsamina de cel-wandverdikkingen opgelost en ontstaat er zetmeel. Dit geschiedt ook in het donker, zodat het ontstane zetmeel geen assimilatie-zetmeel is.
HEINRICHER ziet amyloi"dvorming in zadenals een biologische aanpassing, waardoor de zaden zeer hard worden en daardoor
moeilijk te beschadigen zijn. Hij is van mening, dat amylo1"d van
Impatiens chemisch verwant is met amylo1"d, dat door SCHLEIDEN
is beschreven en daarmede misschien identiek is.
Bij de kieming van Tamarindus indica -zaden nam RIEDEL
(1897) dezelfde corrosieverschijnselen waar, als GODFRIN bij
Schotia latifolia vond. Volgens RIEDEL wordt amylol"d daarbij
omgezet in druivensuiker.
REISS (1889) voerde een dergelijk onderzoek uit met zaden van
Cyclamen, Impatiens en Tropaeolum. De corrosie-verschijnselen
waren bij hem enigszins anders: hij zag bij vergevorderde co' rro-sie delen van de amylotdlaag als eilandjes ge1"soleerd liggen; bij voortzetting van het kiemingsproces verdwenen ook deze tenslotte. Bij de rijping en bij de kieming van Tropaeolum majus -zaden
en bij de kieming van zaden van Tamarindus indica kon ik de
waarnemingen van FRANK resp. RIEDEL bevestigen:
Een gedialyseerd pers sap van kiemende zaden van Tropaeolum
zowel als van Tamarindus bleek de viscositeit van een oplossing
van amylotd (van Tropaeolum zowel als van Tamarindus ) snel te
verlagen. Aangetoond kon worden, dat na verloop van tijd de drie componenten van amylotd vrijkwamen; hierbij traden ook oligo-sacchariden op, die vermoedelijk als tussenproducten moeten worden opgevat.
Voor omzetting van zetmeel in amylol"d en voor het omge-keerde proces is zeker een hydrolyse tot de monomeren en ver-volgens, eventueel na omzettingen van monomeren (glucose in galactose en xylose, respectievelijk het omgekeerde proces), synthese uit de monomeren nodig. Immers, een keten met a 1, 4-glucosidische bindingen kan niet zonder voorafgaande volledige afbraak in een keten met ~ 1,4-glucosidische bindingen worden omgezet. '
Nu wij weten, dat kiemende, amylol"d-houdende zaden een en-zymsysteem bevatten, dat amylot"d tot de monomeren kan afbre-ken, is het niet moeilijk te begrijpen, hoe zetmeel kan worden ge-vormd uit amylol"d. Van het lot van de galactose en xylose, die bij de hydrolyse vrijkomen, is niets bekend; vermoedelijk worden deze suikers omgevormd. Dergelijke processen werden aange-toond door GINSBURG en HASSID (1956) bij kiemplanten van tarwe; met behulp van radioactieve suikers werd gevonden dat glucose onder meer in xylose (in hemicellulose) kan worden' o' m-gezet, echter niet door decarboxylering van het eerste C-atoom. Het .omgekeerde kan eveneens plaats vinden; zowel xylose als arabmose werden gemakkelijk omgezet in saccharose en in sui-kerfosfaten, waarbij de vorming van suikerfosfaten primair is die van saccharose secundair. Vermoedelijk is het mechanismJ hetzelfde als dat, gepostuleerd door GIBBS en HORECKER (1954) voor de vorming van hexosefosfaat uit ribosefosfaat door erwten-wortelpreparaten .
Het omgekeerde proces, de vormingvan amylol"d ligt evenzeer in het duister als de vorming van cellulose. '
Hoofdstuk V
BEREIDING EN ZUIVERING VAN AMYLOID 8AVUR en 8REENIVASAN (1948) geven het volgende voorschrift voor de bereiding en z,uivering van amylo1"duit Tamarindus indica-zaden:
200 g meel van Tamarindus -zaden worden met koud water tot een dunne pasta aangeroerd; deze pasta giet men langzaam in 5 liter kokend water en men houdt de massa gedurende 20 minuten aan de kook. Men filtreert en ontkleurt met 802. Dan verdunt men tot het zesvoudige volume, laat een nacht staan en centrifu-geert de vloeistof. Men dampt in vacuo tot een klein volume in en precipiteert het amylo1"d met een gelijk volume alkohol. Men scheidt het neerslag van de vloeistof met behulp van een coleer-doek, wast het neerslag met alkohol enige malen uit, wast vervol-gens met aether. Tenslotte droogt men het neerslag in vacuo bij kamertemperatuur.
Bovengenoemde schrijvers vermelden, dat men een beter pro-duct verkrijgt, wanneer men de zaadhuid tevoren verwijdert. De ontkleuring met 802 kan men dan laten vervallen. Behalve veel kleurstof bevat de zaadhuid een slijm, dat bij de amylofd-berei-ding uit ongepelde zaden filtratiemoeilijkheden veroorzaakt. .'
Het amylo1"d, dat men volgens dit laatste voorschrift bereidt, is echter ook nog onzuiver. De meergemelde auteurs hebben ver-scheidene pogingen gedaan om het te zuiveren: herhaaldelijk neer-slaan met alkohol, zwakke hydrolyse, toevoeging van eiwit-precipitantia (fosforwoHraamzuur, tannine, ammoniumsuHaat, natriumsuHaat), incubatie met papafne en met pepsine. Het beste bleek hun nog het sterk verdunde extract een nacht te laten staan en dan te centrifugeren. Men concentreert daarna in vacuo tot een klein volume om te besparen op de voor de precipitatie van
amy-lord benodigde alkohol. 8AVUR en 8REENIV ASAN vonden in hun op deze wijze bereide product 1.8-1.9% eiwit.
Bij mijn proeven heb ik het polysaccharide steeds na precipi-tatie met alkohol weer opgelost in water en het door toevoeging van Fehling' s proefvocht neergeslagen als koper-complex.
Het gehele door mij gevolgde voorschrift voor de berei(iiI),g en zuivering van amylo1"d uit Tamarindus -zaden luidt:
100 g gepelde, gemalen Tamarindus -zaden worden gedurende 30 minuten ge~xtraheerd met 10 liter kokend gedestilleerd water. De vloeistof wordt gefiltreerd (na toevoeging van diatome~enaarde) op een BUchner-trechter waarin op het filter een laag
diato-me~enaarde is aangebracht. Het achterblijvende -ne:erslag wordt
On-der roeren 6 liter 96%-ige alkohol toegevoegd. Men laat, onde,r af en toe roeren, enige uren staan; vervolgens laat men het gelei -:-achtige neerslag uitlekken op een coleerdoek. Wanneer .het groot-ste deel van de alkoholische vloeistof is uitgelekt, knijpt men uit de coleerdoek met inhoud nog zoveel mogelijk vloeistof. Het in de doek achtergebleven vezelige, nog zeer gezwollen neerslag wordt uitgewassen met 50%-ige alkohol, door het neerslag hierin enige uren te laten staan onder af en toe omroeren. Wanneer men op-nieuw door de coleerdoekzoveel mogelijk vloeistof heeft uitgekne-pen, houdt men een vezelig materiaal over, waarin niet veel vloeistof meer aanwezig. is. Deze massa wordt in vezels uit el-kander geplozen en in 10 liter water opgenomen. Door verwarmen en roeren lost het materiaal op. Wanneer alles volledig is opge-lost, wordt 200 mI Fehling's proefvocht, verdund tot 1.5 liter, toegevoegd onder intensief roeren. Tijdens de toevoeging neemt de viscositeit van de amylofd-oplossing sterk toe,. tot een taaie gel is gevormd, die spoedig synerese vertoont en dan tot brokken kan worden stukgeroerd. Om de gelei in kleine stukjes te verde-len is het goed om deze door een BUchner-trechter zonder filter te zuigen. Na enige uren staan hebben de gel-deeltjes hetgroo±.-ste deel van hun vloeistof losgelaten; de vloeistof wordt door een coleerdoek verwijderd. Ditmaal bereikt men met uitknijpen zeer weinig. Men suspendeert de uitgelekte gelei in gedestilleerd wa-ter, roert af en toe, en laat weer uitlekken op de coleerdoek. Dit uitwassen wordt enige malen herhaald, totdat de vloeistof onge-veer neutraal is. Vervolgens suspendeert men de blauwe gelei in 6 liter water waaraan 40 mI 2 n He 1 worden toegevoegd. De blauwe kleur der geldeeltjes verdwijnt snel bij roeren, en spoedig is alles geheel opgelost. (Het verdient in sommige gevallen aan-beveling in dit stadium een filtratie uit te voeren, omdat soms aanwezige onzuiverheden bij het aanzuren niet weer oplossen). De vloeistof wordt onder roeren behandeld met 4 liter alkohol. Men herhaalt de bekende bewerkingen met de coleerdoek, wast het uit-geknepen neerslag tweemaal uit met 50%-ige alkohol, daarna een-maal met 96%-ige alkohol. Men droogt vervolgens in vacuo in een exsiccator met silicagel. Men kan dan het vezelige materiaal tot een poeder malen. De opbrengst' is 40 - 45 g Tamarindus
-amy-lord. Het asgehalte van dit preparaat is 0.42%, het stikstofgehalte 0.088% ten opzichte van de droge stof.
Dit voorschrift werd praktisch ste.eds op kleinere schaal uit-gevoerd, omdat de grote volumina zo weinig handelbaar zijn. Voor andere zaadsoorten dan voor Tamarindus werd het
voor-schrift eveneens gebruikt, met dien verstande, dat kleine zaden ongepeld werden verwerkt. De soorten, welke weinig amylot'd be-vatten, werden· met relatief kleinere hoeveelheden water geextra-heerd.
Het bleek mij, dat een extract met gering amylot'd-gehalte een aanzienlijk grotere hoeveelheid alkohol ,behoefde om te precipite-ren dan een meer geconcentreerd extract. Hetzelfde geldt voor de
precipitatie met Fehling' s proefvocht. Het is in zulke gevallen het beste, te extraheren met· minder water, en, na de precipitatie met alkohol, het product in minder water op te nemen voor de precipitatie met . Fehling' s proefvocht.
Het gehalte aan amylot"d loopt bij de verschillende plantensoor-ten sterk uiteen. De amylot"d-houdende Caesql-pinióideae hebben in het algemeen zeer hoge gehaltes (rond 50% van de van hun zaadhuid ontdane zaden). Bij Tropaeolum en bij Cyclamen be-draagt de opbrengst omstreeks 10%, bij de meeste andere amy-lord-houdende soorten is het rendement slechts enige procenten of nog minder.
Hoofdstuk VI
DE BEPALING VAN AMYLOID
In de literatuur. is geen methode te vinden voor het bepalen van amylot'd in amyloltl-houdend materiaal. Het leek mij gewenst te trachten een eenvoudige methode hiervoor uit te werken.
Het meest voo:, de hand liggend is gebruikmaking van de blauw-kleuring van amylot'd met jood-joodkali. Een bezwaar hierbij is, dat de blauwe kleur bij kamertemperatuur slechts optreedt in ge-concentreerde amylot'd-oplossingen en bij minder geconcentreer
-de oplossingen pas, wanneer flink wordt gekoeld. De optredende kleur is in beide gevallen zo intensief, dat meting in een colori-meter bezwaarlijk is uit te voeren. Bij zodanige verdunning, dat men naar verwachting wél zou kunnen meten, treedt ook bij koe-ling geen kleuring op.
Het bleek echter, dat bij een aanzienlijke natriumsulfaat-toe-voeging de blauwe kleur wél bij kamertemperatuur optrad en dat bovendien reeds zeer verdunde amylot'd-oplossingen de kleurre-actie gaven, dit laatste in overeenstemming met het gedrag van zetmeel (PINNOW, 1902). De blauwkleuring blijkt te worden te-gengewerkt door haliden en daarom werd voor de bepaling van amylot'd niet het reagens van MITCHELL gebruikt, doch een jood-joodkali-oplossing, welke slechts weinig KJ bevat.
Na enige ori~nterende proeven werd het onderstaande voor-schrift voor de bepalin~ van Tamarindus -amylol"d opgesteld.
Reagentia.
1. Jood-joodkali-oplossing, bevattende 0.5 g J2 en 1 g KJ, met water opgelost tot 100 mI.
2. Natriumsulfaat-oplossing, bevattende 20 g N~S04 per 100 mI oplossing.
3. Standaard-amylol"d-oplossing, bevattende een nauwkeurig afge-wogen hoeveelheid van ongeveer 50 mg zuiver amylol"d per 100 mI oplossing.
Extractie van de zaden.
Wil men het amylol"d-gehalte van zaden bepalen, dan dient men het amylol"d eerst in oplossing te brengen. Voor
Tamarindus-amy-lord en voor de meeste amylol"d-soorten kan dit geschieden door herhaaldelijk uitkoken van de fijngemalen zaden met water. Beter gaat dit evenwel door bij kamertemperatuur te extraheren met verdunde natronloog. De volgende procedure voldoet voor Tama-rindus -amylol"d.
Aan 1 g gepelde, fijngem~.len zaden wordt onder roeren toege-voegd 150 mI water en na suspenderen 10 ml2 n NaOH, waarna men de suspensie onder af en toe roeren 24 uur bij 250 C laat staan. Na centrüugeren wordt het residu nog twee maal op deze wijze behandeld. De extracten worden samengevoegd en geneu-traliseerd met zwavelzuur (niet met zoutzuur, daar chloriden de kleuring met jood-joodkali ongunstig bethvloeden). Na filtreren over een laag diatomeêenaarde en uitwassen van de filter laag wordt het filtraat aangevuld tot 1000 mlo Voor de bepaling wordt hiervan 1 mI gebruikt. Voor de onderzochte Tamarindus-zaden werd op deze wijze een amylord-gehalte van 58.6% gevonden.
Toevoeging van een oplossing van een bekende hoeveelheid amylofd aan de extractie-vloeistof werd bij bepaling geheel terug-gevonden.
Wenst men het amylord-gehalte van zeer vetrijke zaden te be-palen, dan is het nodig het materiaal tevoren te ontvetten.
Uitvoering van de bepaling.
Aan 1 mI amylord-oplossing (bevattende tussen 0.05 en 0.30 mg amylol"d) wordt toegevoegd 0.5 mI jood-joodkali-oplossing en 5 mI natriumsulfaat-oplossing, waarna de oplossing wordt gemengd door omschudden. Na 60 minuten staan bij kamertemperatuur wordt de extinctie bepaald bij 640 mJJ ten opzichte van een blanco-oplossing, bevattende 1 mI water (in plaats van amylord-oplos-sing) benevens de reagentia.
~et een reeks verdunningen van de standaard-oplossing kan een standaard-curve worden bepaald, met behulp waarvan men de extinctie van de onbekende oplossing tot amylofd-gehalte kan her-leiden.
Opmerkingen.
1. De natriumsulfaat-oplossing is zo geconcentreerd, dat bij lage kamertemperaturen een deel van het zout kan uitkristalliseren· het verdient daarom aanbeveling deze oplossing in een ruimt~ van hogere temperatuur, bijv. een broedstoof van 250 C, te be-waren.
2. ~~t amy~C?rd voor de standaard-oplossing clientzo zuiver moge-lIJk te ZIJn; het werd, na op de gebruikelijke wijze te zijn be-reid, nogmaals via het kopercomplex gezuiverd. Vocht- as-en stik~tofgehalte werden bepaald en in rekening gebracht; na correctIe werd de resterende stof als zuiver amylord be-schouwd.
3. De extinctie van de oplossing is bij bewaring in daglicht niet onafhankelijk van de tijd; zij ontstaat niet momentaan en daalt na een maximum te hebben bereikt na enige uren aanzienlijk. Het is daarom nodig de tijd tussen het bereiden en het meten van de oplossing te standaardiseren. De tijdsduur van 60
