Sposoby indukowania mutacji a zmienność kwasów tłuszczowych jedno- i wielonienasyconych w nasionach rzepaku ozimego.

(1)

Stanisław Spasibionek

Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Oddział w Poznaniu

Sposoby indukowania mutacji a zmienność

kwasów tłuszczowych jedno- i wielonienasyconych

w nasionach rzepaku ozimego

The ways of mutation treatment and variability of mono- and

polyunsaturated fatty acid content in seeds of winter oilseed rape

Słowa kluczowe: rzepak ozimy, Brassica napus L., mutageneza chemiczna, skład kwasów

tłuszczo-wych, kwas oleinowy, kwas linolowy, kwas linolenowy

Znaczącą rolę w tworzeniu nowej zmienności kwasów tłuszczowych u roślin oleistych odgrywa indukowana mutageneza. Celem przeprowadzonych badań było znalezienie optymalnych warunków mutagenezy dla zwiększenia zmienności nienasyconych kwasów tłuszczowych u rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego.

Badano cztery sposoby indukowania mutagenezy stosując zróżnicowane stężenie mutagenu i czas traktowania mutagenem. Zastosowano niskie stężenia mutagenu 0,5% i 1% EMS, dłuższy czas ekspozycji 4 i 6 godz., dzięki czemu uzyskano istotne zmiany zawartości kwasów oleinowego, linolowego i linolenowego, natomiast rośliny pod względem budowy morfologicznej pozostały niezmienione. Zebrano populację 1476 roślin pokolenia M1, z których uzyskano nasiona pokolenia

M2. W pokoleniu M2 zawartość kwasu oleinowego wzrosła w porównaniu z rodem kontrolnym do

72,8%, a zawartość kwasu linolenowego obniżyła się do 5,4%. W pokoleniach M3 – M5

wyselekcjo-nowano genotypy o wyższej zawartości kwasu oleinowego (do 77,7%) jednocześnie o obniżonej zawartości kwasu linolenowego (do 4,7%).

Key words: winter oilseed rape, Brassica napus L., chemical mutagenesis, fatty acid composition, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid

Induced mutagenesis plays significant role in the development of new fatty acid variability in oilseed crops. The aim of experiments was to find optimal conditions to induce mutagenesis for the increase of variability of polyunsaturated fatty acids in winter rapeseed.

In vegetative season 1998/99, the seeds of double low winter oilseed rape strain PN 5282/98 with typical fatty acid composition in oil: 4.7% of palmitic acid, 1.5% of stearic acid, 67.1% of oleic acid, 16.8% of linoleic acid and 8.6% of linolenic acid were treated with ethyl methanesulphonate (EMS).

The application of high mutagen concentrations as well as multiple repetition of mutagenesis caused not only large changes in contents of 18 carbon acids in oil of seed, however it was the cause of unprofitable morphological deformations and reduced vitality of plants.

In order to develop new mutative changes in fatty acids composition, lower concentration of EMS (0.5% and 1%) was used and the time was lengthened of operation on the seeds in 1998.

In collected population of 1476 plants of M1 generation the seeds of M2 generation were obtained,

in which oleic acid content increased to 72.8%, and linolenic acid content decreased to 5.4%. In M3 –

(2)

Stanisław Spasibionek 36

to 4.7%. Beside obtained significant changes in fatty acids composition, the mild conditions of mutagen treatment did not cause morphological deformations, that hence the mutants kept good vigour.

Wstęp

Po wyeliminowaniu kwasu erukowego z oleju w nasionach rzepaku, niepożą-danego ze względu na jego złą wartość żywieniową i technologiczną, nastąpił wyraźny wzrost zawartości osiemnastowęglowych kwasów nienasyconych, a szcze-gólnie kwasu jednonienasyconego, oleinowego i kwasów wielonienasyconych, linolowego i linolenowego (Krzymański, Downey 1969; Krzymański 1970, 1984).

Uprawiane obecnie odmiany rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego dostar-czają oleju o bardzo wysokiej wartości biologiczno-żywieniowej z powodu obec-ności kwasów tłuszczowych o różnym stopniu nienasycenia, tj. kwasu oleinowego (60–65%), kwasu linolowego (18–22%), kwasu linolenowego (8–11%) i sumy kwasów nasyconych (około 7%).

Aktualnie dąży się do uzyskania naturalnie stabilnego oleju rzepakowego o wysokiej zawartości kwasu oleinowego (ponad 75%) i obniżonej zawartości kwasu linolenowego (poniżej 4%). Olej taki jest pożądany w przemyśle spożyw-czym dla celów smażalniczych (głębokie smażenie) oraz do produkcji kompo-nentów biopaliw (estrów metylowych kwasów tłuszczowych). Innym typem oleju pożądanym w przemyśle spożywczym jest olej sałatkowy o zwiększonej zawar-tości kwasu linolowego (do około 26%) i jednocześnie obniżonej zawarzawar-tości kwasu linolenowego (poniżej 4%). Ponadto obniżanie zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych może polepszyć walory dietetyczne oleju rzepakowego.

Aby sprostać tym wymogom prowadzone są intensywne prace badawcze i ho-dowlane wykorzystujące do tego celu mutagenezę. Mutageneza indukowana jest powszechnie znaną i stosowaną metodą hodowli roślin. Mutacje mogą indukować zarówno promieniowanie X, alfa, beta, gamma, jak również niektóre związki che-miczne. Do najbardziej rozpowszechnionych w użyciu i najbardziej skutecznych związków chemicznych o mutagennym działaniu należy zaliczyć środki alkilujące, takie jak metanosulfonian etylu (EMS), N-nitrozo-N-metylomocznik (NMU), azydek sodu (AS) (Rogalska i in. 1999).

Zainteresowanie mutagenezą w celu indukowania i selekcjonowania pożąda-nych zmian jakościowych u roślin oleistych odnotowano w końcu lat sześćdzie-siątych. W 1968 roku Rakow jako jeden z pierwszych badaczy rozpoczął prace nad zmianami proporcji kwasów tłuszczowych w oleju nasion rzepaku jarego wyko-rzystując mutagenezę indukowaną chemicznie. Jako mutagen stosował metano-sulfonian etylu uznawany przez takich badaczy jak Froese-Gertzen i in. (1963), Bell i Cervigni (1964), Thurling i Depittayanan (1992) za bardzo skuteczny w

(3)

wy-woływaniu zmian zarówno morfologicznych w roślinie, jak również chemicznych w nasionach.

Rakow (1973) traktując nasiona rzepaku jarego odmiany Oro roztworem metanosulfonianu etylu o stężeniach 0,2 i 0,5% wyselekcjonował mutanta M-57 o obniżonej do połowy zawartości kwasu linolenowego oraz mutanta M-364 o dwu-krotnie podwyższonej zawartości tego kwasu w stosunku do formy wyjściowej. Dalsze prace prowadzone przez Röbbelena i Nitscha (1975) doprowadziły do wyselekcjonowania kolejnych 4 mutantów: M-3, M-6, M-8 i M-11 o podwyższonej zawartości kwasu linolowego (do 37%) i obniżonej zawartości kwasu linolenowego (do 3,5%). Rücker i Röbbelen (1997) traktując nasiona odmiany Wotan 2% roztworem EMS uzyskali mutanty o podwyższonej zawartości kwasu oleinowego w zakresie od 75 do 80%, podczas gdy odmiana wyjściowa zawierała 60,3% kwasu oleinowego. Jednocześnie u tych mutantów obniżyła się zawartość kwasów wielo-nienasyconych. Raney i in. (2003) działając na nasiona linii DH rzepaku jarego 0,5 i 1% roztworem EMS otrzymali 21 zmutowanych roślin o obniżonej zawartości kwasów nasyconych (od 4,5 do 5,1%). Znaleziona przez Byczyńską i in. (1996) zmutowana linia 1207/94 została powtórne potraktowana 2, 5 i 8% roztworem metanosulfonianu etylu (Spasibionek 2005), co zaindukowało nowe mutacje, dzięki czemu wyselelekcjonowano dwa mutanty M-10453 i M-10464 o podwyższonej zawartości kwasu oleinowego (średnio do 76,6%) i obniżonej zawartości kwasów linolowego (do 8,7%) i linolenowego (do 7,2%) oraz mutanta M-681 o pod-wyższonej zawartości kwasu linolowego (27,5%) i obniżonej zawartości kwasu linolenowego (2,8%).

Niniejsza praca przedstawia poszukiwania optymalnych warunków stoso-wania mutagenezy chemicznej dla zwiększenia zmienności nienasyconych kwasów tłuszczowych u rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego.

Materiał i metoda

Do badań nad mutagenezą indukowaną chemicznie przeprowadzonych jesie-nią 1998 roku użyto rodu hodowlanego podwójnie ulepszonego rzepaku ozimego PN 5282/98, wytworzonego w Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych IHAR w Poznaniu. Ród ten plonował w doświadczeniach polowych w roku 1998 na poziome 119,3% wzorca, którym była odmiana Bor. Procentowa zawartość tłuszczu w nasionach wynosiła 49,8% s.m., a udział poszczególnych kwasów tłusz-czowych w oleju był typowy dla odmian podwójnie ulepszonych i wynosił: palmi-tynowego — 4,7%, stearynowego — 1,5%, oleinowego — 67,1%, linolowego — 16,8%, linolenowego — 8,6%. Ponadto ród ten charakteryzował się bardzo niską zawartością glukozynolanów, wynoszącą średnio 5,2 µM/g nasion. Do indukowa-nia zmian mutacyjnych użyto metanosulfoindukowa-nianu etylu.

(4)

Badano cztery różne sposoby indukowania mutagenezy, stosując zróżnico-wane stężenie mutagenu i czas traktowania mutagenem (tab. 1).

Nasiona rodu PN 5282/98 były moczone w wodzie destylowanej w tempera-turze pokojowej (20°C), w ciągu dwunastu godzin. Po zdekantowaniu wody i osączeniu nasion na bibule zalewano je 0,5 lub 1,0% roztworem EMS. Roztwory EMS przygotowano w buforze fosforanowym o pH = 7. Nasiona pozostawały w roztworze mutagenu w temperaturze 4°C przez 2 godziny i w temperaturze 23°C przez 4 lub 6 godzin. Po zdekantowaniu roztworu mutagenu, nasiona wymywano przez 16 godzin pod bieżącą wodą wodociągową.

Tabela 1 Warunki prowadzenia mutagenezy — Conditions of mutagenesis induction

Sposób działania Methods Wstępne moczenie nasion [temp./czas] Presoaking [temp./time] Stężenie mutagenu Mutagen concentration [% v/v] Ekspozycja [temp./czas] Exposition [temp./time] Czas wymywania mutagenu Time et washing out of mutagen 0 PN 5282/98 — ród wyjściowy — strain I dwustopniowa — two-stage₄o_{C/2 h; 23}o_{C/4 h} II 0,5 dwustopniowa — two-stage 4o_{C/2 h; 23}o_{C/6 h}

III dwustopniowa — two-stage₄o_{C/2 h; 23}o_{C/4 h}

IV 20o_{C/12 h} 1,0 dwustopniowa — two-stage 4o_{C/2 h; 23}o_{C/6 h} bieżąca woda 16 godz. tap water for 16 h

Poddawane mutagenezie nasiona oraz nasiona linii kontrolnej rozmnażano każdorazowo w szkółkach selekcyjnych.

W pierwszym etapie prowadzenia selekcji w sezonie wegetacyjnym 1998/99

zebrano 1476 roślin pokolenia M1. Rośliny pokolenia M1 omłócono indywidualnie

i rozmnażano w szkółce. Otrzymane nasiona pokolenia M2 poddano selekcji na

podstawie analiz składu kwasów tłuszczowych wykonanych metodą chromato-grafii gazowej (Byczyńska i Krzymański 1969) z zastosowaniem aparatu Agillent Technologies 6890N z kolumną kapilarną DB 2330 m, ID 025, grubość warstwy 0,25 µm, wyposażonego w integrator Chemstation.

Analizę statystyczną danych z przebiegu selekcji mutantów dla poszczegól-nych cech jakościowych wykonano korzystając z arkusza kalkulacyjnego Excel.

(5)

Wyniki

Otrzymane wyniki dla zawartości kwasów oleinowego, linolowego i linole-nowego umożliwiają ocenę zmian zawartości kwasów tłuszczowych w kolejnych pokoleniach roślin w zależności od zastosowanych warunków prowadzenia muta-genezy i selekcji (tab. 2). Uzyskane w badanych liniach zmiany zawartości kwasów tłuszczowych były porównywane w każdym roku prowadzonej selekcji ze składem kwasów tłuszczowych rodu kontrolnego PN 5282/98 w celu wyeli-minowania wpływu warunków środowiska na syntezę kwasów tłuszczowych. Na podstawie wyliczonych współczynników zmienności uzyskano potwierdzenie dużego wpływu warunków pogodowych na zawartość kwasu linolowego oraz na zawartość kwasu linolenowego, szczególnie w pierwszym, trzecim i czwartym roku badań (tab. 1).

Z zebranej populacji (1476 roślin) pokolenia M1 po rozmnożeniu w szkółce

uzyskano nasiona pokolenia M2, które po analizie składu kwasów tłuszczowych

wykazały istotne zmiany w zawartościach kwasu oleinowego, linolowego i lino-lenowego niezależnie od zastosowanych warunków indukowania mutagenezy. Największy wzrost zawartości kwasu oleinowego (do 72,8%) uzyskano w wyniku zastosowania pierwszej metody indukowania mutacji, w której nasiona rodu wyjś-ciowego PN 5282/98 traktowano 0,5% roztworem EMS przez 2 godziny w

tempe-raturze 4°C i 4 godziny w tempetempe-raturze 23°C. W pokoleniach M4 i M5

wyselekcjo-nowano linie o zawartości kwasu oleinowego odpowiednio do 77,6 i 77,7%. Zmiany te były istotne w stosunku do rodu wyjściowego PN 5282/98. Znaczny wzrost zawartości kwasu oleinowego uzyskano również wykorzystując czwartą metodę indukowania mutacji (tab. 2). Działając na nasiona rodu wyjściowego 1% roztworem EMS przez 2 godziny w temperaturze 4°C i 6 godzin w temperaturze

23°C uzyskano w pokoleniu M2 rośliny o podwyższonej zawartości kwasu

oleinowego (do 71,9%). W wyselekcjonowanych liniach pokolenia M4 zawartość

kwasu oleinowego wynosiła 76,3% i utrzymała się w pokoleniu M5 na poziomie

75,3%. Znacznie niższe zmiany w zawartości kwasu oleinowego odnotowano w przypadku zastosowania drugiej i trzeciej metody indukowania mutacji. W

wy-selekcjonowanym pokoleniu M5 uzyskano zawartość kwasu oleinowego

odpowied-nio 72,4 i 72,7%.

Kształtowanie się poziomu zawartości kwasu linolowego i linolenowego w poszczególnych metodach indukowania mutacji wiąże się z poziomem zawar-tości omówionego wcześniej kwasu oleinowego. Największe obniżenie zawarzawar-tości

kwasu linolowego do poziomu 9,4% w pokoleniu M5 uzyskano przy zastosowaniu

pierwszej metody indukowania mutacji, natomiast przy zastosowaniu czwartej metody osiągnięto największe obniżenie zawartości kwasu linolenowego do 3,9%

(6)

Tabel a 2 Zmiany zawarto ści kwas ów ol ei no we go , l inol owe go i l inol en ow ego w bada ny ch p opul ac jac h po m ut agenezi e w p or ów na ni u z m ateria łem wy jś ci owym — C ha ng es of ol ei c, l inol ei c an d l inol en ic aci d c ont en t i n i nvest ig at ed po pu la tio ns af te r mut age nesi s in comp arison with o rig in al ma teri al Kwas oleinow y Oleic acid C18:1 Kwas linolow y Linoleic acid C18 :2 Kwas linolenow y Linolenic acid C18:3 Metoda Method

Pokolenie/ rok bada

ń

Generation

/year

Liczba roślin No of plants

średnia mean min max. w sp. zm . CoV średnia mean mi n ma x w sp. zm . CoV średnia mean mi n ma x w sp. zm . CoV 1999 62 67,4 58,2 70,9 3,2 17,1 13, 4 23,1 11,0 8,1 6,4 10,4 10,0 2001 36 61,0 57,4 64,8 3,2 20,7 18, 1 24,1 6,7 10,0 8,5 11,3 6,7 2003 13 65,9 63,3 70,2 2,7 18,6 16, 4 20,8 6,8 7,7 5,6 8,7 13,9 Ma te ria ł wy jś ciow y Original material 2004 9 67,7 66,1 70,8 2,0 16,7 15, 2 18,4 6,5 8,1 6,5 8,8 9,0 M2 – 1999 369 66,1** 51,4 72,8 4,0 17,0 11,5 26,5 10,7 9,1** 6,6 15,0 10,0 M3 – 2001 82 64,0** 58,2 69,2 3,1 18,7** 13,9 23,1 8,5 9,2** 7,3 11,2 8,8 M4 – 2003 19 69,4** 64,8 77,6 4,8 16,2** 10,6 20,2 16,0 6,8* 4,0 8,4 17,5 I M5 – 2004 9 70,8* 66,5 77,7 6,0 14,2* 9,4 17,3 20,8 7,7 5,6 9,6 17,0 M2 – 1999 357 67,5 64,4 71,1 1,2 16,2** 14,0 19,1 3,5 8,6** 6,7 9,9 5,2 M3 – 2001 5 63,1 54,9 73,9 11,1 18,7 8,0 24,2 33,6 9,3** 8,7 10,0 5,7 M4 – 2003 3 69,3** 67,6 70,5 2,2 17,4 16,5 18,7 6,7 5,2** 4,8 5,7 8,6 II M5 – 2004 10 70,3** 67,9 72,4 1,7 15,1** 13,7 16,2 4,6 7,5* 6,9 8,5 7,4 M2 – 1999 375 67,2 54,2 71,8 3,2 16,6* 12,4 25,6 8,8 8,4** 6,3 11,7 8,9 M3 – 2001 259 61,7 53,9 67,3 4,3 20,4 15,7 25,8 9,2 9,6* 3,8 12,8 13,4 M4 – 2003 40 66,9 61,7 69,7 2,8 18,0 15,9 21,3 7,2 7,7 5,6 10,3 14,4 III M5 – 2004 7 70,1** 67,9 72,7 2,1 15,4* 13,2 16,6 7,7 7,4 6,3 8,7 11,7 M2 – 1999 375 67,1 55,2 71,9 3,0 16,6* 13,1 23,8 8,9 8,6** 5,4 13,1 12,0 M3 – 2001 412 62,9** 53,3 69,3 4,1 20,1 15,1 27,0 9,3 9,2** 7,0 12,4 9,4 M4 – 2003 111 69,1** 62,4 76,3 3,6 16,4** 10,4 21,7 12,1 6,9* 3,9 10,1 19,3 IV M5 – 2004 42 70,5** 65,3 75,3 3,2 14,8** 11,0 20,0 13,2 7,3** 4,7 8,7 12,0 * ró żnic e isto tne n a poz iom ie α ≤ 0,05 — significa nt at level α ≤ 0 .05 ** ró żnic e isto tne n a poz iom ie α ≤ 0,01 — significa nt at level α ≤ 0.0 1 Metoda op isana w tabeli 1 — Method of treatmen t as in Table 1

(7)

Duże zróżnicowanie zawartości badanych kwasów tłuszczowych potwierdzają współczynniki zmienności obliczone dla całej populacji badanych roślin pokoleń

M2 – M5 (tab. 3). Na ich podstawie można stwierdzić, że czwarty sposób

induko-wania mutacji powodował największe zmiany w zawartości badanych 18-węglo-wych kwasów tłuszczo18-węglo-wych. Uzyskana zmienność zawartości kwasu oleinowego była znacznie większa niż zmienność zawartości kwasów linolowego i linolenowego. Tabela 3

Wpływ sposobu indukowania mutacji na zmienność zawartości kwasów oleinowego (C18:1),

linolowego (C18:2) i linolenowego (C18:3) — Influence of methods of mutation treatment

on variabilty of oleic (C18:1), linoleic (C18:2), and linolenic acid (C18:3) content Współczynnik zmienności — Coefficient of variability [%] Metoda traktowania Method of treatment _C 18:1 C18:2 C18:3 Materiał wyjściowy Original material 4,3 10,8 10,9 I 4,3 11,9 11,5 II 2,8 8,5 7,8 III 5,3 13,2 13,2 IV 30,4 13,9 14,2

Rysunki 1–3 ilustrują efektywność poszczególnych sposobów indukowania mutacji. Przy zastosowaniu czwartej metody indukowania mutacji uzyskano naj-większą populację linii (8,3%) charakteryzujących się wysoką zawartością kwasu oleinowego (od 71 do 78%) oraz 17,1% linii charakteryzujących się obniżoną zawartością kwasu linolenowego (od 3 do 6% ) (rys. 1 i 2). Metoda ta wraz z metodą pierwszą były najbardziej efektywne pod względem największego udziału linii (odpowiednio 16,0 i 16,3%) o obniżonej zawartości kwasu linolowego (od 8 do 15%). Natomiast najwięcej linii (5,0%) z wysoką zawartością kwasu linolowego (od 23 do 27%) pozwoliła otrzymać metoda trzecia (rys. 3).

Metody porównano również wykorzystując do tego celu wyniki zawartości poszczególnych 18-węglowych kwasów tłuszczowych uzyskane w ciągu całego

okresu prowadzenia selekcji od pokolenia M2 do M5 (tab. 4). Różnice między

metodami są wysoce istotne (na poziomie istotności α = 0,01), jedynie metody pierwsza i czwarta dla zawartości kwasu oleinowego różnią się na poziomie istotności α = 0,05, co może świadczyć, że obie metody indukowały podobne zmiany wzrostu zawartości kwasu oleinowego. Metody trzecia i czwarta nie różnią się istotnie pod względem uzyskania zmienności zawartości kwasu linolowego.

(8)

Stanisław Spasibionek 42 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Udz ia ł pr oc en to wy z m ienion yc h li nii P e rc ent ag e of t he l ines c hanged

Kontrola Metoda I Metoda II Metoda III Metoda IV

Check Method I Method II Method III Method IV

0,5% EMS – 2 h/4 h 0,5% EMS – 2 h/6 h 1% EMS – 2 h/4 h 1% EMS – 2 h/6 h

51-70 71-78

Rys. 1. Udział procentowy linii o zmienionej zawartości kwasu oleinowego C18:1 w zależności od

zastosowanej metody — Percentage of lines with oleic acid C18:1 content changed depending on the

applied method 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Ud zi a ł pr oc en to wy z m ieni ony ch linii P e rc ent age of t he lines c hanged

8–15 16–22 23–27

Rys. 2. Udział procentowy linii o zmienionej zawartości kwasu linolowego C18:2 w zależności od

zastosowanej metody — Percentage of lines with linoleic acid C18:2 content changed depending on

(9)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Udz ia ł pr oc ent o w y z m ienion yc h linii P e rc e n tage o f t he line s c h ange d

3–6 7–15

Rys. 3. Udział procentowy linii o zmienionej zawartości kwasu linolenowego C18:3 w zależności

od zastosowanej metody — Percentage of lines with linolenic acid content changed depending on the

applied method

Tabela 4 Porównanie efektywności metod indukowania mutacji dla kwasów oleinowego, linolowego i linolenowego – wartości testu t Studenta — Comparison of methods efficacy for oleic, linoleic and linolenic acid – Value of Student’s t-test

Kwas oleinowy Oleic acid C18:1 Kwas linolowy Linoleic acid C18:2 Kwas linolenowy Linolenic acid C18:3 Metody Methods

II III IV II III IV II III IV I 10,369** 4,460** 1,831* 9,868** 7,022** 6,661** 8,176** 7,346** 2,812** II 15,760** 14,123** 18,414** 19,180** 7,346** 10,792**

III 2,993** 0,765 2,455**

* różnice istotne na poziomie α ≤ 0,05 — significant at level α ≤ 0.05 ** różnice istotne na poziomie α ≤ 0,01 — significant at level α ≤ 0.01

W każdym roku prowadzonej selekcji wykonywano obserwacje i opisy dotyczące deformacji morfologicznych roślin. Zastosowane stężenia mutagenu (0,5% i 1%) nie spowodowały żadnych zmian w morfologii, tak w stadium rozety, jak i w fazie kwitnienia roślin (rys. 5).

(10)

Dyskusja

W hodowli roślin indukowanie mutacji jest efektywnym sposobem wzboga-cania zmienności genetycznej (Micke i in. 1987). Wiele przykładów zastosowań udanych mutacji potwierdziło, że hodowla mutacyjna może być skutecznym i waż-nym narzędziem postępu hodowlanego, również w przypadku roślin oleistych (Röbbelen 1990, Velasco i in. 1999).

Najłatwiej wykrywa się mutacje dotyczące zmian fenotypowych roślin, ponie-waż częściej występują i można je zaobserwować już w fazie siewek, a zatem przebadać wiele osobników (Łuczkiewicz i Szewczyk 1997, Łuczkiewicz 1998). Równie powszechne są doniesienia o formach wczesnych i późnych, karłowych i półkarłowych mutantów (w stosunku do form wyjściowych) (Byczyńska i in. 1997, Sodkiewicz 1996, Łuczkiewicz i Błaszczyk 1998). Znacznie rzadziej spotyka się doniesienia na temat mutacyjnych zmian składu chemicznego nasion.

Wiele czynników decyduje o uzyskaniu mutanta o pożądanych cechach. Naj-ważniejsze z nich to: odpowiedni rodzaj i stężenie mutagenu, czas traktowania nasion mutagenem oraz czas jego wypłukiwania. W praktyce jest to zazwyczaj proces trudny i długotrwały (Auerbach 1976, Konzak 1984).

W Zakładzie Genetyki i Hodowli Roślin Oleistych Oddziału Poznańskiego Instytutu Hodowli i Aklimatyzacji Roślin pierwsze prace nad indukowaną mutage-nezą rozpoczęto w 1993 roku indukując mutację działaniem na nasiona rzepaku ozimego 0,5 i 1% roztworami metanosulfonianu etylu przez 2 godziny (Spasibionek i in. 1999). Dla osiągnięcia istotnie większych zmian, podobnych do tych, jakie uzyskali w swych pracach nad rzepakiem jarym Röbbelen i Nitsch (1975) oraz

Rakow i in. (1987), nasiona pokolenia M2 wyselekcjonowanej linii 1207 poddano

powtórnemu działaniu metanosulfonianem etylu o różnych stężeniach (2, 5 i 8%) przez 2 godziny. W efekcie znaleziono mutanty M-10453 i M-10464 o wysokiej zawartości kwasu oleinowego (odpowiednio 76,1 i 76,6%) przy jednoczesnym obniżeniu zawartości kwasu linolowego (8,7 i 8,8%) i kwasu linolenowego (7,2 i 7,4%), a także mutanta M-681 o wysokiej zawartości kwasu linolowego (27,5%) i znacznie obniżonej zawartości kwasu linolenowego (2,8%) (Spasibionek 2005). Większość roślin mutantów była półkarłowata i karłowata. Niektóre rośliny mutanta M-681 charakteryzowały się również deformacjami rozety oraz pędu głównego zakoń-czonego dużym skupiskiem kwiatów w zdeformowanym i skróconym kwiatostanie (rys. 4). Podobne zjawiska zmian morfologicznych roślin w swych pracach nad indukowaną mutagenezą chemiczną obserwowali Rakow (1973), James i Dooner (1990), Auld i in. (1992) oraz Schnurbusch i in. (2000). Aby uniknąć długoletnich prac selekcyjnych spowodowanych deformacjami morfologicznymi w 1998 roku zastosowano nowy, łagodniejszy sposób indukowania mutacji. Nasiona rodu wyjściowego PN 5282/98 poddano tylko jednokrotnemu działaniu roztworem EMS o stężeniach 0,5 i 1%, wydłużając natomiast czas jego ekspozycji o 2 i 4 godziny

(11)

Rys. 4. Deformacje morfologiczne roślin — wielokrotne traktowanie mutagenem o wysokich stężeniach

Morphological deformation of plants — multiple treatment by mutagen with high concentrations

Rys. 5. Rośliny bez deformacji morfologicznych — jednokrotne traktowanie mutagenem o niskich stężeniach — The plant withaut morphological deformations — single treatment by mutagen with low

concentrations

w stosunku do czasu zastosowanego w roku 1993. Pozostałe warunki mutagenezy, tj. wstępne moczenie nasion, przygotowanie mutagenu oraz czas wymywania mutagenu nie uległy zmianie.

Intensywne prace selekcyjne prowadzone na dużej populacji roślin (2475)

(12)

o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych bez deformacji morfologicznych (rys. 5). Dużym utrudnieniem w prowadzeniu selekcji jest modyfikujący wpływ środowiska na zawartość kwasów tłuszczowych. Aby ocenić wpływ warunków środowiska na zmiany w zawartości kwasów tłuszczowych, wykorzystano wielo-letnie obserwacje przeprowadzone na ustabilizowanym pod tym względem rodzie wyjściowym PN 5282/98. Uzyskano potwierdzenie wysoce istotnego wpływu warunków pogodowych na zawartość kwasów tłuszczowych, szczególnie kwasu linolowego i linolenowego w oleju (tab. 2). Zjawisko to należało brać pod uwagę przy prowadzonej selekcji mutantów. Jednak zmiany zawartości kwasów tłuszczo-wych, jakie wystąpiły w wyselekcjonowanych zmutowanych roślinach przekraczały znacznie wahania wywoływane wpływem środowiska. Wielu autorów, między innymi Rakow i McGregor (1973), Trémoliéres i in. (1982), Brunklaus-Jung i Röbbelen (1987) oraz Pleines i Friedt (1988) w swych pracach zwracali uwagę, że warunki pogodowe w trakcie wegetacji w dużej mierze decydują o przebiegu

desaturacji kwasów tłuszczowych C18 w nasionach, co jest dużą przeszkodą

w selekcjonowaniu zmienionych po mutagenezie linii. Według tych autorów i badań Bartkowiak-Brody i in. (1983) oraz Spasibionka i in. (1998) warunki te wpływają najbardziej na zawartość kwasu linolenowego i tłuszczu, natomiast w mn

posz

iejszym stopniu na zawartość kwasu oleinowego i linolowego.

Wraz ze wzrostem dojrzałości nasion zwiększa się zawartość tłuszczu w na-sionach oraz zmienia się skład kwasów tłuszczowych w oleju w nana-sionach (Bartkowiak-Broda i Krzymański 1981; Wiązeczka i Krzymański 1970). Autorzy dowiedli, że w procesie dojrzewania nasion rzepaku ozimego w pierwszej kolejności obniża się zawartość kwasu palmitynowego z 14,1 do 4,2%, stearynowego z 4,9 do 1,5%, linolowego z 42,8 do 21,0%, linolenowego z 15,6 do 10,5%, a w końcowym etapie następuje intensywne gromadzenie się kwasu oleinowego z 21 do 60%. Badania te pomogły w dużym stopniu prześledzić szlaki powstawania kolejnych kwasów tłuszczowych, co miało istotne znaczenie podczas prac selekcyjnych nad

ukiwaniem genotypów o zmienionych proporcjach kwasów 18-węglowych. Ohlrogge i in. (1979) na podstawie badań nad biosyntezą kwasu linolowego i linolenowego u rzepaku i rzepiku stwierdzili, że system desaturacji 18-węglowych kwasów tłuszczowych w nasionach większości gatunków kończy się na kwasie linolowym. Jedynie u roślin z rodziny krzyżowych, motylkowych i lnowych desaturacja przebiega do kwasu linolenowego. Synteza kwasu linolenowego zachodzi w wyniku dwustopniowej desaturacji, prowadzącej od kwasu oleinowego poprzez kwas linolowy do kwasu linolenowego. Reakcje te przebiegają z udziałem odpowiednich enzymów: desaturazy oleinowej i desaturazy linolowej (Cherif i in. 1975). Aktywność tych układów enzymatycznych decyduje o syntezie poszczegól-nych kwasów. Uzyskane istotne zmiany w zawartości poszczególposzczegól-nych kwasów tłuszczowych w oleju sugerują, że aktywność układów enzymatycznych, która decyduje o syntezie kwasów: oleinowego, linolowego i linolenowego w wyniku

(13)

mutacji uległa znacznemu uszkodzeniu. W otrzymanych zmutowanych liniach wyraźnie wzrosła zawartość kwasu oleinowego oraz jednocześnie obniżyła się zawartość kwasu linolowego i linolenowego, co może świadczyć, że mutacji uległy geny odpowiedzialne za aktywność desaturazy kwasu oleinowego.

Podsumowanie

•

morfologicznych roślin, co zazwyczaj •

leinowego i znacznie •

genu lub genów warun-kujących aktywność desaturazy kwasu oleinowego.

Literatura

W wyniku traktowania nasion rzepaku ozimego mutagenem chemicznym metanosulfonianem etylu (EMS) uzyskano znaczny wzrost zawartości kwasu oleinowego (do 77,7%), a obniżenie zawartości kwasu linolenowego (do 4,7%). Łagodniejsze warunki traktowania mutagenem pozwoliły na uzyskanie istot-nych zmian zawartości kwasów oleinowego, linowego i linolenowego, a jedno-cześnie nie powodowały deformacji

wiąże się z obniżeniem żywotności.

W wyniku traktowania nasion 1% roztworem EMS przez 2 godziny w tem-peraturze 4°C i 4 godziny w temtem-peraturze 23°C uzyskano największą popu-lację roślin o najbardziej pożądanym składzie 18-węglowych kwasów tłusz-czowych, tj. o istotnie podwyższonej zawartości kwasu o

obniżonej zawartości kwasu linolowego i linolenowego.

Uzyskane istotne zmiany w kierunku wysokiej zawartości kwasu oleinowego i obniżonej zawartości kwasu linolowego i linolenowego w oleju z nasion badanych linii rzepaku ozimego wskazuje na mutację

Aue . Mutation Research. Problems, results and perspectives. Chapman and Hall, Auld

els of polyunsaturated fatty acids and increased levels of oleic acid. Crop Sci., 32: Bell Treatment of seeds with ethyl methanesulphonate and diethylsulphate.

Bart rzepaku

Bart

er rape (Brassica napus L.). 6th International Rapeseed Conference, Paris, 1: 477-479.

rbach C. 1976 London: 504.

D.L., Heikkinen M.K., Erickson D.A., Sernyk J.L., Romero J.E. 1992. Rapeseed mutants with reduced lev

657-662.

M.L., Cervigni T. 1964. Nature, 204: 1198-1200.

kowiak-Broda I., Krzymański J. 1981. Zmiany w składzie chemicznym nasion ozimego bezerukowego K-2040 w czasie formowania i dojrzewania. Biuletyn IHAR, 146: 25-33.

kowiak-Broda I., Krzymański J. 1983. Inheritance of C-18 fatty amid composition in seed oil zeroerucic wint

(14)

Brunklaus-Jung E., Röbbelen G. 1987. Genetical and physiological investigations on mutants for polyenoic fatty acid in rapeseed (Brassica napus L.). Plant Breeding, 98: 9-16.

Byczyńska B., Krzymański J. 1969. Szybki sposób otrzymywania estrów metylowych kwasów tłusz-czowych do analizy metodą chromatografii gazowej. Tłuszcze Jadalne, XIII: 108-114.

Byczyńska B., Krzymański J., Spasibionek S. 1996. Zmniejszenie zawartości kwasów wieloniena-syconych w oleju rzepakowym w wyniku mutacji chemicznej / Decrease of polyunsaturated fatty acids content in rapeseed oil as a result of chemical mutagenesis. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XVII (1): 133-140.

Byczyńska B., Spasibionek S., Krzymański J. 1997. Karłowe mutanty rzepaku ozimego podwójnie ulepszonego o zmienionym składzie kwasów tłuszczowycj / Dwarf mutants of winter double low oilseed rape (Brassica napus) with changed fatty acid composition. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XVIII (1): 63-67.

Cherif A., Dubacq J.P., Mache R., Oursel A., Trémolieres A. 1975. Biosynthesis of α-linolenic acid by desaturation of oleic and linolenic acids in several organs of higher and lower plants and in algae. Phytochem., 14: 703-706.

Froese-Gertzen E.E., Konzak C.F., Foster R. 1963. Correlation between some chemical and biological reactions of ethyl methanesulphonate. Nature, 198: 447-448.

James D.W.Jr., Dooner H.R. 1990. Isolation of EMS-induced mutants in Arabidopsis altered in seed fatty acid composition. Theor. Appl. Genet., 80: 241-245

Konzak C.F. 1984. Role of induced mutations. In: P.B Vose & S.G. Blixt (Eds). Crop Breeding. Pergamon Press, Oxford.: 216-292.

Krzymański J., Downey K.R. 1969. Inheritance of fatty acid composition in winter forms of rapeseed

(Brassica napus). Can. J. Plant Sci., 49: 313-319.

Krzymański J. 1970. Genetyczne możliwości ulepszania składu chemicznego nasion rzepaku ozimego. Hodowla Roślin, Aklimatyzacja i Nasiennictwo, 14 (2): 95-133.

Krzymański J. 1984. Hodowlane możliwości ulepszania zawartości oleju i białka w nasionach rzepaku. Wyniki badań nad rzepakiem ozimym 1983. IHAR Radzików: 104-111.

Łuczkiewicz T., Szewczyk D. 1997. Zmienność wybranych cech roślin Camelina sativa L. w poko-leniach γ1-3 / Variability of some plant traits of Camelina sativa L. in γ1-3 generation. Rośliny

Oleiste – Oilseed Crops, XVIII (1): 83-90.

Łuczkiewicz T., Błaszczyk L. 1998. Karłowy mutant lnianki ozimej Camelina sativa L. / Dwarf mutant of Camelina sativa L. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops XIX (2): 615-620.

Łuczkiewicz T. 1998. Mutacja typu Virescens u rzepaku ozimego Brassica napus L. / Virescens type of mutation in winter rape Brassica napus L. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XIX (2): 620-625. Micke A., Donini B., Maluszynski M. 1987. Induced mutations for crop improvement – a review.

Trop. Agric. (Trinidad), 64: 259-278.

Ohlrogge J.B., Kuhn D.N., Stumpf P.K. 1979. Subcellular localization of acyl carrier protein in leaf protoplasts of Spinacia oleracea. Proc. Natl. Acad. Sci., 76: 1194.

Pleines S., Friedt W. 1988. Breeding for improved C18-fatty acid composition in rapeseed (Brassica

napus L.). Fat Sci. Technol., 90. Jahrgang, 5: 167-171.

Rakow G. 1973. Selektion auf Linol- und Linolensäuregehalt in Rapssamen nach mutagener Behandlung. Z. Pflanzenzüchtung, 69: 62-82.

Rakow G., McGregor D.I. 1973. Opportunities and problems in modification of levels of rapeseed C18

(15)

Rakow G., Stringam F.R., McGregor D.I. 1987. Breeding B. napus L. Canola with improved fatty acid composition, high oil content and high seed yield. Proc. of the 7th Int. Rapeseed Cong., vol. 1: 27-32.

Raney J.P., Olsen T.V., Rakow G. 2003. Reduction in saturated fat content of Brassica napus canola through interspecific crosses and mutagenesis. 11th Int. Rapeseed Congress, Copenhagen, Denmark, BO5.3: 190-192.

Rogalska S., Małuszyńska J., Olszewska M.J. 1999. Podstawy cytogenetyki roślin. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.

Röbbelen G., Nitsch A. 1975. Genetical and physiological investigations on mutants for polyenoic fatty acid in rapeseed Brassica napus L. Z. Pflanzenzüchtung, 75: 93-105.

Röbbelen G. 1990. Mutation breeding for quality improvement. A case of study for oilseed crops. Mutation Breeding Review, 6: 1-44.

Rücker B., Röbbelen G. 1997. Mutants of Brassica napus with altered seed lipid fatty acid composition. Proc. 12th Int. Symp. Plant Lipids, July 8-12, 1996, Toronto, Canada. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands: 316-318.

Schnurbusch T., Möllers C., Becker H.C. 2000. A mutant of Brassica napus with increased palmitic acid content. Plant Breeding, 119: 141-144.

Sodkiewicz T. 1996. Chemomutanty soi (Glycine max L. Merrill.) uzyskane z odmiany Warszawska / Chemomutants of soybean (Glycine max L. Merrill.) obtained from the cv. Warszawska. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XVII (2): 407-414.

Spasibionek S., Byczyńska B., Krzymański J. 1998. Wpływ środowiska na zmiany składu kwasów tłuszczowych w oleju mutanta 1207 rzepaku ozimego / Enviromment influence on fatty acid composition of winter oilseed rape mutant 1207 (Brassica napus). Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XIX (2): 627-632.

Spasibionek S., Byczyńska B., Krzymański J. 1999. Badania nad optymalizacją warunków muta-genezy chemicznej u rzepaku w celu otrzymania nowej zmienności nienasyconych kwasów tłuszczowych / Investigations on conditions of optymalization of chemical mutagenesis to obtain new variability of polyunsaturated fatty acid content in the oilseed rape. Rośliny Oleiste – Oilseed Crops, XX (2): 602-613.

SpasibionekS. 2005. New mutants of winter rapeseed (Brassica napus L.) with changed fatty acid composition. Plant Breeding (in press).

Thurling N., Depittayanan N. 1992. EMS induction of early flowering mutants in spring rape (Brassica napus). Plant Breeding, 108: 177-184.

Trémoliéres A., Dubacq J.P., Drapier D. 1982. Unsaturated fatty acid in maturing seeds of sunflower and rape: regulation by temperature and light intensity. Phytochem., 2: 41-45.

Velasco L., Perez-Vich B., Fernandez-Martinez J.M. 1999. The role of mutagenesis in the modification of the fatty acid profile of oilseed crops. J. Appl. Genet., 40 (3): 185-209.

Wiązecka K., Krzymański J. 1970. Zmiany w składzie chemicznym nasion rzepaku ozimego w czasie ich formowania i dojrzewania. Hodowla Roślin, Aklimatyzacja i Nasiennictwo, 14/3: 291-308.