Udział synaps elektrycznych w powstawaniu hipokampalnego rytmu theta w warunkach pozaustrojowych

Udział synaps elektrycznych w powstawaniu hipokampalnego

rytmu theta w warunkach pozaustrojowych*

Tomasz Kowalczyk, H enryk Gołębiewski, Jan K onopacki

K atedra N eurobiologii Uniwersytetu Łódzkiego

Streszczenie

Badano aktywność elektroencefalograficzną preparatów formacji

hipokam pa pobieranych od szczurów premedykow anych roztw orem blokera

synaps elektrycznych, karbenoksolonu (CARB, 100 mg/kg). W ykazano,

że dootrzew now e podanie CARB znosi przejściowo cholinergicznie

wywoływany rytm theta oraz skorelow aną z nim aktyw ność komórek piramidow ych pola CA3c formacji hipokam pa in vitro. O bserwowany efekt byl całkow icie odw racalny i zależał od czasu odroczenia procedury preparowania skrawków od dootrzewnow ej iniekcji karbenoksolonu.

Uzyskane wyniki wskazują, że synapsy elektryczne są istotnym elem entem zapew niającym poziom synchronizacji aktyw ności sieci neuronalnej

formacji hipokam pa, niezbędny do powstawania rytm u theta. Efekt

żablokow ania synaps elektrycznych ma charakter odwracalny.

Wstęp

Rytm theta jest w ysokoaniplitudow ą w o ln ofalow ą aktyw nością

elektroencefalograficzną (EEG) generowaną w strukturach układu limbicznego, w tym w formacji hipokam pa (HPC). Aktywność ta pow iązana je st z różnorodnymi wzorcam i behawioralnym i, procesam i uwagi i zapam iętyw ania a także integracją procesów czuciow o-ruchow ych [2, 3]. Rytm theta stanowi

najbardziej charakterystyczny przykład procesów oscylacyjnych

i synchronizacyjnych zachodzących w sieciach neuronalnych ośrodkowego układu nerwow ego. K oncepcje dotyczące generowania rytm u w formacji hipokampa za k ład a ją że potencjały polowe rejestrow ane zewnątrzkom órkowo, w postaci rytmicznej aktywności theta, pow stają w w yniku przestrzennego sum owania się synchronicznych potencjałów postsynaptycznych, generowanych w poszczególnych warstwach HPC. U podstaw procesów związanych

z sum owaniem się w czasie aktywności pojedynczych neuronów leży zdolność

kom unikowania się kom órek nerwowych pom iędzy sobą. Odkrycie

w początkach lat 30-tych chemicznego przekaźnictwa synaptycznego [17] zdom inowało na szereg lat kierunki badawcze dotyczące współdziałania komórek nerwowych. Jednakże badania Furshpana i Pottera z lat 50-tych wykazały, że poza chem icznym przekaźnictwem synaptycznym istnieje również szybkie przekaźnictw o przez tzw. „szlaki elektryczne” [7]. Następne lata przyniosły kolejne obserwacje dotyczące elektrycznego kom unikowania się kom órek nerwowych. Na początku lat 60. Robertson opisał strukturę m orfologiczną synaps elektrycznych, w ystępujących w kom órkach Mauthnera rdzenia kręgow ego złotej rybki [20]. Przełom owe w y dają się jed n ak badania Benetta, które wykazały obecność synaps elektrycznych w ośrodkowym układzie nerw owym wyższych kręgowców [1]. Synapsy elektryczne to błonowe struktury kanałow e określone jak o tzw. połączenia szczelinow e (ang. gap junctions, GJs). Biochem iczna identyfikacja białek tworzących heksagonalną strukturę głównego kanału połączenia szczelinowego (koneksonu) opisana została przez Kum ara i Gilula w roku 1986 [16]. Dzięki połączeniom szczelinowym istnieje możliwość natychm iastowego przem ieszczenia się prądu jonow ego pom iędzy komórkam i zgodnie z różnicą potencjałów [18]. Synapsy elektryczne mogą być zatem istotnym elem entem strukturalnym mechanizmów synchronizacyjnych i oscylacyjnych w sieciach neuronalnych OUN [4, 6, 8, 9,

19, 22, 23, 24, 25].

W roku 1987 opracowaliśm y model w yw oływ ania rytmu theta

w skrawkach formacji hipokam pa in vitro, perfundow anych sztucznym płynem m ózgowo-rdzeniow ym , zaw ierającym agonistę receptora cholinergicznego - karbachol [10, 12, 13, 14, 15]. Badania prow adzone w naszym laboratorium pozwoliły ustalić, że rejestrowana w warunkach pozaustrojow ych aktywność oscylacyjna odtw arza w iększość cech rytmu theta w ystępującego in vivo [10]. Częstotliw ość oraz am plituda rytmu theta rejestrowanego zarów no in vitro, jak i in vivo po siadają bardzo podobne zakresy, a oba wzorce aktywności elektroencefalograficznej po jaw iają się w kilkusekundow ych epizodach. Oba wzorce EEG po siadają podobne podłoże neurotransm isyjne w yrażające się

dynam icznym współdziałaniem pom iędzy układem cholinergicznym

i GA BAergicznym . Co więcej, rozwój ontogenetyczny w obu przypadkach

przebiega podobnie i, co szczególnie ważne, wzorce aktywności

wew nątrzkom órkowej związanej z rytmem theta zarów no in vivo jak i in vitro są zbliżone [10].

W prowadzonych przez nas badaniach in vitro zajm ow aliśm y się również problem em bezpośredniego udziału połączeń szczelinow ych w powstawaniu hipokam palnego rytmu theta. Stosując dwa blokery połączeń szczelinowych, chininę i karbenoksolon (CARB), wykazaliśm y, że synapsy elektryczne biorą

udział w powstaw aniu rytmu theta wywoływanego in vitro stałym , tonicznym pobudzeniem cholinergicznym : wywołany lytm był nieodw racalnie znoszony przez oba użyte blokery [13].

W obecnych doświadczeniach badaliśmy zdolność generow ania rytmu

theta w skraw kach pobranych od szczurów poddaw anych wcześniej

dootrzewnow ym iniekcjom karbenoksolonu. Stosując taki układ dośw iadczalny chcieliśm y uzyskać odpow iedź na pytanie, czy efekt zniesienia rytm u theta w skrawkach HPC po zablokowaniu synaps elektrycznych struktury jest odwracalny.

Materiał i metody

D ośw iadczenia przeprowadzono na 164 preparatach form acji hipokam pa pobranych od 24 szczurów. Zw ierzęta poddaw ano dootrzewnow ej iniekcji karbenoksolonu (100 mg/kg) 1, 2, 3, 4, 6, 8 oraz 12 godzin przed rozpoczęciem

preparowania skrawków HPC (Ryc. 1.). N astępnie zw ierzęta były

anestetyzowane eterem, dekapitowane, a z mózgów preparowane były skrawki formacji hipokam pa (- 5 0 0 ц т ) . Skrawki preinkubowano w sztucznym płynie mózgowo rdzeniowym w tem peraturze pokojowej przez 60 min. a następnie um ieszczano w interfazow ym basenie inkubacyjnym , w którym kontrolowana była tem peratura (35°C), szybkość przepływu (1.5 m l/m in.) oraz stopień natlenow ania płynu perfundującego. Aktywność EEG wywoływ ana była perfuzją preparatów roztworem karbacholu (50 (Д.М) w sztucznym płynie m ózgowo-rdzeniow ym . Sygnał EEG rejestrowany był z obszaru CA3c formacji hipokam pa przy użyciu elektrod szklanych o oporności 5 - 8 M Q. Podczas rejestracji aktyw ności EEG ta sama elektroda wykorzystyw ana była do rejestracji aktywności pojedynczych neuronów techniką zewnątrzkom órkową. Sygnał aktywności polowej (EEG) oraz aktywności pojedynczych neuronów rozdzielano za pom ocą wejść wysokoopornościowych. Dla uzyskania zapisu

aktywności polowej rejestrowany sygnał EEG filtrow ano (1-30 Hz)

i wzm acniano (xlOOO) (Grass - Astrom ed P511). W celu zarejestrow ania aktyw ności pojedynczych neuronów sygnał filtrow ano (0.3-3 Hz) i wzm acniano (x 10000) (Grass - Astrom ed P 5 1 1). Zapis aktywności elektroencefalograficznej oraz pojedynczych neuronów dokonywany był na taśm ie VHS (rejestrato r FM Sony 420M - Vetter), przy ciągłym m onitorowaniu wzrokowym na oscyloskopie cyfrow ym (Tektroniks TDS 3014) oraz audiom onitorze (Grass AM-8). A rchiw izacja danych oraz analiza off-line dokonana została przy pomocy programu Spike 2-4.22 (Cam bridge Electronic D esign Ltd.).

Wyniki

W obecnych badaniach rejestrowaliśm y aktywność EEG preparatów

formacji hipokam pa pobieranych od szczurów premedykow anych

karbenoksolonem , blokerem synaps elektrycznych (100 mg/kg). Preparaty formacji hipokam pa pobierane od premedykowanych zwierząt, perfundow ane roztworem agonisty cholinergicznego karbacholu generow ały dwa rodzaje

zsynchronizow anej aktywności elektroencefalograficznej: aktywność

epileptyczną lub rytm theta. Poza połow ą aktyw nością EEG, w przedstawionej pracy rejestrow ano rów nież aktywność pojedynczych neuronów . Rycina 2 przedstaw ia wzorce aktyw ności pojedynczych komórek nerw ow ych pola CA3c

formacji hipokam pa w ystępujące jednocześnie z aktyw no ścią połową,

rejestrow aną w obecnych dośw iadczeniach.

y^VyWyv/ t4VV > < I

•-^Vrri

R yc. 2. W ptyw d ootrze w n ow yc h iniekcji ka rb enok solo nu na w yw o ły w an ą c ho lin erg ic znie aktyw ność E E G in vitro. R y cin a p rzeds taw ia przykła dow e zapisy a ktyw no ści polow ej (górny panel) o ra z a ktyw n ości p ojed ync zy ch n eu ronó w (dolny panel) d oko ny w an e przy cza sie o droc zen ia p roc edu ry p re pa ro w a nia w yn oszącym od pow ie dnio: 1 h (A), 4 h (B ) o ra z 8 h (C). S zczegóły w tekś cie. K alibracja 0. Is ek ., 5 00 (J.V.

Wpływ dootrzewnow ych iniekcji karbenoksolonu na zdolność skrawków

formacji hipokam pa do generowania synchronicznych w zorców EEG

w zależności od czasu odroczenia pomiędzy iniekcją CARB a preparow aniem

skrawków przedstawiony został na rycinie 3. Dootrzew nowa iniekcja

karbenoksolonu pow odow ała zanik zdolności generow ania rytmu theta w preparatach HPC. Efekt ten był w pełni odw racalny. Iniekcja CARB dokonywana 1 - 3 godziny przed preparowaniem skrawków, w dużym stopniu zm niejszała praw dopodobieństwo pojawienia się rytmu theta w preparatach poddanych następnie pobudzeniu cholinergicznem u (nie więcej niż 21% preparatów generowało rytm theta). W iększość preparatów nie generowała żadnej aktyw ności zsynchronizow anej (cisza EEG) lub w ystępow ała jed ynie nieregularna aktyw ność epileptyczna (Ryc. 3.). W raz z w ydłużaniem czasu odroczenia pomiędzy iniekcją CARB a preparowaniem skraw ków w zrastało praw dopodobieństw o zarejestrow ania rytmu theta. G dy okres odroczenia procedury preparow ania wynosił 6 - 8 godzin, rytm theta rejestrow any był w 50 - 62 % preparatów . C ałkow ity powrót zdolności skrawków hipokam palnych do generowania rytm u theta (ok. 78% badanych preparatów ) zaobserw ow ano gdy czas odroczenia procedury preparow ania wynosił 12 godzin (Ryc. 2.).

CZAS POMIĘDZY INJEKCJĄ CARB A PREPAROWANIEM SKRAWKÓW

CISZA WYŁADOWANIA RYTM EEG EPILEPTYCZNE THETA

R y c. 3. W pływ do otrzew no w yc h iniekcji karben okso lon u na w yw o ły w an ą ch oline rg icz nie aktyw noś ć E EG in vitro. W y kres przedstaw ia praw do pod obieńs tw o w y w o łan ia rytm u th e ta lub aktyw nośc i ep ilepty czne j w yrażon e lic z b ą prepara tów w procentach.

Dyskusja

W obecnych doświadczeniach badaliśm y aktyw ność EEG preparatów

formacji hipokam pa pobranych od szczurów poddaw anych wcześniej

dootrzew nowym iniekcjom karbenoksolonu, blokera synaps elektrycznych. W ykazaliśm y, że CARB znosi przejściow o cholinergicznie w yw oływ any rytm theta oraz skorelow aną z nim aktyw ność kom órek piram idow ych pola CA3c, głównego w ew nątrzhipokam palnego generatora rytmu [12, 15]. Efekt ten był całkow icie odw racalny i zależał od czasu odroczenia procedury preparow ania skrawków od dootrzewnowej iniekcji karbenoksolonu.

Badania prowadzone od końca lat 80. ubiegłego wieku wskazywały na istotną rolę synaps elektrycznych w pow stawaniu synchronicznej aktywności EEG w ośrodkowym układzie nerwowym. W badaniach tych wykazano, że połączenia szczelinow e biorą udział w powstawaniu aktywności epileptycznej [4, 8, 9, 19, 22, 24] rytmu gamm a [23] i tzw. szybkich oscylacji, 150-200 Hz [6, 25]. Co ciekawe, istnieje niewiele danych dośw iadczalnych dotyczących udziału przew odnictw a elektrycznego w powstawaniu rytm u theta. M oże być to

związane z faktem , że podaw anie blokerów połączeń szczelinowych

w warunkach in vivo (anastetyzowanym czy sw obodnie poruszającym się szczurom ), może wywoływać szereg niespecyficznych zaburzeń fizjologicznych a przy zastosow aniu wysokich dawek, efekt letalny jest wielce prawdopodobny [5,21].

Pierwsze dane sugerujące m ożliwość uczestnictw a połączeń

szczelinowych w generowaniu rymu theta w warunkach in vivo opublikowane zostały przez Konopackiego i wsp. w roku 2003. Autorzy ci, analizując korelację aktywności pojedynczych neuronów formacji hipokam pa z rytmem theta, wprow adzali do badanego neuronu barwnik, neurobiotynę. Interesujący był fakt, że w 25% wszystkich barwień neuronów, których aktyw ność związana była z rejestrow anym połowo rytmem theta, barw nik dyfundowal do kilku neuronów (wybarwieniu ulegała więcej niż jed na kom órka) [11]. O bserw acja ta

sugerow ała pośrednio, że istniejące połączenia szczelinow e pom iędzy

neuronam i formacji hipokam pa m ogą być istotnym elem entem strukturalnym ,

zapewniającym stopień synchronizacji aktywności ełektrofizjologicznej

neuronów , niezbędny dla pow stawania rytm u theta in vivo.

Wyniki uzyskane w obecnej pracy (zniesienie rytm u theta in vitro po podaniu CA RB) są zgodne z naszymi wcześniejszym i badaniami [13]. W doświadczeniach tych wykazaliśmy, że synapsy elektryczne zlokalizow ane

w obszarze kom órek piramidowych С A3 hipokam pa b iorą udział

w pow staw aniu rytm u theta w ywoływanego in vitro stałym , fonicznym pobudzeniem cholinergicznym . Perfuzja preparatów form acji hipokampa roztworami blokerów połączeń szczelinowych, karbenoksolonu lub chininy

znosiła rytm theta. Efekt ten był jednak nieodwracalny [13]. W cześniejsze dośw iadczenia Rosa i wsp. [22] przeprowadzone in vitro wykazały, że karbenoksolon nieodw racalnie obniża częstotliwość wyładow ań epileptycznych. Autorzy ci wiązali ten efekt z uszkadzającym działaniem karbenoksolonu na

tkankę nerwową. Nasze obecne badania przeprowadzone były na

niestosowanym wcześniej modelu doświadczalnym . To nie preparaty formacji hipokam pa poddawano działaniu CARB, a szczury od których pobierano następnie skrawki formacji hipokam pa poddawano dootrzewnowej iniekcji karbenoksolonu. Przeprowadzone badania wskazują, że blokujące działanie karbenoksolonu na zdolność do generowania rytmu theta przez preparaty formacji hipokam pa może być w pełni odwracalne. Powrót zdolności do generowania rytmu theta do wartości kontrolnych zaobserw ow aliśm y, gdy czas odroczenia pom iędzy dootrzewnowym podaniem CARB a preparowaniem skrawków w ynosił 12 godzin. Brak powrotu rytmu theta w poprzednich badaniach in vitro [13] wynikał praw dopodobnie ze zbyt krótkiego czasu

wypłukiw ania karbenoksolonu z tanki mózgowej. Na tej podstawie

przypuszczam y, że efekt działania CARB ogranicza się do wpływu na m echanizmy synchronizacji a nie wynika z trwałego uszkodzenia tkanki nerwowej.

Piśmiennictwo

1. B enett M .V.L . (19 63) E lectronic ju n ction s betw een te leo st spinal neurones: e le ctro phy sio lo gy and u ltrastructu re. Scie nce 141: 26 2-264.

2. B land B.H. (198 6) T he ph ysiology and pha rm acology o f h ippo cam pal theta rhythm s. Prog.

N eurob iol. 26: 1-54.

3. B land B .H., O ddie S.D. (2 001) T heta ba nd o scillation and sy nch ron y in the hippo ca m pal form atio n an d as so ciate d struc tures: the case for its role in s en so rim o to r integration. Behav.

B rain Res. 127: 119-136.

4. C a rlen P.L., S k inn e r F., Z han g L., N aus C ., K o shn ir M ., V ela sq ue z J.L .P. (2 000 ) T he role o f gap ju n ctio n s in seizures. B r ain Res. Rev. 32: 235 -241.

5. C asc io W .E ., Y ang H., M uller-B o rer B.J., John son T .A . (2 005 ) Is chem ia-indu ced arrhythm ia: the role o f c onn exins , gap jun ctio ns , an d a tte n da n t ch ang es in im pulse p rop aga tion . J. E lectroca rdio l. 38: 55-59.

6. D ra guhn A., T ra ub R .D., S hm itz D., Jefferys G.R. (1 998) E lectrical c ou plin g un d erlies high- frequen cy osc illa tio n s in the hip poca m pu s in vitro. N ature 394: 189-192.

7. Furshp an E.J., Potter D.D. (19 59) T rans m iss ion at the gian t m oto r syna pses o f the crayfish.

J. P hysiol. 145: 289 -325 .

8. Jahrom i S.S., W en tlan d K., Piran S., C arlen P L. (20 02) A n tic on vu ls an t a ctio ns o t gap ju n ctio na l b lock ers in an in v itro se izure m odel. J. N e urop hys iol. 88: 1893-1902.

9. K atsum aru H., K os aka T ., H e izm ann C .W ., H am a K. (1 988) G a p jun c tio n on G A B A ergic n eu ron s c o nta inin g the c alcium -b inding protein p arvalbum in in the rat h ipp oca m pu s (CA1 region). Exp. B rain Res. 72: 363-3 70.

10. K onopacki J. (1 998 ) T h eta -like activity in the lim bic cortex in vitro. N eurosc i. B iobehav.

Rev. 2 2 :3 1 1 -3 2 3 .

U . K onopa cki J., B land B.H., D yck R. (2003) Intrac ellula r re co rding and lab elin g o f ne uro ns in m idlin e struc tu res o f the rat brain in vivo using sharp electrode s. J. N eurosci. M eth. 127: 85- 93.

12. K onopa cki J., B land B .H., Roth S.H . (1988) C arba ch o l-ind uc ed “the ta ” in hippocam pal form ation slices: ev ide nc e for a third ge nerato r in C A 3c area. B ra in Res. 451: 33-42. 13. K ono pack i J., K ow alczy k T ., G ołębiews ki H. (2004 ) E lectrical co up ling und erlies theta

osc illa tio ns reco rded in hipp ocam pal form ation slices. B rain Res. 1019: 270 -274 .

14. K ow alcz yk T ., G ołę biew s ki H ., E ck e rs do rf В., K onopa cki J. (20 01 ) W ind ow effect o f tem p era ture on c arba ch ol-ind uc ed th eta-lik e activity re corde d in h ippo cam p al form ation in vitro. B ra in Res. 901: 184-194.

15. K ow alczyk T ., K onopack i J. (200 2) D epth am plitude and ph ase profile s o f carba chol- in duce d th eta in h ippo ca m p al form ation slices. B rain Res. Bull. 58(6): 569-5 74.

16. K um ar N.M ., G ilu la N.B. (198 6) C lon ing and cha racterisa tion o f hum an and rat liv er cD N A s e nco d in g for a gap ju n c tio n protein. J. C ell B io l. 103: 767-776 .

17. L oewi O. (1 933 ) P rob lem s co n nec ted with the prin ciple o f hum o ral trans m issio n o f nerrvous im pulses. Proc. R. Soc. Ser. В 118: 299-31 6.

18. M a cV ica r B.A., D u de k F.E . (19 81) E lec tronic c ou pling be tw een pyram idal cells: A direct d em on stratio n in ra t hippocam pal slices. Scien ce 213: 782-7 85.

19. P erez-V a la sq uez J.L ., V a liante T .A., C arle n P L. (199 4) M o du lation o f gap ju n c tio n m echanis m s d uring ca lciu m -free induce d field bu rs t activity: A p o ss ib le ro le to r ele ctro nic co u pling e pile ptoge ne sis. J. N eurosc i. 14: 4308-4317 .

20. R obe rtson J.D. (1 963 ) T h e o cc urren ce o f the sub unit pattern in the un it m em brane o f club en ding s in the M au th ne r cell syna pses in gold fish brain s. J. C ell Biol. 19: 201 -22 1.

21. R o drigu ez -Sino va s A., G arcia -D o rad o D., R u iz-M ean a M ., S oler-S ole r J. (2 004 ) E nhanc ed effe ct o f ga p ju n c tio n un co u ple rs on m acrosc opic electrical p ro pe rtie s o f rep erfuse d m yocardium . J. P hysiol. 15;559: 245-257 .

22. R oss F.M , G wyn P., Span sw ic k D„ Davies S.N. (200 0) C arbe no xo lo ne dep ress es sp on ta neo u s ep ile ptifo rm activity in the CA1 re gion o f rat h ippo cam p al slices. N e uros cie nce 100: 789 -79 6.

23. T rau b R .D., B ibbing A., Fisahn A., L eB eau F.E .N .. W hittin gto n M. B uhl A .E .H. (2000) A m odel o f gam m a frequenc y netw o rk oscilla tion s induce d in the rat CA 3 regio n by carbacho l in vitro. Europ. J. N eu rosc i. 12: 409 3-410 6.

24. T rau b R.D., D ragu hn A., W hittin gton M.A., Baldew eg T., B ib bing A., Buhl E .H ., Sch m itz D. (2 002 ) A xonal gap ju n c tio n s betw een principal neurons: A novel sourc e o f netw ork o sc illations , and pe rha p s ep ileptog enesis . Rev. N eurosci. 13: 1-30.

25. T rau b R .D., W hittin g ton M .A., Buhl E .H., L eB eau F.E .N ., B ib bing A.. B oyd S., C ro ss H.. B aldew e g T. (2 001 ) A po ssible role for gap ju n ctib n in ge nera tion o f very fast EE G os cilla tion s p rec edin g th e o n se t of, an d perhaps initiatin g, seizures, E p ile ps ia 42: 153-170.

A d res do kore spondenc ji: T o m a s z K o w a lc z y k K atedra N eu rob iolo gii U n iw ersytetu Ł ód zkieg o Ul. R ew olucji 1905 r. n r 66 90 -22 2 Ł ódź T el. (48 42 ) 66 55 681 e-m ail: tok ow a l@ b io l.u ni.lo dz .p l